技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及猪瘟病毒兔化弱毒疫苗C株感染性cDNA载体的构建及病毒的拯救。通过该技术体系的建立，可在分子水平对疫苗C株基因组进行改造，以便于对病毒复制、致病机理以及新型标记疫苗开发等方面进行深入研究。
背景技术
猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员之一。CSFV的基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，含有一个大的开放阅读框(ORF)，ORF两侧各有一个非编码区(UTR)，且5′-端无帽子结构，3′-端无polyA尾。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由这个大的ORF编码，翻译成一个含3898个氨基酸的多聚前体蛋白，这一大前体蛋白在细胞蛋白酶和病毒特异的蛋白酶作用下加工成12种成熟病毒蛋白。其中4个为结构蛋白，8个为非结构蛋白。
近年来，动物致病性RNA病毒，如猪瘟病毒、流感病毒和口蹄疫病毒等引起的传染病在世界各地暴发，给畜牧业的发展造成巨大损失。而新的病毒性传染病(如SARS等)不断出现，威胁着人类健康。在此背景下，在分子病毒学研究领域兴起了一门新技术，即RNA病毒的感染性cDNA技术。该技术可在DNA水平进行操作，以此来研究RNA病毒的复制与表达调控、病毒与宿主间的相互作用、抗病毒策略、基因治疗研究、改造传统疫苗以及构建新型病毒载体来表达外源基因等。
建立RNA病毒感染性cDNA技术体系主要包括基因组全长cDNA的构建，感染性RNA的产生，子代病毒的鉴定与应用等内容。在CSFV感染性cDNA的研究中，Moormann等在1996年第一次用猪瘟疫苗C株的全长cDNA为模板，将体外转录的基因组RNA转染猪肾细胞后，拯救了具有感染性的子代病毒。同年，Ruggli等和Meyers等分别用CSFV Alfort-187和Alfort的全长cDNA为模板，获得了子代病毒。随后，又有不同强弱毒株的感染性cDNA被成功构建。我国CSFV感染性cDNA技术起步较晚，目前虽然对构建弱毒C株和强毒石门株的感染性cDNA已有报道，但是可能由于全长cDNA的不稳定性，对这些感染性cDNA的深入研究很少见到报道。本研究旨在构建兔化弱毒疫苗C株的感染性cDNA，获得能够稳定携带分子标记的感染性子代病毒。为改造传统疫苗，开发新型标记疫苗奠定基础。
发明内容
本发明的主要内容包括：
提供一种携带分子标记的猪瘟病毒感染性cDNA载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)用生理盐水稀释猪瘟活疫苗至1头份/ml作为实验材料，抽提总RNA后，根据设计的6对引物(见下表)，RT-PCR分段扩增相应的6个cDNA片段(图2)。
(2)cDNA片段F1和F5中相应分子标记的引入
用引物F1-Xho-MU：GAAGCCCACCTCGATATGCTACGTGGACG和F1-Xho-ML：CGTCCACGTAGCATATCGAGGTGGGCTTC对F1片段221位进行定点突变，这一突变敲除基因组中原有的XhoI限制性酶切位点；而F5片段中NcoI分子标记用F5-upper引物通过PCR直接引入。
(3)全长cDNA克隆所需质粒的改造
以质粒pBR322为模板进行改造，获得用于克隆CSFV基因组3′-半长的质粒pB-CN，具体步骤如下：应用引物pGEM-U：GGGAAGCTTGGATCCTATAGGGCGAATTGG和pGEM-L：CCGCCCGGGCAAGCTATTTAGGTGACAC扩增含有质粒pGEM-5ZF(+)多克隆位点的171bp片段，并在该片段的前后分别引入酶切位点HindIII和AvaI；由于pBR322质粒中编码卡那抗性片段的前后也含有相应的这两个酶，所以应用这两个酶可将该片段切下，并将171bp的片段克隆于相应位置，获得中拷贝质粒pB-CN；
以低拷贝质粒pACYC-177为模板进行改造，获得用于克隆CSFV基因组5′-半长和基因组全长的质粒pA-CN，具体步骤如下：应用引物pA-U：GCGGACTAGTACGCGTTCTAGAGCGCGGAACCCCTATTTG和pA-L：TGGATCCGCGGCCGCGTCGACCCCCTTGTATTACTGTTTATGT，在删除pACYC-177多余卡那抗性基因的同时，引入6个酶切位点用于半长和全长的克隆，获得低拷贝质粒pA-CN(图3)。
(4)全长cDNA载体的构建
CSFV 5′-半长的组装：首先分别用限制性内切酶XbaI/SpeI、SpeI/PstI和NotI/SalI将F1、F2和F3片段克隆于质粒pA或pGEM-5ZF(+)中，获得相应重组质粒F1-pA、F2-pGEM和F3-pGEM；在F1片段基因组5′-非编码区的上游引入T7 RNA聚合酶的启动子用于全长cDNA的体外转录，然后用PstI和SalI将F3从F3-pGEM中切下，克隆与用相同酶作用的F2-pGEM，获得重组质粒F23-pGEM；再用SpeI和BamHI将F23从F23-pGEM中切下，克隆与用相同酶作用的F1-pA，获得含有CSFV 5′-半长的重组质粒F123-pA；
CSFV 3′-半长的组装：首先分别用限制性内切酶BamHI/NcoI和NcoI/NotI将F4、F5片段克隆于质粒pB中，获得相应重组质粒F4-pB和F5-pB；而F6片段则克隆于pSIMPLE-19EcoR V/BAP Vector载体中，获得重组质粒F6-pUC；然后用NcoI/NotI将F5从F5-pB中切下，克隆与用相同酶作用的F4-pB中，获得重组质粒F45-pB；再用BstBI和SalI将F6从F6-pUC中切下，克隆与用相同酶作用的F45-pB，获得含有CSFV 3′-半长的重组质粒F456-pB；
CSFV全长cDNA的组装：用BamHI和SalI将含有CSFV 3′-半长的F456片段从重组质粒F456-pB中切下，克隆与用相同酶作用的F123-pA中，获得含有CSFV全长cDNA的重组质粒pA-FL22。
将获得的全长cDNA载体用限制性内切酶XhoI进行线性化，在体外通过T7RNA聚合酶转录获得病毒基因组RNA(图4)。纯化后的RNA电转ST或PK-15细胞后，通过反复传代可检测到病毒蛋白的表达、RNA的复制以及子代病毒的产生。获得的子代病毒感染家兔后，证实有致病性。
本发明的有益效果在于：
通过本发明的构建方法，可获得携带分子标记的猪瘟病毒兔化弱毒疫苗C株的感染性cDNA载体pA-FL22。由该载体获得的RNA电转猪瘟病毒的易感细胞，拯救具有感染性的子代病毒，且该子代病毒能稳定遗传上述构建中引入的分子标记。通过保留的分子标记可用于区分其它猪瘟病毒。利用该感染性cDNA载体及子代病毒的拯救技术体系，可为深入研究该病毒的复制机制、致病机理以及新型标记疫苗开发奠定基础。
由本发明获得的携带分子标记的C株病毒可用于制备猪瘟病毒疫苗。通过对分子标记的鉴定，可在分子水平区分该疫苗株与其它猪瘟病毒(图5)，为生产实践中猪瘟病毒的鉴别诊断提供新的方法。
附图说明
图1为携带分子标记的猪瘟病毒疫苗C株全长cDNA载体pA-FL22构建示意图，图中基因组中标记的星号为引入的分子标记；
图2为覆盖全长基因组的6个cDNA片段的RT-PCR扩增示意图，图中M为WideRange DNA Marker 500-15,000，RT-PCR分段扩增得到F1片段；依次类推，RT-PCR分段扩增得到的F6片段；
图3为构建全长cDNA载体pA-FL22所需质粒的改造示意图；
图4为体外转录获得的RNA电泳图，图中M为1Kb DNA Ladder Marker，1为PRRSV体外转录的15Kb的基因组RNA对照，2为本发明中CSFV体外转录的12.3Kb的基因组RNA样品；
图5为子代病毒分子标记NcoI鉴定示意图，图中M为2000bp DNA Ladder Marker，1为父代疫苗C株，2为从pA-FL22拯救获得的子代病毒FL22。
具体实施方式
实施例1覆盖猪瘟病毒疫苗C株全长基因组cDNA片段的扩增
表1为扩增C株基因组的6个cDNA片段所需引物：
根据猪瘟病毒基因组序列，在保守区域设计带有特异性酶切位点的引物。引物序列如表1所示。各片段的扩增均运用套式PCR的方法。其中引物名称中up表示上游引物，low表示下游引物，new表示用于第一轮扩增的引物。引物中标有下划线的序列为用于该片段克隆的酶切位点。F1-upper引物中粗体的序列为引入的T7RNA聚合酶识别的启动子，F5-upper引物中粗体的序列为引入的NcoI分子标记。F6-lower引物中粗体的序列为引入的XhoI限制性酶切位点。
猪瘟活疫苗(细胞源)购于中牧实业股份有限公司江西生物药厂，用生理盐水稀释至1头份/ml作为实验材料。用总RNA抽提试剂盒(上海生物工程有限公司)抽提疫苗中的总RNA。根据上述设计的6对引物，RT-PCR分段扩增相应的6个cDNA片段(图2)。6个独立的cDNA片段克隆于Takara公司的pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector，进行序列测定。
实施例2cDNA片段F1和F5中相应分子标记的引入
应用Stratagene公司的定点突变试剂盒，用引物F1-Xho-MU：GAAGCCCACCTCGATATGCTACGTGGACG和F1-Xho-ML：CGTCCACGTAGCATATCGAGGTGGGCTTC对F1片段221位进行定点突变(G→T)，这一突变敲除基因组中原有的XhoI限制性酶切位点。而F5片段中NcoI分子标记用F5-upper引物通过PCR直接引入。
实施例3全长cDNA克隆所需质粒的改造
以pBR322为模板进行改造，获得用于克隆CSFV基因组3′-半长的质粒pB-CN。具体步骤如下：应用引物pGEM-U：GGGAAGCTTGGATCCTATAGGGCGAATTGG和pGEM-L：CCGCCCGGGCAAGCTATTTAGGTGACAC扩增含有质粒pGEM-5ZF(+)多克隆位点的171bp片段，并在该片段的前后分别引入酶切位点HindIII和AvaI。由于pBR322质粒中编码卡那抗性片段的前后也含有相应的这两个酶，所以应用这两个酶可将该片段切下，并将171bp的片段克隆于相应位置，获得中拷贝质粒pB-CN。以低拷贝质粒pACYC-177为模板进行改造，获得用于克隆CSFV基因组5′-半长和基因组全长的质粒pA-CN。具体步骤如下：应用引物pA-U：GCGGACTAGTACGCGTTCTAGAGCGCGGAACCCCTATTTG和pA-L：TGGATCCGCGGCCGCGTCGACCCCCTTGTATTACTGTTTATGT在删除pACYC-177多余卡那抗性基因的同时，引入6个酶切位点用于半长和全长的克隆，获得低拷贝质粒pA-CN(图3)。
实施例4全长cDNA载体的构建
CSFV 5′-半长的组装：如图1所示，首先分别用限制性内切酶XbaI/SpeI，SpeI/PstI和NotI/SalI将F1，F2和F3片段克隆于质粒pA或pGEM-5ZF(+)中，获得相应重组质粒F1-pA，F2-pGEM和F3-pGEM。在F1片段基因组5′-非编码区的上游引入T7RNA聚合酶的启动子用于全长cDNA的体外转录。然后用PstI和SalI将F3从F3-pGEM中切下，克隆与用相同酶作用的F2-pGEM，获得重组质粒F23-pGEM。再用SpeI和BamHI将F23从F23-pGEM中切下，克隆与用相同酶作用的F1-pA，获得含有CSFV 5′-半长的重组质粒F123-pA。
CSFV 3′-半长的组装：首先分别用限制性内切酶BamHI/NcoI和NcoI/NotI将F4，F5片段克隆于质粒pB中，获得相应重组质粒F4-pB和F5-pB。而F6片段则克隆于pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector载体中，获得重组质粒F6-pUC。然后用NcoI/NotI将F5从F5-pB中切下，克隆与用相同酶作用的F4-pB中，获得重组质粒F45-pB。再用BstBI和SalI将F6从F6-pUC中切下，克隆与用相同酶作用的F45-pB，获得含有CSFV 3′-半长的重组质粒F456-pB。
CSFV全长cDNA的组装：用BamHI和SalI将含有CSFV 3′-半长的F456片段从重组质粒F456-pB中切下，克隆与用相同酶作用的F123-pA中，获得含有CSFV全长cDNA的重组质粒pA-FL22。
含有基因组全长重组质粒pA-FL22的大肠杆菌在含Amp抗性的LB培养基中传代十次。第十代的细菌抽提质粒后，全基因组测序确定该重组质粒的稳定性。结果表明pA-FL22在大肠杆菌中相当稳定，无任何突变、插入和缺失引入。
实施例5基于体外转录和电转方法的猪瘟病毒拯救
200ml LB培养基中加入培养过夜的菌液500μl，同时加入浓度为100mg/ml的Amp200μl，37℃扩大培养12h。收集菌液后用Promega公司中量质粒纯化试剂盒抽提质粒。经浓度测定的质粒用限制性内切酶XhoI进行线性化。线性化的质粒经纯化后用MEGAscript体外RNA合成试剂盒(Ambion公司)。体外转录获得的RNA经电泳检测完整性和正确性。如图4所示，体外转录的RNA非常均一，无脱尾，降解现象。经浓度测定后存放于-80℃备用。
电转前一天，将ST或PK-15细胞分瓶。电转时，将前一天分瓶的细胞消化后，用PBS洗涤细胞2次。将1～1.5μg上述RNA加入细胞中，混匀后加入0.2cm的电转杯(Bio-Rad公司)中用电转仪Gene Pulser Xcell(Bio-Rad公司)进行电转，电转参数为150V，500μF，电阻无穷。电转后将电转杯中的细胞迅速移入完全培养基中重悬并加入培养瓶中，37℃，5％CO2培养。电转后96h的细胞，经胰酶消化后以1∶4的比例继续连续传代培养。同时将上清和剩余的细胞于-76℃保存备用。以同样的方法连续传代，每代都用兔抗C株全病毒抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测。在检测是否产生感染性子代病毒时，将细胞-76℃/37℃反复冻融三次，离心去除细胞碎片后取上清接种新的ST或PK-15细胞，37℃培养96h后IFA检测。结果表明由全长cDNA载体pA-FL22转录的RNA在细胞内能够复制并合成病毒蛋白，最终产生具有感染性的子代病毒。
将传至第10代的病毒超离浓缩后，以100个TCID50的子代病毒耳缘静脉注射于家兔体内，阳性对照组为猪瘟病毒C株细胞苗，每天测量体温3次。感染后的24-72h可观察到兔子体温升高，且在感染后的第5天剖杀各组家兔脾脏可见明显肿大。而注射MEM培养液作为阴性对照组的家兔体温未见升高，且脾脏无肿大。这一结果表明子代病毒FL22能够在兔体内复制。
实施例6子代病毒分子标记鉴定
对获得的子代病毒进行NcoI分子标记的鉴定。首先在引入的分子标记上、下游分别设计两对引物(7673-7693：TGGGGGTGAATCAATAGCAGA和8411-8432：ATTACTTGATAGCTGGCGGACC以及7843-7872：GGAATTACAATAACCTGTCCAAGATAGTTG和8372-8391：CCCAGCAGTTCCACAGCCTC)。进行套式PCR的检测，再用限制性内切酶NcoI酶切确定拯救的子代病毒与父代疫苗C株在分子标记上的差异。如图5所示，从FL22基因组中扩增的片段能被NcoI切成2个片段(lane 2)，而父代C株则仍然为完整的548bp片段(lane 1)。该结果表明子代病毒FL22能够在体内、外稳定遗传引入的分子标记。
序列表
SEQ ID NO：1
gtatacgagg ttagttcatt ctcg 24
SEQ ID NO：2
gccttgtgcc ccagttact 19
SEQ ID NO：3
aaatctagat aatacgactc actatagtat acgaggttag ttcattctc 49
SEQ ID NO：4
aaaactagta acagccatac cacac 25
SEQ ID NO：5
gcttgataaa agtattaaga ggacag 26
SEQ ID NO：6
aactcgtaag tgggcagtat ga 22
SEQ ID NO：7
acggactagt aactggggca caaggc 26
SEQ ID NO：8
gggctgcagt ggaaataagg tacacgagaa 30
SEQ ID NO：9
ttaataaggg tgctgaaggg aataggtgag 30
SEQ ID NO：10
ccacatccaa gtccgggaga gtaa 24
SEQ ID NO：11
aaagcggccg cctgcagtgg taacaagat 29
SEQ ID NO：12
gcagtcgacg gatcctcacc actataata 29
SEQ ID NO：13
gattaaagat accagtagag gagatgaaga 30
SEQ ID NO：14
cacggatact ggattttgtg acat 24
SEQ ID NO：15
cgtgacgtcg gatccatcta acctgagggt ggtaacatcg 40
SEQ ID NO：16
taccatggcc gcactaaccc ccgtgcctag caaaccatcg ctt 43
SEQ ID NO：17
aatcaggcgc ggaaaaag 18
SEQ ID NO：18
cctcttctca ttctttggga tc 22
SEQ ID NO：19
accccatgga gatcatgtca caaaatc 27
SEQ ID NO：20
caggcggccg cttcgaaaaa accagcagca c 31
SEQ ID NO：21
attgaaacga cccgagttag ag 22
SEQ ID NO：22
gggccgttag aaattacctt ag 22
SEQ ID NO：23
gggttcgaac gcaaaaatat aggggaaata t 31
SEQ ID NO：24
aaagtcgacc tcgagggccg ttagaaatta ccttag 36
SEQ ID NO：25
gaagcccacc tcgatatgct acgtggacg 29
SEQ ID NO：26
cgtccacgta gcatatcgag gtgggcttc 29
SEQ ID NO：27
gggaagcttg gatcctatag ggcgaattgg 30
SEQ ID NO：28
ccgcccgggc aagctattta ggtgacac 28
SEQ ID NO：29
gcggactagt acgcgttcta gagcgcggaa cccctatttg 40
SEQ ID NO：30
tggatccgcg gccgcgtcga cccccttgta ttactgttta tgt 43