发明背景
发明领域
本发明涉及伴侣基因用于提高重组表达系统中的蛋白生产的用途。 一般而言，重组的低等真核生物宿主细胞包含编码异源伴侣蛋白的核酸 和编码内源伴侣蛋白的基因的缺失或破坏。这些宿主细胞可以用于大量 生产重组糖蛋白和用于生产具有减少的O-糖基化的重组糖蛋白。
相关技术的描述
分子伴侣在蛋白的折叠和分泌(具体地，抗体的折叠和分泌)中起 关键作用。在低等真核生物中，具体地在酵母中，蛋白二硫键异构酶(PDI) 是一种伴侣蛋白，它的功能是辅助在多聚体蛋白之间建立二硫键，例如 抗体重链和轻链之间的二硫键。过去已经尝试通过过表达人PDI伴侣蛋 白和/或过表达内源PDI，增加巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中的抗体表 达水平。参见例如，Wittrup等人，美国专利号5,772,245；Toyoshima等 人，美国专利号5,700,678和5,874,247；Ng等人，美国申请公开号 2002/0068325；Toman等人，J.Biol.Chem.275：23303-23309(2000)； Keizer-Gunnink等人，Martix Biol.19：29-36(2000)；Vad等人，J. Biotechnol.116：251-260(2005)；Inana等人，Biotechnol.Bioengineer.93： 771-778(2005)；Zhang等人，Biotechnol.Prog.22：1090-1095(2006)； Damasceno等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.74：381-389(2006)；和， Huo等人，Protein express.Purif.54：234-239(2007)。
蛋白二硫键异构酶(PDI)可以造成与非催化反应相比含有二硫键的 蛋白的回收率大幅增加或大幅降低；内质网(ER)中高浓度的PDI对于含 有二硫键的蛋白的表达而言是必需的(Puig和Gilbert，J.Biol.Chem.，269： 7764-7771(1994))。在图2中显示了PDI1和它的共伴侣的作用。
在Gunther等人，J.Biol.Chem.，268：7728-7732(1993)中，用蛋白二 硫键异构酶家族的鼠基因替换酿酒酵母的Trg1/Pdi1基因。已经发现，2 种未糖基化的哺乳动物蛋白PDI和ERp72能替代至少一些Trg1关键作 用，尽管3种蛋白在硫氧还蛋白相关结构域周围的序列明显不同；而 ERp61是无活性的。
酵母和丝状真菌(例如巴氏毕赤酵母)的其它蛋白表达系统的开发， 是基于改良的载体和宿主细胞系，其中有效的伴侣蛋白会促进用于蛋白 重组生产和具体的抗体重组生产的遗传增强的酵母菌株的开发。
本发明提供了使用辅助基因和伴侣蛋白生产重组蛋白的改良的方 法和材料。在一个实施方案中，人源化伴侣途径的基因工程会提高在巴 氏毕赤酵母细胞中生产的重组抗体的产量。
如本文所述，本发明的方法和材料会为这样的表达过程提供胜过先 前已知的表达过程的空前优点。
发明内容
发明人已经发现，通过用一种或更多种异源伴侣蛋白替换重组宿主 细胞中的一种或更多种内源伴侣蛋白，可以提高重组宿主细胞中重组蛋 白的表达。一般而言，已经发现，当用编码内源伴侣蛋白同系物的异源 基因替换编码内源伴侣蛋白的基因时，可以增加重组蛋白的表达，所述 异源基因来自与要在宿主细胞中生产的重组蛋白的基因相同的或类似 的物种。例如，可以减少或消除低等真核宿主细胞中编码伴侣蛋白的内 源基因的功能，并将编码哺乳动物伴侣蛋白的异源基因导入宿主细胞。 一般而言，从与要用宿主细胞生产的重组蛋白相同的物种选择哺乳动物 伴侣蛋白。表达哺乳动物伴侣蛋白、但是不表达它的内源伴侣蛋白的低 等真核宿主细胞能大量生产有活性的、正确折叠的重组蛋白。与在保留 内源PDI基因的低等真核宿主细胞中生产重组蛋白相比，这是生产力的 提高。
发明人还已经发现，通过如本文所述提高蛋白表达，会提供其它优 点，即可以构建健康的、可存活的重组宿主细胞，其具有它的一个或更 多个内源蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)基因的缺失或破坏。在低等真核 细胞中缺失或破坏一个或更多个PMT基因，会导致在该细胞中生产的 重组蛋白的O-糖基化数量的减少。但是，当在另外缺失一个或更多个编 码甘露糖基转移酶的基因且表达内源伴侣蛋白的低等真核宿主细胞中 产生PMT缺失时，得到的细胞经常被证实是无活力的或低产的细胞， 这使它们不适合用于商业用途。
因而，在某些方面，本发明提供了低等真核宿主细胞，其中已经减 少或消除了至少一个编码伴侣蛋白的内源基因的功能，并在宿主细胞中 表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物的核酸分子。在其它方面， 所述低等真核宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。
在另外的方面，破坏或去除编码伴侣蛋白蛋白二硫键异构酶(PDI) 的内源基因的功能，使得宿主细胞中不再存在内源PDI1，并将编码哺 乳动物PDI蛋白的核酸分子导入宿主细胞，且在宿主细胞中表达。在一 个实施方案中，哺乳动物PDI蛋白属于与要在宿主细胞中表达的重组蛋 白相同的物种，且编码哺乳动物PDI的核酸分子整合进宿主细胞的基因 组中。例如，当由导入宿主细胞中的人基因表达重组蛋白时，优选地， 编码PDI的基因也属于人起源。在其它实施方案中，用于表达PDI的核 酸分子包含调控元件，例如启动子和转录终止序列，它们在宿主细胞中 是有功能的，且可操作地连接至编码哺乳动物PDI蛋白的开放读码框。 在其它实施方案中，用编码哺乳动物PDI基因的核酸分子替换内源PDI 基因。这可以通过同源重组或单个置换事件来实现，其中用在两端包含 重叠序列的哺乳动物PDI基因替换内源PDI1基因。
在其它方面，使用重组载体进一步转化本发明的低等真核宿主细 胞，所述重组载体包含源自低等真核宿主细胞的核苷酸调控序列和编码 选定的要用上述宿主细胞生产的哺乳动物蛋白的编码序列。在某些方 面，选定的哺乳动物蛋白是治疗蛋白，可以是糖蛋白，例如抗体。
本发明也提供了低等真核宿主细胞，例如酵母和丝状真菌宿主细 胞，其中，除了如上所述替换编码一种或更多种内源伴侣蛋白的基因以 外，减弱、破坏或去除至少一个编码蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白 的内源基因的功能。在具体实施方案中，减弱、破坏或去除至少一个选 自PMT1和PMT4基因的内源PMT基因的功能。
在其它实施方案中，宿主细胞可以是酵母或丝状真菌宿主细胞，例 如巴氏毕赤酵母细胞，其中内源巴氏毕赤酵母PDI1已经被替换为哺乳 动物PDI，且所述宿主细胞另外表达导入宿主细胞中的载体，该载体包 含与编码人治疗糖蛋白(例如抗体)的开放读码框可操作地连接的源自 巴氏毕赤酵母细胞或在巴氏毕赤酵母细胞中有功能的核苷酸调控序列。 然后进一步工程化宿主细胞，减少或消除至少一个编码选自PMT1和 PMT4的蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源巴氏毕赤酵母基因的 功能，从而提供与具有功能性PMT基因的宿主细胞相比能生产具有减 少的O-糖基化的重组蛋白的宿主细胞。在其它方面，进一步使宿主细胞 接触一种或更多种PMT基因表达或PMT蛋白功能的抑制剂。
在其它方面，本发明包含重组宿主细胞，例如非人真核宿主细胞、 低等真核宿主细胞和酵母和丝状真菌宿主细胞，其具有改良的生产重组 糖蛋白、哺乳动物起源的糖蛋白(包括人蛋白)的特征。已经通过减少 或消除至少一个编码伴侣蛋白的内源基因的功能，改良本发明的重组宿 主细胞。内源基因功能的减少或消除，可以通过任意本领域已知的方法 来实现，且可以通过内源基因的遗传基因座的改变来实现，例如，通过 足以减少或消除内源基因的功能的遗传序列的突变、插入或缺失。可以 减少或消除其功能的伴侣蛋白包括、但不限于PDI。在一个实施方案中， 以减少或消除其功能的方式，去除或改变编码PDI的内源基因。
在其它方面，减少或消除伴侣蛋白的功能，然后替换，例如，通过 用至少一个非内源基因转化宿主细胞，所述非内源基因编码已经破坏或 去除的伴侣蛋白的同系物。在其它方面，将宿主细胞转化成表达至少一 个外源基因，后者编码已经破坏或去除的伴侣蛋白的人或哺乳动物同系 物。在其它方面，外源基因编码来自与要使用宿主细胞生产的重组糖蛋 白的起源物种相同或与其密切相关的物种的同系物。
在具体的方面，减少或消除内源伴侣蛋白PDI1的功能，将宿主细 胞转化成表达PDI的同系物，其源自与要使用宿主细胞生产的重组蛋白 的起源物种相同或与其密切相关的物种。例如，在用于表达哺乳动物蛋 白的巴氏毕赤酵母表达系统中，修饰巴氏毕赤酵母宿主细胞，以减少或 消除内源PDI1基因的功能，并用编码哺乳动物PDI基因的核酸分子转 化宿主细胞。
本发明也提供了增加非人真核宿主细胞、低等真核宿主细胞或酵母 或丝状真菌宿主细胞中重组人或哺乳动物糖蛋白的生产力的方法。本发 明的方法包含下述步骤，减少或消除至少一个编码伴侣蛋白的内源基因 的功能。通常，该方法另外包含，用至少一个异源基因转化宿主细胞， 所述异源基因编码已经减少或消除其功能的伴侣蛋白的同系物。异源基 因包含编码已经减少或消除其功能的伴侣蛋白的人或哺乳动物同系物 的外源基因。在其它方面，外源基因编码来自与要使用宿主细胞生产的 重组糖蛋白的起源物种相同或与其密切相关的物种的同系物。在许多方 面，可以减少或消除其功能的伴侣蛋白包括PDI。
因而，另外提供了在本文公开的宿主细胞中生产重组蛋白的方法， 例如，在一个实施方案中，该方法包含，提供其中已经破坏或去除至少 一个编码伴侣蛋白的内源基因的功能的低等真核宿主细胞，和在宿主细 胞中表达编码至少一种内源伴侣蛋白哺乳动物同系物的核酸分子：将编 码重组蛋白的核酸分子导入宿主细胞，并在适合生产重组蛋白的条件下 培养宿主细胞。在另一个实施方案中，该方法包含，提供低等真核宿主 细胞，其中已经减弱、破坏或去除(i)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因 和(ii)至少一个编码蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的功 能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物的核酸 分子：将编码重组蛋白的核酸分子导入宿主细胞，并在适合生产重组蛋 白的条件下培养宿主细胞。在另一个实施方案中，该方法包含，提供低 等真核宿主细胞，其中已经减弱、破坏或去除编码伴侣蛋白PDI的内源 基因和至少一个编码蛋白O-甘露糖基转移酶-1(PMT1)或PMT4蛋白的 内源基因的功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物 同系物的核酸分子PDI：将编码重组蛋白的核酸分子导入宿主细胞，并 在适合生产重组蛋白的条件下培养宿主细胞。
另外已经发现，在上文所述的宿主细胞中过表达Ca2+ ATP酶，会 实现O-聚糖占据的减少。还已经发现，在上述宿主细胞中过表达钙网织 蛋白和ERp57蛋白，也会实现O-聚糖占据的减少。因而，在上述宿主 细胞的其它实施方案中，宿主细胞另外包含一种或更多种编码一种或更 多种外源或内源Ca2+ ATP酶的核酸分子，其可操作地连接至异源启动 子。在其它实施方案中，Ca2+ ATP酶是由巴氏毕赤酵母PMR1基因或 拟南芥ECA1基因编码的Ca2+ ATP酶。在其它实施方案中，宿主细胞 另外包含一种或更多种编码钙网织蛋白和/或ERp57的核酸分子。合适 的其它Ca2+ ATP酶包括、但不限于人SERCA2b蛋白(ATP2A2 ATP酶， Ca++运输，心肌，慢抽搐2)和巴氏毕赤酵母COD1蛋白(酿酒酵母SPF1 的同系物)。合适的其它蛋白包括、但不限于人UGGT(UDP-葡萄糖：糖蛋 白葡萄糖基转移酶)蛋白和人ERp27蛋白。
因而，本发明提供了其中已经破坏或去除至少一个编码伴侣蛋白的 内源基因的功能的低等真核生物宿主细胞，并在宿主细胞中表达编码至 少一种内源伴侣蛋白哺乳动物同系物的核酸分子。
在另一个实施方案中，被破坏的伴侣蛋白是蛋白二硫键异构酶 (PDI)，在其它实施方案中，哺乳动物同系物是人PDI。
一般而言，低等真核生物宿主细胞另外包含编码重组蛋白的核酸分 子，在具体的方面，所述重组蛋白是糖蛋白，在其它方面，所述重组蛋 白是抗体或其片段例如Fc或Fab。
在其它实施方案中，已经减弱、破坏或去除至少一个编码蛋白O- 甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的功能。在具体的方面，PMT蛋 白选自PMT1和PMT4。因而，宿主细胞可以另外包含单独的PMT1或 PMT4的减少、破坏或缺失，或PMT1和PMT4二者的减少、破坏或缺 失。因而，另外提供了低等真核生物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或 去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因和(b)至少一个编码蛋白O-甘 露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的功能；并在宿主细胞中表达编码 至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物的核酸分子。
在其它实施方案中，宿主细胞另外包含编码内源或异源Ca2+ ATP 酶的核酸分子。在具体的方面，Ca2+ ATP选自巴氏毕赤酵母PMR1和 拟南芥ECA1。因而，另外提供了低等真核生物宿主细胞，其中已经减 弱、破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因的功能；并在宿主 细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物和至少一种Ca2+ ATP酶的核酸分子。另外提供了低等真核生物宿主细胞，其中已经减弱、 破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因和(b)至少一个编码蛋 白O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的功能；并在宿主细胞中表 达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物和至少一种Ca2+ ATP酶的核 酸分子。
在另外的方面，宿主细胞另外包含编码人ERp57伴侣蛋白的核酸分 子或编码钙网织蛋白(CRT)蛋白的核酸分子，或二者。在具体的方面， 钙网织蛋白是人CRT，ERp57是人ERp57。因而，另外提供了低等真核 生物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的 内源基因的功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物 同系物和至少一种CRT或ERp57的核酸分子。另外提供了低等真核生 物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内 源基因的功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同 系物、至少一种CRT或ERp57和至少一种Ca2+ ATP酶的核酸分子。 另外提供了低等真核生物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或去除(a)至少 一个编码伴侣蛋白的内源基因和(b)至少一个编码蛋白O-甘露糖基转移 酶(PMT)蛋白的内源基因的功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴 侣蛋白哺乳动物同系物、至少一种CRT或ERp57和至少一种Ca2+ ATP 酶的核酸分子。
在上述宿主细胞的其它方面，宿主细胞选自：巴氏毕赤酵母，芬兰 毕赤酵母(Pichia finlandica)，Pichia trehalophila，Pichia koclamae，膜醭 毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)，Pichia minuta(Ogataea minuta， Pichia lindneri)，Pichia opuntiae，Pichia thermotolerans，Pichia salictaria， Pichia guercuum，Pichia pijperi，Pichia stipitis，甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)，毕赤酵母属，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)， 酵母属(Saccharomyces sp.)，裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)， 裂殖酵母属(Schizosacchromyces sp.)，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)，乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)，白色假丝酵母菌(Candida albicans)，构巢曲 霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，Chrysosporium lucknowense， 镰孢菌属(Fusarium sp.)，Fusarium gramineum，镰孢霉(Fusarium venenatum)，Physcomitrella patens和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。 毕赤酵母属，任意的酵母属，任意的裂殖酵母属，多形汉逊酵母，任意 的克鲁维酵母属，白色假丝酵母菌，任意的曲霉属，里氏木霉， Chrysosporium lucknowense，任意的镰孢菌属和粗糙脉孢菌。
其它实施方案包括以比没有如本文所述修饰的宿主细胞可得到的 产量更高的产量生产重组蛋白的方法，和生产与没有包含本文所述的遗 传修饰的重组糖蛋白相比具有减少的O-糖基化或O-聚糖占据的重组蛋 白的方法。重组蛋白包括具有治疗关联性的蛋白和糖蛋白，包括抗体和 其片段。
因而，提供了生产重组蛋白的方法，其包含：(a)提供低等真核生物 宿主细胞，其中已经破坏或去除至少一个编码伴侣蛋白的内源基因的功 能，并在宿主细胞中表达编码至少一种内源伴侣蛋白哺乳动物同系物的 核酸分子；(b)将编码重组蛋白的核酸分子导入宿主细胞；和(c)在适合生 产重组蛋白的条件下培养宿主细胞。
另外提供了生产重组蛋白的方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿 主细胞，其中已经减弱、破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基 因和(b)至少一个编码蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的 功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物的核 酸分子；(b)将编码重组蛋白的核酸分子导入宿主细胞；和(c)在适合生产 重组蛋白的条件下培养宿主细胞。
另外提供了生产重组蛋白的方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿 主细胞，其中已经减弱、破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基 因和(b)至少一个编码蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的 功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物和至 少一种Ca2+ ATP酶的核酸分子；(b)将编码重组蛋白的核酸分子导入宿 主细胞；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下培养宿主细胞。
另外提供了生产重组蛋白的方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿 主细胞，其中已经减弱、破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基 因的功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物 和至少一种CRT或ERp57的核酸分子；(b)将编码重组蛋白的核酸分子 导入宿主细胞；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下培养宿主细胞。
另外提供了生产重组蛋白的方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿 主细胞，其中已经减弱、破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基 因的功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系 物、至少一种CRT或ERp57和至少一种Ca2+ ATP酶的核酸分子；(b)将 编码重组蛋白的核酸分子导入宿主细胞；和(c)在适合生产重组蛋白的条 件下培养宿主细胞。
另外提供了生产重组蛋白的方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿 主细胞，其中已经减弱、破坏或去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基 因和(b)至少一个编码蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的 功能；并在宿主细胞中表达编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物、至 少一种CRT或ERp57和至少一种Ca2+ ATP酶的核酸分子；(b)将编码重 组蛋白的核酸分子导入宿主细胞；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下培 养宿主细胞。
另外提供了生产具有减少的O-糖基化或O-聚糖占据的重组蛋白的 方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿主细胞，其中已经破坏或去除至 少一个编码伴侣蛋白的内源基因的功能，并在宿主细胞中表达编码至少 一种内源伴侣蛋白哺乳动物同系物的核酸分子；(b)将编码重组蛋白的核 酸分子导入宿主细胞；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下培养宿主细 胞。
另外提供了生产具有减少的O-糖基化或O-聚糖占据的重组蛋白的 方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或 去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因和(b)至少一个编码蛋白O-甘 露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的功能；并在宿主细胞中表达编码 至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物的核酸分子；(b)将编码重组蛋白的核 酸分子导入宿主细胞；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下培养宿主细 胞。
另外提供了生产具有减少的O-糖基化或O-聚糖占据的重组蛋白的 方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或 去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因和(b)至少一个编码蛋白O-甘 露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的功能；并在宿主细胞中表达编码 至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物和至少一种Ca2+ ATP酶的核酸分 子；(b)将编码重组蛋白的核酸分子导入宿主细胞；和(c)在适合生产重组 蛋白的条件下培养宿主细胞。
另外提供了生产具有减少的O-糖基化或O-聚糖占据的重组蛋白的 方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或 去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因的功能；并在宿主细胞中表达 编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物和至少一种CRT或ERp57的核 酸分子；(b)将编码重组蛋白的核酸分子导入宿主细胞；和(c)在适合生产 重组蛋白的条件下培养宿主细胞。
另外提供了生产具有减少的O-糖基化或O-聚糖占据的重组蛋白的 方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或 去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因的功能；并在宿主细胞中表达 编码至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物、至少一种CRT或ERp57和至 少一种Ca2+ ATP酶的核酸分子；(b)将编码重组蛋白的核酸分子导入宿 主细胞；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下培养宿主细胞。
另外提供了生产具有减少的O-糖基化或O-聚糖占据的重组蛋白的 方法，其包含：(a)提供低等真核生物宿主细胞，其中已经减弱、破坏或 去除(a)至少一个编码伴侣蛋白的内源基因和(b)至少一个编码蛋白O-甘 露糖基转移酶(PMT)蛋白的内源基因的功能；并在宿主细胞中表达编码 至少一种伴侣蛋白哺乳动物同系物、至少一种CRT或ERp57和至少一 种Ca2+ ATP酶的核酸分子；(b)将编码重组蛋白的核酸分子导入宿主细 胞；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下培养宿主细胞。
在上述方法的其它方面，宿主细胞选自：巴氏毕赤酵母，芬兰毕赤 酵母，Pichia trehalophila，Pichia koclamae，膜醭毕赤氏酵母，Pichia minuta(Ogataea minuta，Pichia lindneri)，Pichia opuntiae，Pichia thermotolerans，Pichia salictaria，Pichia guercuum，Pichia pijperi，Pichia stipitis，甲醇毕赤酵母，毕赤酵母属，酿酒酵母，酵母属，裂殖酵母， 裂殖酵母属，多形汉逊酵母，克鲁维酵母属，乳酸克鲁维酵母，白色假 丝酵母菌，构巢曲霉，黑曲霉，米曲霉，里氏木霉，Chrysosporium lucknowense，镰孢菌属，Fusarium gramineum，镰孢霉，Physcomitrella patens和粗糙脉孢菌。毕赤酵母属，任意的酵母属，任意的裂殖酵母属， 多形汉逊酵母，任意的克鲁维酵母属，白色假丝酵母菌，任意的曲霉属， 里氏木霉，Chrysosporium lucknowense，任意的镰孢菌属和粗糙脉孢菌。
另外提供了由本文公开的宿主细胞生产的重组蛋白。
在具体实施方案中，任一种前述的宿主细胞可以另外包含遗传修 饰，其使宿主细胞能生产主要具有特定N-聚糖结构或特定N-聚糖结构 混合物的糖蛋白。例如，已经将宿主细胞遗传地工程化成生产具有 Man3GlcNAc2或Man5GlcNAc2核心结构的N-聚糖，其在具体方面包括 一种或更多种其它的糖，例如在非还原端的GlcNAc、半乳糖或唾液酸， 和任选地，在还原端的GlcNAc上的岩藻糖。因而，N-聚糖包括双触角 的和多触角的糖形和对分的糖形。N-聚糖的实例包括、但不限于 Man8GlcNAc2，Man7GlcNAc2，Man6GlcNAc2，Man5GlcNAc2， GlcNAcMan5GlcNAc2，GalGlcNAcMan5GlcNAc2， NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2，Man3GlcNAc2， GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2，Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2， NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
定义
除非在本文中另外定义，与本发明关联使用的科学和技术术语和用 语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步的，除非上下文另 外需要，单数的术语应当包括复数，复数的术语应当包括单数。一般地， 相关使用的命名，以及在本文中描述的生物化学、酶学、分子和细胞生 物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域 公知和通常使用的。通常根据本领域公知的常规方法以及如各种一般的 和更具体的参考文献的描述进行本发明的方法和技术，这些参考文献在 本说明书中被引证和讨论，除非另有陈述。参见，例如，Sambrook等 人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，and Supplements to 2002)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)； Taylor and Drickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press (2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.， Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol I，CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)。
在本文中提及的所有出版物、专利和其它参考文献通过引用将它们 整体并入。
除非另有说明，以下术语应当理解为具有以下含义：
在本文中使用的术语“N-聚糖”和“糖形”可互换地使用，是指N-连接 的寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺键连接到多肽的天冬酰胺残 基上的寡糖。N-连接的糖蛋白含有与蛋白中的天冬酰胺残基的酰胺氮相 连的N-乙酰葡糖胺残基。糖蛋白中存在的主要糖类是葡萄糖、半乳糖、 甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) 和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NANA))。对N-连接的糖蛋白的糖基 团的加工与翻译共同发生于内质网腔中，并在高尔基体中继续。
N-聚糖具有共同的Man3GlcNAc2五糖核心(“Man”是指甘露糖； “Glc”是指葡萄糖；“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰葡萄糖胺)。 N-聚糖的差别在于包含外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液 酸)的分支(触角)的数目，所述外周糖被添加到Man3GlcNAc2(“Man3”) 核心结构，后者也称作“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“寡甘露糖 (paucimannose)核心”。N-聚糖根据它们的分支的成分(例如，高甘露 糖、复合或杂合)分类。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多甘露糖残 基。“复合”型N-聚糖一般具有至少一个结合1，3甘露糖臂的GlcNAc和 至少一个结合“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖 也可以具有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基，其任选地 用唾液酸或衍生物修饰(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经 氨酸，“Ac”是指乙酰基)。复合N-聚糖还可以具有链内的取代，包括“对 分”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。复合N-聚糖还可以在“三甘露糖核心” 上具有多个触角，通常称为“多触角聚糖”。“杂合”N-聚糖具有至少一个 在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端上的GlcNAc，以及零个或更多个 在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上的甘露糖。各种N-聚糖也被称为“糖 形”。
在本文中使用的缩写具有本领域通用的用途，参见，例如，上述的 糖类缩写。其它常见的缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”或“糖苷酶”，都是 指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。
本文使用的术语“载体”是指能够运输已经与其连接的另一个核酸 分子的核酸分子。一类载体是“质粒载体”，是指在其中可以连接其它 DNA片段的环状双链DNA环。其它载体包括粘粒、细菌人工染色体 (BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一类载体是病毒载体，其中其它DNA 片段可以连接进病毒基因组中(下面更详细地讨论)。某些载体能够在导 入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起 点的载体)。其它载体可以在导入宿主细胞后整合进宿主细胞的基因组 中，从而随宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够指导与它 们可操作地连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“重组表达载 体”(或简称“表达载体”)。
在本文中使用的术语“目标序列”或“目标基因”是指核酸序列，一般 编码蛋白，其通常不在宿主细胞中产生。本文公开的方法能有效表达一 个或更多个稳定整合进宿主细胞基因组中的目标序列或目标基因。目标 序列的非限制性实例包括编码一种或更多种具有酶活性的多肽的序列， 例如影响宿主中N-聚糖合成的酶，例如甘露糖基转移酶、N-乙酰氨基葡 萄糖基转移酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺转运蛋白、半乳糖基转移酶、 UDP-N-乙酰半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。
术语“标记序列”或“标记基因”是指能够表现活性的核酸序列，其容 许对宿主细胞内是否存在所述序列的正选择或负选择。例如，巴氏毕赤 酵母URA5基因是标记基因，因为它的存在可以通过含有该基因的细胞 在缺少尿嘧啶的情况下生长的能力来选择。它的存在还可以针对含有该 基因的细胞不能在有5-FOA存在下生长来选择。标记序列或基因不一定 需要同时显示正和负选择能力。来自巴氏毕赤酵母的标记序列或基因的 非限制性实例包括ADE1，ARG4，HIS4和URA3。对于抗生素抗性标记 基因，通常使用卡那霉素、新霉素、遗传霉素(或G418)、巴龙霉素和潮 霉素抗性基因来实现在有这些抗生素存在下的生长。
“可操作地连接的”表达控制序列是指一种连接，其中表达控制序列 与目标基因是邻近的，以控制目标基因，以及以反式起作用或在一定距 离处控制目标基因的表达控制序列。
术语“表达控制序列”或“调控序列”互换使用，在本文用于指影响与 其可操作地连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序 列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包 括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信 号，如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效 率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白稳定性的序列；和当需要 时，增强蛋白分泌的序列。这些控制序列的性质随宿主生物而不同；在 原核生物中，这些控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终 止序列。术语“控制序列”意图包括，至少，其存在是表达所必需的所有 元件，还可以包括其存在是有益的其它元件，例如，前导序列和融合伴 侣序列。
在本文中使用的术语“重组宿主细胞(“表达宿主细胞”、“表达宿主系 统”、“表达系统”或简称“宿主细胞”)意图指已经导入重组载体的细胞。 应当理解，这些术语不仅仅意图指特定的接受细胞，还指这种细胞的后 代。由于突变或环境影响，在后代中可能出现某些改变，这样的后代实 际上可能不与母细胞相同，但是仍然包括在本文中使用的术语“宿主细 胞”的范围内。重组宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细 胞系，或可以是存在于活组织或生物体中的细胞。
术语“真核的”是指有核细胞或生物体，包括昆虫细胞、植物细胞、 哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞。
术语“低等真核细胞”包括酵母和丝状真菌。酵母和丝状真菌包括、 但不限于：巴氏毕赤酵母，芬兰毕赤酵母，Pichia trehalophila，Pichia koclamae，膜醭毕赤氏酵母，Pichia minuta(Ogataea minuta，Pichia lindneri)，Pichia opuntiae，Pichia thermotolerans，Pichia salictaria，Pichia guercuum，Pichia pijperi，Pichia stipitis，甲醇毕赤酵母，毕赤酵母属， 酿酒酵母，酵母属，裂殖酵母，裂殖酵母属，多形汉逊酵母，克鲁维酵 母属，乳酸克鲁维酵母，白色假丝酵母菌，构巢曲霉，黑曲霉，米曲霉， 里氏木霉，Chrysosporium lucknowense，镰孢菌属，Fusarium gramineum， 镰孢霉，Physcomitrella patens和粗糙脉孢菌。毕赤酵母属，任意的酵母 属，任意的裂殖酵母属，多形汉逊酵母，任意的克鲁维酵母属，白色假 丝酵母菌，任意的曲霉属，里氏木霉，Chrysosporium lucknowense，任 意的镰孢菌属和粗糙脉孢菌。
在下述情况下，就说编码蛋白的基因的功能“被减弱”：已经修饰 该基因，例如通过一个或更多个核苷酸的缺失、插入、突变或置换，使 得修饰的基因编码的蛋白与没有这种修饰的对应基因编码的蛋白相比， 具有降低了至少20％至50％的活性，在具体的方面，降低了至少40％的 活性或降低了至少50％的活性，这在标准试验中测得。在下述情况下， 就说编码蛋白的基因的功能“被消除”：已经修饰该基因，例如通过一 个或更多个核苷酸的缺失、插入、突变或置换，使得修饰的基因编码的 蛋白与没有这种修饰的对应基因编码的蛋白相比，具有降低了至少90％ 至99％的活性，在具体的方面，降低了至少95％的活性或降低了至少99％ 的活性，这在标准试验中测得。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领 域的普通技术人员通常所理解的含义。以下描述了示范性的方法和材 料，然而与在本文中描述的那些相似或等同的方法和材料也可以用于实 现本发明，且是本领域技术人员显而易见的。在本文中提及的所有出版 物和其它参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包 括定义)为准。材料、方法和实施例仅是说明性的，而无意以任何方式 进行限制。
附图简述
图1解释了来自深孔平板筛选的代表性结果，其中在表达内源 PDI1基因的巴氏毕赤酵母宿主细胞中(图A)、在有内源PDI1基因和人 PDI基因存在下(图B)和在表达人PDI基因且已经敲除内源PDI1基因功 能的细胞系中(图C)，生产人抗-DKK1抗体。
图2解释了人PDI和它的共伴侣在内质网的硫醇-氧化还原反应中 的作用。
图3A和3B显示了在用于解释本发明的实施例中所述的酵母菌株 的系谱。
图4A和4B显示了来自摇瓶(A)和0.5L生物反应器(B)表达研究的代 表性结果，其中在用人PDI基因(hPDI)替换内源PDI1的巴氏毕赤酵母 菌株中，和在用人PDI替换内源PDI1且破坏PMT1基因(hPDI+Δpmt1) 的菌株中，生产人抗-Her2抗体。回收抗体，并通过非还原的和还原的 聚丙烯酰胺凝胶上的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。泳道1-2显示了由 用编码抗-Her2抗体的质粒载体pGLY2988转化菌株yGLY2696生成的2 个克隆生产的抗体，泳道3-6显示了由用编码抗-Her2抗体的质粒载体 pGLY2988转化去除PMT1基因的菌株yGLY2696生成的4个克隆生产 的抗体。
图5显示了来自摇瓶表达研究的代表性结果，其中在用人PDI(hPDI) 基因替换内源PDI1的巴氏毕赤酵母菌株中，和在用人PDI替换内源 PDI1且破坏PMT1基因(hPDI+Δpmt1)的菌株中，生产人抗-DKK1抗体。 回收抗体，并通过非还原的和还原的聚丙烯酰胺凝胶上的聚丙烯酰胺凝 胶电泳进行分离。泳道1和3显示了由用编码抗-DKK1抗体的质粒载体 pGLY2260转化菌株yGLY2696和yGLY2690生成的2个克隆生产的抗 体，泳道2和4显示了由用编码抗-DKK1抗体的质粒载体pGLY2260转 化去除PMT1基因的菌株yGLY2696和yGLY2690生成的2个克隆生产 的抗体。
图6显示了来自0.5L生物反应器表达研究的结果，其中在用人 PDI(hPDI)基因替换内源PDI1的巴氏毕赤酵母菌株中，在用人PDI替换 内源PDI1且破坏PMT4基因(hPDI+Δpmt4)的菌株中，和在仅表达内源 PDI1但是破坏PMT4基因(PpPDI+Δpmt4)的菌株中，生产人抗-Her2抗 体。回收抗体，并通过非还原的聚丙烯酰胺凝胶上的聚丙烯酰胺凝胶电 泳进行分离。泳道1和2显示了由用编码抗-Her2抗体的质粒载体 pGLY2988转化菌株yGLY24-1生成的2个克隆生产的抗体，泳道3-5显 示了由去除PMT4基因的菌株yGLY2690的转化生成的3个克隆生产的 抗-Her2抗体。
图7显示了来自摇瓶表达研究的结果，其中在用人PDI替换内源 PDI1且破坏PMT4基因(hPDI+Δpmt4)的巴氏毕赤酵母菌株中，和在仅 表达内源PDI1但是破坏PMT4基因(PpPDI+Δpmt4)的菌株中，生产人 抗-CD20抗体。回收抗体，并通过非还原的和还原的聚丙烯酰胺凝胶上 的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。泳道1显示了由用编码抗-CD20抗体 的质粒载体pGLY3200转化的菌株yGLY24-1生产的抗体，泳道2-7显 示了由去除PMT4基因的菌株yGLY2690的转化生成的6个克隆生产的 抗-CD20抗体。
图8解释了编码人PDI(hPDI)且靶向巴氏毕赤酵母PDI1基因座的 质粒载体pGLY642的构建。
图9解释了编码人ERO1α(hERO1α)且靶向巴氏毕赤酵母PrB1基因 座的质粒载体pGLY2232的构建。
图10解释了编码人GRP94且靶向巴氏毕赤酵母PEP4基因座的质 粒载体pGLY2233的构建。
图11解释了编码里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶(TrMNS1)和小鼠 α-1，2甘露糖苷酶IA(FB53)且靶向巴氏毕赤酵母PRO基因座的质粒载 体pGFI207t的构建。
图12解释了编码里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶(TrMNS1)且靶向巴氏 毕赤酵母PRO基因座的质粒载体pGLY1162的构建。
图13是编码抗-DKK1抗体重链(GFI710H)和轻链(GFI710L)或2条轻 链(GFI710L)且靶向巴氏毕赤酵母TRP2基因座的质粒载体pGLY2260和 2261的图谱。
图14是编码抗-ADDL抗体重链(Hc)和轻链(Lc)且靶向巴氏毕赤酵 母TRP2基因座的质粒载体pGLY2012的图谱。
图15是编码抗-HER2抗体(抗-HER2)重链(Hc)和轻链(Lc)且靶向巴 氏毕赤酵母TRP2基因座的质粒载体pGLY2988的图谱。
图16是编码抗-CD20抗体重链(Hc)和轻链(Lc)且靶向巴氏毕赤酵母 TRP2基因座的质粒载体pGLY3200的图谱。
图17是编码巴氏毕赤酵母PMR1且靶向巴氏毕赤酵母URA6基因 座的质粒载体pGLY3822的图谱。
图18是编码拟南芥ECA1(AtECA1)且靶向巴氏毕赤酵母URA6基因 座的质粒载体pGLY3827的图谱。
图19是编码人CRT(hCRT)和人ERp57(hERp57)且靶向巴氏毕赤酵 母HIS3基因座的质粒载体pGLY1234的图谱。
发明详述
分子伴侣在抗体的折叠和分泌中起关键作用。一种伴侣蛋白、具体 地蛋白二硫键异构酶(PDI)的功能是，催化连接抗体重链和轻链的链间和 链内二硫键形成。蛋白二硫键异构酶(PDI)可以导致与非催化反应相比含 有二硫键的蛋白的回收率的大幅增加或大幅降低；内质网(ER)中高浓度 的PDI对于含有二硫键的蛋白的表达而言是必需的(Puig和Gilbert，J. Biol.Chem.，269：7764-7771(1994))。过去通过过表达人PDI伴侣蛋白和/ 或过表达内源PDI1来增加巴氏毕赤酵母中的抗体表达水平的尝试，已 经取得有限的成功。我们已经人源化巴氏毕赤酵母中的伴侣途径，以探 索通过直接的基因工程提高抗体产量的可能性。
我们已经在巴氏毕赤酵母模型中发现，用编码异源PDI蛋白的表达 盒替换编码内源PDI1蛋白的酵母基因，会使重组酵母细胞生产的重组 人抗体的产量比仅表达内源PDI1蛋白的重组酵母细胞生产的产量提高 约5倍，比共表达异源PDI蛋白和内源PDI1蛋白的重组酵母细胞生产 的产量提高约3倍。
不限于本发明的机理的任何科学理论，认为在沿着分泌途径的折叠 和装配过程中，异源重组蛋白可能比与宿主细胞伴侣蛋白更有效地与异 源伴侣蛋白相互作用。在共表达的情况下，异源伴侣蛋白可能与内源伴 侣蛋白竞争底物，即异源重组蛋白。进一步认为，异源PDI蛋白和重组 蛋白来自相同物种。因此，用编码异源伴侣的表达盒替换编码内源伴侣 蛋白的基因，可能是生产比仅共表达异源伴侣蛋白和内源伴侣蛋白更好 的生产重组蛋白的重组宿主细胞的方式。
另外，通过在重组宿主细胞中过表达异源PDI蛋白和另外的异源共 伴侣蛋白，例如ERO1α和/或GRP94蛋白，可以进一步提供重组蛋白产 量。在其它方面，重组宿主细胞可以另外过表达FAD、FLC1和ERp44 蛋白。由于这些基因在功能上是相关的，可能希望在单个载体中包含编 码这些基因的核酸分子，将其转化进宿主细胞。通过使编码所述蛋白的 核酸分子可操作地连接至异源或同源启动子，可以实现蛋白的表达。在 具体的方面，当宿主细胞是巴氏毕赤酵母时，通过同源启动子例如KAR2 启动子或来自另一个ER-特异性基因的启动子，可以实现一种或更多种 异源共伴侣蛋白的表达。在其它方面，所有异源伴侣蛋白和重组蛋白来 自相同物种。
如在使用巴氏毕赤酵母作为模型的实施例中所例证的，本文公开的 方法特别适用于从低等真核宿主细胞(例如酵母和丝状真菌)生产重组 人糖蛋白，包括抗体。例如，由于目标蛋白的折叠和装配受到人PDI的 辅助，且任选地包含其它哺乳动物衍生的伴侣蛋白例如ERO1α和 GRP94，巴氏毕赤酵母更有效地分泌重组蛋白，从而提高产量。如在实 施例中所例证的，本文的方法特别有益于其中为了实现活性必须通过二 硫键适当装配重链和轻链的抗体的生产。
因而，在解决低等真核宿主细胞和具体的酵母和丝状真菌(例如巴 氏毕赤酵母)分泌重组抗体的低生产力问题方面，本文的方法会提供显 著的优点。在过去，有限成功地过表达酵母、人或小鼠伴侣蛋白，而本 发明证实，通过用异源伴侣蛋白替换宿主细胞的内源伴侣蛋白，可以提 高正确折叠的和分泌的异源蛋白例如抗体的生产力。与编码蛋白同系物 的内源基因的缺失结合地过表达哺乳动物衍生的伴侣蛋白，意外地导致 与仅过表达哺乳动物衍生的蛋白相比提高的糖蛋白生产力。
我们另外发现，可以进一步遗传地操作用编码一种或更多种如上所 述的伴侣基因的核酸分子转化的宿主细胞，以改良从其生产的重组蛋白 的其它特征。这特别适用于从低等真核宿主细胞例如酵母或丝状真菌生 产重组哺乳动物糖蛋白的情况。
例如，低等真核细胞(例如酿酒酵母、白色假丝酵母菌和巴氏毕赤 酵母)含有称作蛋白O-甘露糖基转移酶(PMTs)的基因的家族，所述蛋白 O-甘露糖基转移酶参与甘露糖向分泌的蛋白的丝氨酰基和苏氨酰基残 基的转移。我们发现，已经遗传地改变成表达一种或更多种人源化的或 嵌合的伴侣基因的巴氏毕赤酵母细胞系，能更好地耐受一个或更多个 PMT基因的缺失，对细胞生长或蛋白表达没有影响或影响微弱。可以去 除的PMT基因包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6。一般而言， 去除OCH1基因和PMT基因的巴氏毕赤酵母宿主细胞生长较差或根本 不生长。OCH1基因的缺失或功能敲除，对于构建可以生产具有人样N- 聚糖的人糖蛋白的重组巴氏毕赤酵母宿主细胞而言是必需的。因为希望 生产不具有或具有减少的O-糖基化的人糖蛋白，需要发现减少重组巴氏 毕赤酵母宿主细胞中的O-糖基化的方法，其也能生产具有人样N-聚糖 的人糖蛋白。我们发现，可以进一步将含有一个或更多个本文公开的伴 侣基因的巴氏毕赤酵母宿主细胞遗传地改变成含有OCH1基因的缺失或 功能敲除和一个或更多个PMT基因(例如PMT1，PMT4，PMT5，和/或 PMT6)的缺失或功能敲除。这些重组细胞是可存活的，并高产量地生 产具有人样N-聚糖的人糖蛋白，且具有减少的O-糖基化。另外，通过 在有PMT蛋白抑制剂存在下培养细胞，进一步减少O-糖基化。
如在实施例中所例证的，我们证实，本文公开的方法特别适用于从 低等真核宿主细胞(例如酵母和丝状真菌)生产具有改良的性质的重组 人糖蛋白，包括抗体，因为本发明宿主细胞表现出对化学的PMT蛋白 抑制剂和/或PMT基因缺失的耐受性。实施例证实，与先前的低等真核 表达系统相比，重组蛋白具有减少的O-糖基化占据和O-聚糖长度。如 在实施例中所例证的，本文的方法特别有益于其中为了实现活性必须通 过二硫键适当装配重链和轻链的抗体的生产，且所述抗体必须具有减少 的或没有O-糖基化。
我们已经进一步发现，巴氏毕赤酵母高尔基体Ca2+ ATP酶 (PpPMR1)或拟南芥内质网Ca2+ ATP酶(AtECA1)的过表达，使O-聚糖 占据与其中已经用人PDI替换内源PDI1、但是不表达任一种Ca2+ ATP 酶的上述菌株相比减少约2-倍。因而，在其它实施方案中，本文公开的 宿主细胞中的任一种可以另外包含一种或更多种编码内源或外源高尔 基体或内质网Ca2+ ATP酶的核酸分子，其中所述Ca2+ ATP酶可操作 地连接至异源启动子。这些宿主细胞可以用于生产具有减少的O-糖基化 的糖蛋白。
钙网织蛋白(CRT)是一种多功能蛋白，它在内质网腔中起主要的 Ca(2+)-结合(储存)蛋白的作用。它也出现在细胞核中，表明它可能在转 录调节中起作用。钙网织蛋白结合合成肽KLGFFKR(SEQ ID NO：75)，后 者与细胞核受体超家族的DNA-结合域中的氨基酸序列几乎相同。钙网 织蛋白会结合含有抗-Ro/SSA抗体的全身性红斑狼疮和舍格伦综合征患 者的某些血清中的抗体，它在物种之间是高度保守的，它位于内质网和 肌质网，它在这些地方可以结合钙。钙网织蛋白会结合错误折叠的蛋白， 并防止它们从内质网输出到高尔基体。
ERp57是一种内质网伴侣蛋白，其与凝集素伴侣钙网织蛋白和钙联 接蛋白相互作用，调控新合成的糖蛋白的折叠。曾经认为该蛋白是磷脂 酶；但是，已经证实，该蛋白实际上具有蛋白二硫键异构酶活性。因而， ERp57是内质网(ER)的内腔蛋白和蛋白二硫键异构酶(PDI)家族的成员。 认为，凝集素和该蛋白的复合物通过促进它们的糖蛋白底物中二硫键的 形成介导蛋白折叠。不同于原型PDI，ERp57与新合成的糖蛋白特异性 地相互作用。
我们已经进一步发现，与其中已经用人PDI替换内源PDI1、但是 不表达hCRT和hERp57的菌株相比，巴氏毕赤酵母中人CRT和人ERp57 的过表达使O-聚糖占据减少约1/3。因而，在其它实施方案中，本文公 开的宿主细胞中的任一种可以另外包含一种或更多种编码钙网织蛋白 和ERp57蛋白的核酸分子，它们各自可操作地连接至异源启动子。这些 宿主细胞可以用于生产具有减少的O-糖基化的糖蛋白。
因而，在解决低等真核宿主细胞和具体的酵母和丝状真菌(例如巴 氏毕赤酵母)分泌重组抗体的低生产力问题方面，本文的方法会提供显 著的优点。在过去，有限成功地过表达酵母、人或小鼠伴侣蛋白，而本 发明证实，通过用异源伴侣蛋白替换宿主细胞的内源伴侣蛋白，可以提 高正确折叠的和分泌的异源蛋白例如抗体的生产力。与编码蛋白同系物 的内源基因的缺失结合地过表达哺乳动物衍生的伴侣蛋白，意外地导致 与仅过表达哺乳动物衍生的蛋白相比提高的糖蛋白生产力。
因此，本发明提供了增加存在于低等真核生物宿主细胞中的过表达 的基因产物的产量的方法，它包括，在宿主细胞中表达替代内源伴侣蛋 白的异源伴侣蛋白，从而增加过表达的基因产物的产量。也提供了增加 宿主细胞对过表达的基因产物的生产的方法，它包括，破坏或去除编码 内源伴侣蛋白的基因，表达编码异源伴侣蛋白的核酸分子，后者在存在 于或提供给宿主细胞的表达载体中编码，从而增加过表达的基因产物的 产量。另外提供了增加宿主细胞对过表达的基因产物的生产的方法，它 包括，在宿主细胞中表达至少一种替代内源伴侣蛋白的异源伴侣蛋白。 在上下文中，过表达的基因产物是在大于该基因产物的正常内源表达水 平表达的基因产物。
在一个实施方案中，该方法包含，去除或破坏内源伴侣蛋白的表达， 在宿主细胞中实现一种或更多种异源伴侣蛋白和过表达的基因产物的 表达，并在适合分泌过表达的基因产物的条件下，培养所述宿主细胞。 伴侣蛋白和过表达的基因产物的表达可以如下实现：通过诱导编码伴侣 蛋白的核酸分子和编码过表达的基因产物的核酸分子的表达，其中所述 核酸分子存在于宿主细胞中。
在另一个实施方案中，如下实现异源伴侣蛋白和过表达的基因产物 的表达：在适合表达下述第一种和第二种核酸分子的条件下，将编码异 源伴侣蛋白的第一种核酸分子和编码要过表达的基因产物的第二种核 酸分子导入宿主细胞，在所述宿主细胞中已经破坏或去除至少一个编码 内源伴侣蛋白的基因的表达。在其它方面，所述第一种和第二种核酸分 子中的一种或两种存在于表达载体中。在其它方面，所述第一种和第二 种核酸分子中的一种或两种存在于表达/整合载体中。在另一个实施方案 中，如下实现异源伴侣蛋白的表达：诱导编码伴侣蛋白的核酸分子的表 达，其中所述核酸分子在已经去除或破坏编码内源伴侣蛋白的基因的宿 主细胞中。如下实现第二种蛋白的表达：通过将编码所述第二种基因产 物的核酸分子导入宿主细胞，诱导编码要过表达的基因产物的核酸分子 的表达。
本发明另外提供了增加存在于低等真核生物宿主细胞中的具有减 少的O-糖基化的过表达的基因产物的产量的方法，它包括，在宿主细胞 中表达替代内源伴侣蛋白的异源伴侣蛋白，且其中宿主细胞已经具有一 个或更多个被破坏或去除的蛋白O-甘露糖基转移酶(PMT)家族的基因， 从而增加具有减少的O-糖基化的过表达的基因产物的产量。也提供了增 加宿主细胞对具有减少的O-糖基化的过表达的基因产物的生产的方法， 其中通过破坏或去除编码内源伴侣蛋白的基因和编码PMT的基因，并 表达编码异源伴侣蛋白的核酸分子，后者在存在于或提供给宿主细胞的 表达载体中编码，从而增加过表达的基因产物的产量。另外提供了增加 宿主细胞对具有减少的O-糖基化的过表达的基因产物的生产的方法，它 包括，在宿主细胞中表达至少一种替代内源伴侣蛋白的异源伴侣蛋白， 且其中至少一个PMT基因已经被破坏或去除。在一个实施方案中，该 方法包含，去除或破坏至少一种内源伴侣蛋白和至少一个PMT基因的 表达，并在宿主细胞中表达一种或更多种异源伴侣蛋白和过表达的基因 产物，和在适合分泌具有减少的O-糖基化的过表达的基因产物的条件下 培养所述宿主细胞。伴侣蛋白和过表达的基因产物的表达可以如下实 现：通过诱导编码伴侣蛋白的核酸分子和编码过表达的基因产物的核酸 分子的表达，其中所述核酸分子存在于宿主细胞中。
在另一个实施方案中，如下实现异源伴侣蛋白和过表达的基因产物 的表达：在适合表达下述第一种和第二种核酸分子的条件下，将编码异 源伴侣蛋白的第一种核酸分子和编码要过表达的基因产物的第二种核 酸分子导入宿主细胞，在所述宿主细胞中已经破坏或去除至少一个编码 内源伴侣蛋白的基因和至少一个PMT基因的表达。在其它方面，所述 第一种和第二种核酸分子中的一种或两种存在于表达载体中。在其它方 面，所述第一种和第二种核酸分子中的一种或两种存在于表达/整合载体 中。在另一个实施方案中，如下实现异源伴侣蛋白的表达：诱导编码伴 侣蛋白的核酸分子的表达，其中所述核酸分子在已经去除或破坏编码内 源伴侣蛋白的基因的宿主细胞中。如下实现第二种蛋白的表达：通过将 编码所述第二种基因产物的核酸分子导入宿主细胞，诱导编码要过表达 的基因产物的核酸分子的表达。
在任一个上述实施方案的另一个方面，异源伴侣蛋白在物种或类别 上与内源伴侣蛋白相对应。例如，如果宿主细胞是酵母细胞，且内源伴 侣蛋白是蛋白二硫键异构酶(PDI)，则对应的异源PDI可以是哺乳动物 PDI。在任一个上述实施方案的其它方面，在特定宿主细胞中表达的异 源伴侣蛋白来自与过表达的基因产物相同的物种。例如，如果过表达的 基因产物是人蛋白，则异源伴侣蛋白是人伴侣蛋白；或如果过表达的基 因产物是牛蛋白，则异源伴侣蛋白是牛伴侣蛋白。
伴侣蛋白包括可以促进或增加蛋白的分泌的任意伴侣蛋白。更具体 地，预见到蛋白二硫键异构酶和热休克70(hsp70)蛋白家族的成员。未大 写的″hsp70″在本文中用于表示热休克蛋白70家族的蛋白，它们具有结 构和功能相似性，且它们的表达通常由应激诱导。为了将hsp70家族的 蛋白与具有约70,000分子量的单独热休克蛋白物种区分开，后者具有本 领域公知的名称热休克蛋白-70，在本文中使用大写的HSP70。因此，来 自给定物种的hsp70蛋白家族的每个成员与来自该物种的HSP70蛋白具 有结构相似性。
本发明涉及能够刺激过表达的基因产物的分泌的任意伴侣蛋白。已 知hsp70蛋白家族的成员是结构上同源的，包括酵母hsp70蛋白例如 KAR2、HSP70、BiP、SSA1-4、SSB1、SSC1和SSD1基因产物和真核hsp70 蛋白例如HSP68、HSP72、HSP73、HSC70、网格蛋白脱壳ATP酶、IgG 重链结合蛋白(BiP)、葡萄糖调节蛋白75、78和80(GRP75、GRP78和 GRP80)等。此外，根据本发明，与酵母KAR2或哺乳动物BiP多肽序列 具有足够同源性的任意hsp70伴侣蛋白，都可以用于本发明的方法中刺 激过表达的基因产物的分泌。PDI家族的成员也是结构上同源的，在本 文中预见到根据本发明的方法可以使用的任意PDI。更具体地，预见到 哺乳动物(包括人)和酵母PDI、脯氨酰基-4-羟化酶β-亚基、ERp57、 ERp29、ERp72、GSBP、ERO1α、GRP94、GRP170、BiP和T3BP和酵 母EUG1。因为用于人的许多治疗蛋白是人起源，本文方法的一个特定 方面是，异源伴侣蛋白属于人起源。在其它实施方案中，优选的异源伴 侣蛋白是PDI蛋白，具体地人起源的PDI蛋白。
使用组成型启动子例如GAPDH，通过过表达人BiP来增加酵母细 胞系中异源人蛋白的表达水平的尝试已经失败。巴氏毕赤酵母KAR2(人 BiP的同系物)的敲除对细胞是有害的。通过构建嵌合的BiP基因可以 克服现有技术的限制，其中用巴氏毕赤酵母KAR2的ATP酶结构域替换 人ATP酶结构域，其融合至人BiP肽结合域，在KAR2或来自巴氏毕赤 酵母的其它内质网特异性的启动子的控制下。通过将如上所述的内源 PDI1基因替换和嵌合的BiP和人ERdj3的应用相组合，可以进一步提高 产量。
在其它方面，过表达的基因产物是分泌的基因产物。技术人员可以 容易地得到观察过表达的基因产物是否分泌的方法。例如， Goeddel，(Ed.)1990，Gene Expression Technology，Methods in Enzymology，Vol 185，Academic Press，和Sambrook等人1989， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，提供了检测分泌的基因产物的方法。
为了分泌过表达的基因产物，在足以分泌过表达的基因产物的条件 下，培养宿主细胞。这样的条件包括允许细胞分泌的温度、营养素和细 胞密度条件。此外，这样的条件是使细胞可以执行转录、翻译和在细胞 室之间传递蛋白的基本细胞功能的条件，且是技术人员已知的。
此外，如技术人员已知的，可以在用于维持或培养宿主细胞的培养 基中检测分泌的基因产物。通过已知的方法，例如，离心或过滤，可以 从宿主细胞分离培养基。然后可以利用过表达的基因产物特有的已知性 质，在无细胞的培养基中检测过表达的基因产物。这样的性质可以包括 过表达的基因产物的独特的免疫学的、酶的或物理的性质。例如，如果 过表达的基因产物具有独特的酶活性，可以在宿主细胞使用的培养基上 进行针对该活性的试验。此外，当可以得到可与给定的过表达的基因产 物反应的抗体时，这样的抗体可以用于在任意已知的免疫试验中检测基 因产物(参见Harlowe，等人，1988，Antibodies：A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press)
另外，分泌的基因产物可以是融合蛋白，其中所述基因产物包括促 进基因产物的分泌的异源信号或前导肽。分泌信号肽是分离的氨基酸序 列，它使宿主细胞指导基因产物穿过内部和外部细胞膜并进入胞外环 境。分泌信号肽存在于要分泌的新生多肽基因产物的N-末端。其它真核 分泌信号也可以以结合特定氨基酸的碳水化合物形式存在于基因产物 的多肽链上，即糖基化分泌信号。
N-末端信号肽包括约10至约30个氨基酸的疏水结构域，其前面可 以有约2至约10个氨基酸的短的带电荷的结构域。此外，信号肽存在 于要分泌的基因产物的N-末端。一般而言，信号序列的具体序列不是关 键的，但是信号序列富含疏水氨基酸例如丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮 氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、 蛋氨酸(Met)等。
许多信号肽是已知的(Michaelis等人，Ann.Rev.Microbiol.36： 425(1982)。例如，酵母酸性磷酸酯酶、酵母转化酶和酵母α-因子信号肽 已经结合到异源多肽编码区，并成功地用于异源多肽的分泌(参见例如， Sato等人Gene 83：355-365(1989)；Chang等人Mol.Cell.Biol.6： 1812-1819(1986)；和Brake等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81： 4642-4646(1984)。因此，技术人员可以容易地设计或得到核酸分子，其 编码在5′-末端也具有信号肽的过表达的基因产物的编码区。
优选地通过本发明的方法分泌的过表达的基因产物的实例包括哺 乳动物基因产物例如酶、细胞因子、生长因子、激素、疫苗、抗体等。 更具体地，过表达的基因产物包括、但不限于基因产物例如促红细胞生 成素、胰岛素、生长素、生长激素释放因子、血小板衍生的生长因子、 表皮生长因子、转化生长因子α、转化生长因子β、表皮生长因子、成 纤维细胞生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生 长因子II、凝固因子VIII、超氧化物歧化酶、α-干扰素、γ-干扰素、白 介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、粒细胞 集落刺激因子、多谱系集落刺激活性、粒细胞-巨噬细胞刺激因子、巨噬 细胞集落刺激因子、T细胞生长因子、淋巴毒素、免疫球蛋白、抗体等。 另外包括融合蛋白，包括但不限于，与免疫球蛋白或抗体的恒定区融合 的肽和多肽。特别有用的过表达的基因产物是人基因产物。
术语″抗体″和″免疫球蛋白″包括通过重组DNA技术生产的任意重 组单克隆抗体，且进一步意在包括人源化的和嵌合的抗体。
本发明的方法可以容易地用于增强可以用作疫苗的任意过表达的 基因产物的分泌。可以用作疫苗的过表达的基因产物包括哺乳动物病原 体的任意结构的、膜伴随的、膜结合的或分泌的基因产物。哺乳动物病 原体包括可以感染或攻击哺乳动物的病毒、细菌、单细胞的或多细胞的 寄生虫。例如，病毒疫苗可以包括抗病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、R. rickettsii、牛痘、志贺氏菌属、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、流行性感冒、 甲型肝炎、乙型肝炎、登革病毒、日本乙型脑炎、水痘带状疱疹、巨细 胞病毒、甲型肝炎、轮状病毒的疫苗，以及抗病毒病如莱姆病、麻疹、 黄热病、腮腺炎、狂犬病、疱疹、流行性感冒、副流行性感冒等的疫苗。 细菌疫苗可以包括抗细菌如霍乱弧菌、伤寒沙门菌、百日咳杆菌、肺炎 链球菌、流感嗜血杆菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、麻风分枝杆菌、 淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、粗球孢子菌等的疫苗。
一般而言，重组地表达本发明的过表达的基因产物和异源伴侣蛋 白，也就是说，将编码基因产物或伴侣蛋白的核酸分子放入表达载体中。 这样的表达载体最低限度地含有影响基因产物或异源伴侣蛋白的表达 的序列，此时该序列可操作地连接至编码基因产物或伴侣蛋白的核酸分 子。这样的表达载体也可以含有其它元件如复制起点、选择标记、转录 或终止信号、着丝粒、自主复制序列等。
根据本发明，可以将分别编码过表达的基因产物和异源伴侣蛋白的 第一种和第二种核酸分子放入表达载体在，以实现过表达的基因产物和 /或异源伴侣蛋白的受调节的表达。尽管异源伴侣蛋白和过表达的基因产 物可以在同一个表达载体中编码，异源伴侣蛋白优选地在与编码过表达 的基因产物的载体分开的表达载体中编码。将编码异源伴侣蛋白和过表 达的基因产物的核酸分子放在分开的表达载体中，可以增加分泌的过表 达的基因产物的量。
在本文中使用的表达载体可以是可复制的或不可复制的表达载体。 可复制的表达载体可以独立于宿主细胞染色体DNA地复制，或因为这 样的载体已经整合进宿主细胞染色体DNA中。在整合进宿主细胞染色 体DNA后，这样的表达载体可以丧失一些结构元件，但是保留编码基 因产物或伴侣蛋白的核酸分子以及可以影响基因产物或异源伴侣蛋白 的表达的区段。因此，本发明的表达载体可以是整合染色体的或不整合 染色体的表达载体。
在另一个实施方案中，通过整合型或非整合型表达载体导入宿主细 胞，在宿主细胞中过表达一种或更多种异源伴侣蛋白。导入编码至少一 种伴侣蛋白的至少一种表达载体后，然后通过诱导编码基因产物的内源 基因的表达，或通过向宿主细胞中导入编码基因产物的表达载体，过表 达基因产物。在另一个实施方案中，建立组成性地或经诱导地表达至少 一种异源伴侣蛋白的细胞系。将编码要过表达的基因产物的表达载体导 入这样的细胞系，以增加过表达的基因产物的分泌。
本发明的表达载体可以在一种宿主细胞类型(例如大肠杆菌)中复 制，且在另一种宿主细胞类型(例如真核宿主细胞)中不复制或微弱复 制，只要表达载体允许表达异源伴侣蛋白或过表达的基因产物，从而促 进这样的基因产物在选择的宿主细胞类型中的分泌。
本文所述的表达载体包括为目标基因的受控表达构建的DNA或 RNA分子，也就是，编码本发明的伴侣蛋白或过表达的基因产物的基因。 这样的载体也编码核酸分子区段，后者可操作地连接至编码本发明的伴 侣多肽或本发明的过表达的基因产物的核酸分子。“可操作地连接”在 上下文中是指，这样的区段可以影响编码伴侣蛋白或过表达的基因产物 的核酸分子的表达。这些核酸序列包括启动子、增强子、上游控制元件、 转录因子或阻抑物结合位点、终止信号和可以控制目标宿主细胞中的基 因表达的其它元件。优选地，所述载体是载体、噬菌体、粘粒或病毒。
本发明的表达载体在酵母或哺乳动物细胞中起作用。酵母载体可以 包括酵母2μ圈和其衍生物、编码酵母自主复制序列的酵母载体、酵母 微型染色体、任意的酵母整合载体等。在Parent等人(Yeast 1： 83-138(1985))中，提供了许多类型的酵母载体的详细清单。
能影响基因产物的表达的元件或核酸序列包括启动子、增强子、增 强子元件、上游激活序列、转录终止信号和多腺苷酸化位点。预见到所 有这样的启动子和转录调控元件单独地或组合地用于本发明的表达载 体中。此外，在本文中也预见到遗传工程化的和突变的调控序列。
启动子是用于控制基因表达的DNA序列元件。更具体地，启动子 指定转录起始位点，且可以包括TATA盒子和上游启动子元件。选择的 启动子是预期可在选择的特定宿主系统中起作用的那些。例如，当使用 酵母宿主细胞例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或巴氏毕赤酵母时，在本 发明的表达载体中使用酵母启动子，而真菌启动子用于诸如黑曲霉、粗 糙脉孢菌或里氏木霉的宿主细胞中。酵母启动子的实例包括、但不限于 GAPDH、AOX1、GAL1、PGK、GAP、TPI、CYC1、ADH2、PHO5、 CUP1、MFα1、PMA1、PDI、TEF和GUT1启动子。Romanos等人(Yeast 8：423-488(1992))提供了酵母启动子和表达载体的综述。
可操作地连接至本文公开的核酸分子上的启动子可以是组成型启 动子或诱导型启动子。诱导型启动子是在结合转录因子后指导在提高的 或降低的速率进行转录的启动子。本文使用的转录因子包括可以结合启 动子的调节或控制区并从而影响转录的任意因子。通过将宿主暴露于诱 导物或从宿主细胞培养基去除诱导物，可以控制宿主细胞内转录因子的 合成或启动子结合能力。因此，为了调节诱导型启动子的表达，将诱导 物加入宿主细胞培养基中，或从宿主细胞培养基中去除诱导物。这样的 诱导物可以包括糖、磷酸盐、醇、金属离子、激素、热、冷等。例如， 常用于酵母的诱导物是葡萄糖、半乳糖等。
选择的转录终止序列是可在选择的特定宿主细胞中起作用的那些。 例如，当使用酵母宿主细胞例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或巴氏毕赤 酵母时，在本发明的表达载体中使用酵母转录终止序列，而真菌转录终 止序列用于诸如黑曲霉、粗糙脉孢菌或里氏木霉的宿主细胞中。转录终 止序列包括、但不限于酿酒酵母CYC转录终止序列(ScCYC TT)、巴氏 毕赤酵母ALG3转录终止序列(ALG3 TT)和巴氏毕赤酵母PMA1转录终 止序列(PpPMA1 TT)。
本发明的表达载体也可以编码选择标记。选择标记是赋予宿主细胞 可鉴别的性状的遗传功能，所以用携带选择标记的载体转化的细胞可以 与未转化的细胞区分开。将选择标记包含进载体中，也可以用于确保在 宿主细胞群体中保持与该标记有关的遗传功能。这样的选择标记可以赋 予任意可容易地鉴别的显性性状，例如抗药性、合成或代谢细胞营养素 的能力等。
酵母选择标记包括抗药性标记和允许酵母宿主细胞合成基本细胞 营养素例如氨基酸的遗传功能。常用于酵母中的抗药性标记包括氯霉 素、卡那霉素、甲氨蝶呤、G418(geneticin)、Zeocin等。允许酵母宿主 细胞合成基本细胞营养素的遗传功能可以用于可得到的在对应的基因 组功能中具有营养缺陷型突变的酵母菌株。常见的酵母选择标记会提供 合成亮氨酸(LEU2)、色氨酸(TRP1和TRP2)、尿嘧啶(URA3、UPA5、 UPA6)、组氨酸(HIS3)、赖氨酸(LYS2)、腺嘌呤(ADE1或ADE2)、等的遗 传功能。其它酵母选择标记包括来自酿酒酵母的ARR3基因，它将亚砷 酸盐抗性赋予在有亚砷酸盐存在下培养的酵母细胞(Bobrowicz等人， Yeast，13：819-828(1997)；Wysocki 等人，J.Biol.Chem. 272：30061-066(1997))。许多合适的整合位点包括在美国公开申请号 20070072262中列举的那些，包括已知的酿酒酵母和其它酵母或真菌的 基因座的同系物。
因此，本发明的表达载体可以编码选择标记，后者可用于在培养物 中存在的细胞群体内鉴别和维持含有载体的宿主细胞。在有些情况下， 也可以使用选择标记来扩增表达载体的拷贝数。诱导本发明的表达载体 转录生成编码过表达的基因产物或异源伴侣蛋白的RNA后，细胞因子 翻译RNA，生成基因产物或异源伴侣蛋白。
在酵母和其它真核生物中，如下启动信使RNA(mRNA)的翻译：核 糖体结合mRNA的5′帽子，并且核糖体沿着mRNA迁移到第一个AUG 起始密码子，在这里开始合成多肽。酵母和哺乳动物细胞中的表达通常 不需要核糖体结合位点和起始密码子之间存在特定数目的核苷酸，而在 原核表达系统中有时则需要。但是，对于酵母或哺乳动物宿主细胞中的 表达，mRNA中的第一个AUG密码子优选地是希望的翻译起始密码子。
此外，当在酵母宿主细胞中进行表达时，长非翻译前导序列(例如 超过50-100个核苷酸)的存在，会减少mRNA的翻译。酵母mRNA前 导序列具有约50个核苷酸的平均长度，富含腺嘌呤，具有微小的二级 结构，且几乎总是使用第一个AUG作为起始密码子。由于不具有这些 特征的前导序列可以降低蛋白翻译的效率，酵母前导序列优选地用于在 酵母宿主细胞中表达过表达的基因产物或伴侣蛋白。许多酵母前导序列 的序列是已知的，且是技术人员可得到的，例如，通过参考Cigan等人 (Gene 59：1-18(1987))。
除了启动子、核糖体结合位点和起始密码子的位置以外，可以影响 得到的表达水平的因素包括可复制的表达载体的拷贝数。载体的拷贝数 通常由载体的复制起点和与其结合的任意顺式作用控制元件决定。例 如，通过诱导从紧邻着丝粒的启动子转录，可以增加编码受调节的着丝 粒的酵母附加体载体的拷贝数。此外，在酵母载体中编码酵母FLP功能， 也可以增加载体的拷贝数。
通过化合来自可得到的载体的DNA片段，通过合成编码这样的调 控元件的核酸分子，或通过克隆新的调控元件并将其放入本发明的载体 中，本领域技术人员也可以容易地设计和制备包含上述序列的表达载 体。制备表达载体的方法是众所周知的。在众多关于基因工程的标准实 验室手册中的任一本中，可以发现过表达DNA的方法。
通过将异源伴侣蛋白编码区以适当方向连接至启动子和用于控制 基因表达的其它序列元件，可以制备本发明的表达载体。构建本发明的 表达载体后，将这样的载体转化进宿主细胞，在这里可以表达过表达的 基因产物和异源伴侣蛋白。用表达载体转化酵母和其它低等真核细胞的 方法是众所周知的，技术人员可以容易地得到。例如，通过几种方法中 的任一种，包括醋酸锂、原生质球、电穿孔和类似的方法，可以将表达 载体转化进酵母细胞。
可以与酵母可复制的表达载体一起使用的酵母宿主细胞包括能分 泌的任意野生型或突变型酵母菌株。这样的菌株可以源自酿酒酵母、多 形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、巴氏毕赤酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶 氏酵母和有关的酵母物种。一般而言，有用的突变型酵母菌株包括具有 遗传缺陷的菌株，所述遗传缺陷可以与编码选择标记的酵母载体组合使 用。许多类型的酵母菌株可以从下述单位得到：Yeast Genetics Stock Center(Donner Laboratory，University of California，Berkeley，Calif. 94720)，the American Type Culture Collection(12301Parklawn Drive， Rockville，Md.20852，hereinaner ATCC)，the National Collection of Yeast Cultures(Food Research Institute，Colney Lane，Norwich NR4 7UA，UK)和 the Centraalbureau voor Schimmelcultures(Yeast Division，Julianalaan 67a， 2628 BC Delft，Netherlands)。
一般而言，低等真核生物例如酵母可用于表达糖蛋白，因为它们可 以经济地培养，提供高产量，且在适当修饰时，能适当糖基化。酵母具 体地会提供确定的遗传学，这可以实现快速转化、测试过的蛋白定位测 量和容易的基因敲除技术。合适的载体具有表达控制序列，例如启动子， 包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，和复制起点、终止序列等，视 需要而定。
多种酵母例如乳酸克鲁维酵母、巴氏毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和多 形汉逊酵母，可以用于细胞培养，因为它们能生长至高细胞密度，并分 泌大量重组蛋白。同样，丝状真菌例如黑曲霉、镰孢菌属、粗糙脉孢菌 和其它真菌，可以用于在工业规模生产本发明的糖蛋白。
低等真核生物，尤其是酵母，能被遗传地修饰，从而使得它们表达 的糖蛋白中的糖基化模式是人样的或人源化的。这可以通过消除选定的 内源糖基化酶和/或提供外源酶来实现，如Gerngross等人，US 20040018590所述。例如，可以选择或者工程化宿主细胞以消除1，6-甘 露糖基转移酶活性，否则其会把甘露糖残基添加到糖蛋白的N-聚糖上。
在一个实施方案中，宿主细胞另外包含与细胞靶向信号肽融合的 α1，2-甘露糖苷酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不结合该催化结 构域，选择它用于把α1，2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的内质网或高尔 基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会生成包含 Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如，主要包含Man5GlcNAc2糖形 的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利号7,029,872和美国公开专利申 请号2004/0018590和2005/0170452公开了能生产包含Man5GlcNAc2糖 形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。
在另一个实施方案中，刚刚提及的宿主细胞另外包含与细胞靶向信 号肽融合的GlcNAc转移酶I(GnT I)催化结构域，所述细胞靶向信号肽 通常不结合该催化结构域，选择它用于把GlcNAc转移酶I活性靶向 宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高 尔基体，会生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如， 主要包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。例如，美国 专利号7,029,872和美国公开专利申请号2004/0018590和2005/0170452 公开了能生产包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物 宿主细胞。可以在体外用hexaminidase处理在上述细胞中生成的糖蛋白， 以生产包含Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一个实施方案中，刚刚提及的宿主细胞另外包含与细胞靶向信 号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不结 合该催化结构域，选择它用于把甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的内 质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会生 成包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如，主要包含 GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872 和美国公开专利申请号2004/0230042公开了表达甘露糖苷酶II酶且能 生产主要具有GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿 主细胞。可以在体外用hexaminidase处理在上述细胞中生成的糖蛋白， 以生产包含Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一个实施方案中，刚刚提及的宿主细胞另外包含与细胞靶向信 号肽融合的GlcNAc转移酶II(GnT II)催化结构域，所述细胞靶向信号 肽通常不结合该催化结构域，选择它用于把GlcNAc转移酶II活性靶 向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或 高尔基体，会生成包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例 如，主要包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。美国 专利号7,029,872和美国公开专利申请号2004/0018590和2005/0170452 公开了能生产包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生 物宿主细胞。可以在体外用hexaminidase处理在上述细胞中生成的糖蛋 白，以生产包含Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一个实施方案中，刚刚提及的宿主细胞另外包含与细胞靶向信 号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不结 合该催化结构域，选择它用于把半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的内 质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会生 成包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的 重组糖蛋白或其混合物，例如，主要包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖 形或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物或其混合物。 美国专利号7,029,872和美国公开专利申请号2006/0040353公开了能生 产包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细 胞。可以在体外用半乳糖苷酶处理在上述细胞中生成的糖蛋白，以生产 包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如主要包含 GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。
在另一个实施方案中，刚刚提及的宿主细胞另外包含与细胞靶向信 号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不结合 该催化结构域，选择它用于把唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的内质网 或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会生成主 要包含NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形或 NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白或其混合物。对于 低等真核生物宿主细胞，例如酵母和丝状真菌，有用地宿主细胞另外包 含用于提供CMP-唾液酸的途径，所述CMP-唾液酸用于转移至N-聚糖。 美国公开专利申请号2005/0260729公开了遗传地工程化低等真核生物 使其具有CMP-唾液酸合成途径的方法，美国公开专利申请号 2006/0286637公开了遗传地工程化低等真核生物来生产唾液酸化的糖 蛋白的方法。可以在体外用神经氨酸酶处理在上述细胞中生成的糖蛋 白，以生产主要包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形或 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白或其混合物。
任一种前述的宿主细胞可以另外包含一种或更多种选自下述的 GlcNAc转移酶：GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX，以生 产具有对分的(GnT III)和/或多触角的(GnT IV、V、VI，和IX)N-聚糖结构 的糖蛋白，例如在美国公开专利申请号2004/074458和2007/0037248公 开的那些。
在其它实施方案中，生产主要包含GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的 糖蛋白的宿主细胞另外包含与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶 催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不结合该催化结构域，选择它用 于把半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋 白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会生成主要包含 GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一个实施方案中，刚刚提及的生产主要包含 GalGlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞另外包含与细胞 靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常 不结合该催化结构域，选择它用于把唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的 内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会 生成包含NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
各种前述宿主细胞另外包含一种或更多种糖运载体，例如 UDP-GlcNAc运载体(例如，乳酸克鲁维酵母和小鼠UDP-GlcNAc运载 体)、UDP-半乳糖运载体(例如，果蝇UDP-半乳糖运载体)和CMP-唾液 酸运载体(例如，人唾液酸运载体)。因为低等真核生物宿主细胞例如酵 母和丝状真菌缺乏上述运载体，优选地将低等真核生物宿主细胞例如酵 母和丝状真菌遗传地工程化成包含上述运载体。
在上述宿主细胞的其它实施方案中，进一步遗传地工程化宿主细 胞，通过去除或破坏β-甘露糖基转移酶基因(BMT2)(参见，美国公开专 利申请号2006/0211085)，消除具有α-甘露糖苷酶抗性的N-聚糖的糖蛋 白，通过去除或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4B中的一 个或二者(参见例如，美国专利号7,198,921和7,259,007)，消除具有磷 酸甘露糖残基的糖蛋白。在上述宿主细胞的其它实施方案中，进一步遗 传地修饰宿主细胞，消除糖蛋白的O-糖基化：通过去除或破坏蛋白O- 甘露糖基转移酶(Dol-P-Man：蛋白(Ser/Thr)甘露糖基转移酶基因)(PMTs) 中的一个或二者(参见美国专利号5,714,377)，或在有抑制剂例如Pmt-1、 Pmti-2和Pmti-3存在下生长(公开的国际申请号WO 2007061631)，或 二者。
因而，提供了已经遗传地修饰来生产糖蛋白的宿主细胞，其中在其 上面存在的主要的N-聚糖包括、但不限于Man8GlcNAc2， Man7GlcNAc2，Man6GlcNAc2，Man5GlcNAc2，GlcNAcMan5GlcNAc2， GalGlcNAcMan5GlcNAc2，NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2， Man3GlcNAc2，GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2， Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2， NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。另外包括生产糖蛋白的 宿主细胞，所述糖蛋白在其上面具有前述N-聚糖的特定混合物。
在下面的实施例中，在巴氏毕赤酵母种的宿主细胞中表达异源人蛋 白。这些实施例用本发明的具体实施方案证实了本发明，决不应理解为 限制性的。技术人员在阅读本文的公开内容和实施例后会认识到，可以 对所述方法和材料作出许多变化、修饰和改进，而不偏离本发明的实践。
实施例1
本实施例表明，使用其中已经灭活编码内源PDI1的基因并替换为 编码人PDI的表达盒的宿主细胞，增强了巴氏毕赤酵母中异源人蛋白的 表达。本实施例进一步表明，这些宿主细胞生成具有减少的O-糖基化的 重组抗体。
如下构建表达/整合质粒载体pGLY642，并显示在图8中，其包含 编码人PDI蛋白的表达盒和使质粒载体靶向巴氏毕赤酵母PDI1基因座 的核酸分子，用于使用编码人PDI的核酸分子替换编码巴氏毕赤酵母 PDI1的基因。通过PCR扩增编码人PDI的cDNA，其中使用引物 hPDI/UP1：5′AGCGCTGACGCCCCCGAGGAGGAGGACCAC 3′(SEQ ID NO：1)和hPDI/LP-PacI：5′CCTTAATTAATTACAGTTCATCATG CACAGCTTTCTGATCAT 3′(SEQ ID NO：2)，Pfu turbo DNA聚合酶 (Stratagene，La Jolla，CA)和人肝cDNA(BD Bioscience，San Jose，CA)。 PCR条件是，1个在95℃持续2分钟的循环，25个在95℃持续20秒、 在58℃持续30秒和在72℃持续1.5分钟的循环，随后是1个在72℃持 续10分钟的循环。将得到的PCR产物克隆进质粒载体pCR2.1，制备质 粒载体pGLY618。人PDI的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：39 和40)显示在表11中。
巴氏毕赤酵母PDI1的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：41 和42)显示在表11中。通过PCR扩增来自巴氏毕赤酵母基因组DNA的 区域，分离包含巴氏毕赤酵母PDI1 5′和3′区域的核酸分子。使用引物 PB248：5′ATGAATTCAGGCCATATCGGCCATTGTTTACTGTGCG CCCACAGTAG 3′(SEQ ID NO：3)；PB249：5′ ATGTTTAAACGTGAGGATTACTGGTGATGAAAGAC 3′(SEQ ID NO： 4)，扩增5′区域。使用引物PB250：5′AGACTAGTCTATTTG GAGACATTGACGGATCCAC 3′(SEQ ID NO：5)；PB251：5′ ATCTCGAGAGGCCATGCAGGCCAACCACAAGATGAATCAAATTTTG -3′(SEQ ID NO：6)，扩增3′区域。使用巴氏毕赤酵母菌株NRRL-Y11430 基因组DNA进行PCR扩增。PCR条件是，1个在95℃持续2分钟的循 环，25个在95℃持续30秒、在55℃持续30秒和在72℃持续2.5分钟 的循环，随后是1个在72℃持续10分钟的循环。将得到的PCR片段 PpPDI1(5′)和PpPDI1(3′)分别克隆进质粒载体pCR2.1，分别制备质粒载 体pGLY620和pGLY617。为了构建pGLY678，分别用使质粒载体 pGLY678靶向PDI1基因座并破坏PDI1基因座的表达的DNA片段 PpPDI(5′)和PpPDI(3′)，替换使质粒载体靶向巴氏毕赤酵母ARG3基因座 的整合质粒载体pGLY24的DNA片段PpARG3-5′和PpARG-3′。然后将 编码人PDI的核酸分子克隆进质粒载体pGLY678，生成质粒载体 pGLY642，其中编码人PDI的核酸分子置于巴氏毕赤酵母GAPDH启动 子(PpGAPDH)的控制下。如下构建表达/整合质粒载体pGLY642：将编 码酿酒酵母α交配因子前信号肽(ScαMF前信号肽(SEQ ID NO：28)的核 酸分子(SEQ ID NO：27)连接进用NotI和PacI消化的质粒载体pGLY678， 所述核酸分子具有在5′末端的NotI限制性内切酶位点和平整的3′末端 以及包含编码人PDI的核酸分子的表达盒，该表达盒用AfeI和PacI从 质粒载体pGLY618释放出来，生成具有平整的5′末端和在3′末端的PacI 位点的核酸分子。得到的整合/表达质粒载体pGLY642包含，可操作地 连接至巴氏毕赤酵母启动子的编码人PDI/ScαMF前信号肽融合蛋白的 表达盒，和使质粒载体靶向巴氏毕赤酵母PDI1基因座、用于破坏PDI1 基因座和使该表达盒整合进PDI1基因座的核酸分子序列。图8解释了 质粒载体pGLY642的构建。ScαMF前信号肽的核苷酸和氨基酸序列分 别如SEQ ID NO：27和28所示。
如下构建编码人ERO1α蛋白的表达/整合载体pGLY2232，并显示 在图9中。通过GeneArt AG(Regensburg，Germany)，合成编码人ERO1α 蛋白的核酸分子，并用于构建质粒载体pGLY2224。人ERO1α蛋白的核 苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：43和44)显示在表11中。使用限 制性内切酶AfeI和FseI，从质粒载体中释放出编码人ERO1α蛋白的核 酸分子，然后用如上所述具有5′NotI和3′平整末端的编码ScαMP前信 号肽的核酸分子连接进用NotI和FseI消化的质粒载体pGLY2228。质粒 载体pGLY2228也包括包含巴氏毕赤酵母PRB1基因的5′和3′区域(分别 是PpPRB1-5′和PpPRB1-3′区域)的核酸分子。用BglII和NotI消化得到 的质粒载体pGLY2230，然后连接含有巴氏毕赤酵母PDI1启动子(PpPDI 启动子)的核酸分子，后者已经从BglII和NotI消化的质粒载体pGLY2187 得到。PpPDI启动子的核苷酸序列是
5′-AACACGAACACTGTAAATAGAATAAAAGAAAACTTGGATAGTAG AACTTCAATGTAGTGTTTCTATTGTCTTACGCGGCTCTTTAGATTGC AATCCCCAGAATGGAATCGTCCATCTTTCTCAACCCACTCAAAGAT AATCTACCAGACATACCTACGCCCTCCATCCCAGCACCACGTCGCG ATCACCCCTAAAACTTCAATAATTGAACACGTACTGATTTCCAAAC CTTCTTCTTCTTCCTATCTATAAGA-3′(SEQ ID NO：59)。得到的质粒载 体pGLY2232是表达/整合载体，其含有编码在巴氏毕赤酵母PDI1启动 子控制下的人ERO1α融合蛋白的表达盒，且包括巴氏毕赤酵母PRB1 基因的5′和3′区域，使质粒载体靶向基因组的PRB1基因座，用于破坏 PRB1基因座并使表达盒整合进PRB1基因座。图9解释了质粒载体 pGLY2232的构建。
如下构建编码人GRP94蛋白的表达/整合载体pGLY2233，并显示 在图10中。使用引物hGRP94/UP1：5’-AGCGC TGACGATGAAGTTGATGTGGATGGTACAGTAG-3′；(SEQ ID NO：15)； 和hGRP94/LP1：5’-GGCCG GCCTT ACAAT TCATC ATGTT CAGCT GTAGA TTC 3′；(SEQ ID NO：16)，从人肝cDNA(BD Bioscience)PCR扩 增人GRP94。PCR条件是，1个在95℃持续2分钟的循环，25个在95 ℃持续20秒、在55℃持续20秒和在72℃持续2.5分钟的循环，随后是 1个在72℃持续10分钟的循环。将PCR产物克隆进质粒载体pCR2.1， 制备质粒载体pGLY2216。人GRP94的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：45和46)显示在表11中。
使用AfeI和FseI，从质粒载体pGLY2216释放编码人GRP94的核 酸分子。然后将核酸分子连接至如上所述具有NotI和平整末端的编码 ScαMP前信号肽的核酸分子以及用NotI和FseI消化的携带包含巴氏毕 赤酵母PEP4 5′和3′区域(分别是PpPEP4-5′和PpPEP4-3′区域)的核酸分子 的质粒载体pGLY2231，制备质粒载体pGLY2229。用BglII和NotI消化 质粒载体pGLY2229，用BglII和NotI从质粒载体pGLY2187取出含有 PpPDI1启动子的DNA片段，将该DNA片段连接进pGLY2229，制备质 粒载体pGLY2233。质粒载体pGLY2233编码在巴氏毕赤酵母PDI启动 子控制下的人GRP94融合蛋白，且包含巴氏毕赤酵母PEP4基因的5′ 和3′区域，以使质粒载体靶向基因组的PEP4基因座，用于破坏PEP4 基因座和使表达盒整合进PEP4基因座。图10解释了质粒载体 pGLY2233的构建。
如下构建质粒载体pGLY1162、pGLY1896和pGFI207t。所有里氏 木霉α-1，2-甘露糖苷酶表达质粒载体都源自pGFI165，它编码与酿酒酵 母αMAT前信号肽融合的里氏木霉α-1，2-甘露糖苷酶催化结构域(参见 公开的国际申请号WO2007061631)，这里表达是在巴氏毕赤酵母GAP 启动子控制下，且其中质粒载体的整合是靶向巴氏毕赤酵母PRO1基因 座，使用巴氏毕赤酵母URA5基因进行选择。质粒载体pGFI165的图谱 显示在图11中。
通过用巴氏毕赤酵母AOX1(PpAOX1)启动子替换pGFI165中的 GAP启动子，制备质粒载体pGLY1162。这如下实现：分离PpAOX1启 动子作为来自pGLY2028的EcoRI(平整化)-BglII片段，并插入用NotI(平 整化)和BglII消化的pGFI165。该质粒载体整合向巴氏毕赤酵母PRO1 基因座，选择是使用巴氏毕赤酵母URA5基因。质粒载体pGLY1162的 图谱显示在图12中。
质粒载体pGLY1896含有插入质粒载体pGFI165(图12)中的编码与 酿酒酵母MNN2膜插入前导肽融合蛋白融合的小鼠α-1，2-甘露糖苷酶催 化结构域的表达盒(参见Choi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100： 5022(2003))。这如下实现：从用XhoI(和使末端平整)和PmeI消化的 pGLY1433，分离GAPp-ScMNN2-小鼠MNSI表达盒，并将该片段插入 用PmeI消化的pGFI165。该质粒载体整合向巴氏毕赤酵母PRO1基因座， 选择是使用巴氏毕赤酵母URA5基因。质粒载体pGLY1896的图谱显示 在图11中。
质粒载体pGFI207t类似于pGLY1896，但是用赋予亚砷酸盐抗性的 酿酒酵母ARR3(ScARR3)基因替换UPA5选择标记。这如下实现：从用 AscI(使AscI末端平整)和BglII消化的pGFI166分离ScARR3基因，将 该片段插入用SpeI(使SpeI末端平整)和BglII消化的pGLY1896。该 质粒载体整合向巴氏毕赤酵母PRO1基因座，选择是使用酿酒酵母ARR3 基因。质粒载体pGFI207t的图谱显示在图11中。
如下构建抗-DKK1抗体表达/整合质粒载体pGLY2260和 pGLY2261。抗-DKK1抗体是识别Dickkopf蛋白1的抗体，后者是参与 Wnt信号传递途径的配体。为了产生编码抗-DKK1抗体的表达/整合质 粒载体pGLY2260和pGLY2261，通过GeneArt AG，合成编码重链(HC； 含有VH+IgG2m4的融合蛋白)和轻链(LC；含有VL+Lλ恒定区的融合 蛋白)融合蛋白的密码子优化的核酸分子，每个在框架内含有编码α-淀 粉酶(来自黑曲霉)信号肽的核酸分子。α-淀粉酶信号肽的核苷酸和氨基 酸序列显示在SEQ ID NO：33和34。HC的核苷酸序列显示在SEQ ID NO： 51，氨基酸序列显示在SEQ ID NO：52。LC的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：53，氨基酸序列显示在SEQ ID NO：54。IgG2m4同种型已经公开在 美国公开申请号2007/0148167和美国公开申请号2006/0228349。使用独 特的5′-EcoRI和3′-FseI位点，将编码HC和LC融合蛋白的核酸分子分 别克隆进表达质粒载体pGLY1508，分别形成质粒载体pGLY1278和 pGLY1274。这些质粒载体含有Zeocin-抗性标记和TRP2整合位点和可 操作地连接至编码HC和LC融合蛋白的核酸分子上的巴氏毕赤酵母 AOX1启动子。使用BglII和BamH1，从pGLY1274取出LC融合蛋白 表达盒，并克隆进用BglII消化的pGLY1278，产生质粒载体pGLY2260， 其编码HC和LC融合蛋白并使表达盒靶向TRP2基因座，用于使表达 盒整合进TRP2基因座。质粒载体pGLY2261相对于质粒载体pGLY2260 含有一个额外的LC(图13)。
如下构建抗-ADDL抗体表达/整合质粒载体pGLY2260。抗-ADDL 抗体是识别Aβ-衍生的可扩散的配体的抗体，参见例如美国公开申请号 20070081998。为了产生表达/整合质粒载体pGLY2012，通过GeneArt AG，合成编码重链(HC；含有VH+IgG2m4)和轻链(LC；含有VL+Lλ 恒定区的融合蛋白)融合蛋白的密码子优化的核酸分子，每个在框架内含 有编码酿酒酵母转化酶信号肽的核酸分子。使用独特的5′-EcoRI和 3′-FseI位点，将编码HC和LC融合蛋白的核酸分子分别克隆进表达/ 整合质粒载体pGLY1508和pGLY1261，分别形成pGLY2011和 pGLY2010，它们含有Zeocin-抗性标记和TRP2整合位点和可操作地连 接至编码HC和LC融合蛋白的核酸分子上的巴氏毕赤酵母AOX1启动 子。使用BglII和NotI，从pGLY2011取出HC表达盒，并克隆进用BamHI 和NotI消化的pGLY2010，产生pGLY2012，其编码HC和LC融合蛋 白并使表达盒靶向TRP2基因座，用于使表达盒整合进TRP2基因座(图 14)。
如下用上述表达/整合载体转化酵母。在50mL YPD培养基(酵母浸 出物(1％)，蛋白胨(2％)，右旋糖(2％))中培养巴氏毕赤酵母菌株过夜，至 OD约0.2至6.0。在冰上温育30分钟后，通过在2500-3000rpm离心5 分钟，沉淀细胞。去除培养基，用冰冷却的无菌1M山梨醇洗涤细胞3 次，然后重新悬浮于0.5ml冰冷却的无菌1M山梨醇中。在电穿孔试 管中合并10μL线性化的DNA(5-20μg)和100μL细胞悬浮液，在冰上 温育5分钟。按照预设的巴氏毕赤酵母方案(2kV，25μF，200Ω)，在 Bio-Rad GenePulser Xcell中进行电穿孔，随后马上加入1mL YPDS恢复 培养基(YPD培养基+1M山梨醇)。使转化的细胞在室温(24℃)恢复4 小时过夜，然后把细胞涂布在选择培养基上。
如下产生细胞系，并显示在图3中。使用以前所述的方法(参见例如， Nett和Gerngross，Yeast 20：1279(2003)；Choi等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 100：5022(2003)；Hamilton等人，Science 301：1244(2003))，构建菌 株yGLY24-1(ura5Δ::MET1 och1Δ::lacZ bmt2Δ::lacZ/KlMNN2-2/ mnn4L1Δ::lacZ/MmSLC35A3 pno1Δmnn4Δ::lacZ met16Δ::lacZ)。BMT2基 因已经公开在Mille等人，J.Biol.Chem.283：9724-9736(2008)和美国公 开申请号20060211085。PNO1基因已经公开在美国专利号7,198,921， mnn4L1基因(也称作mnn4b)已经公开在美国专利号7,259,007。mnn4是 指mnn4L2或mnn4a。在基因型中，KlMNN2-2是乳酸克鲁维酵母GlcNAc 运载体，MmSLC35A3是小鼠GlcNAc运载体。URA5缺失使yGLY24-1 菌株成为尿嘧啶营养缺陷型(参见美国公开申请号2004/0229306)，并用 于构建如下的人源化伴侣蛋白菌株。尽管在本文的实施例中将不同的表 达盒整合进巴氏毕赤酵母基因组的特定基因座中，应当理解，本发明的 操作独立于用于整合的基因座。除了本文公开的那些以外的基因座可以 用于表达盒的整合。合适的整合位点包括在美国公开申请号 20070072262中列举的那些，包括酿酒酵母和其它酵母或真菌的已知基 因座的同系物。
构建了对照菌株yGLY645(PpPDI1)。菌株yGLY645表达里氏木霉 甘露糖苷酶1(TrMNS1)和小鼠甘露糖苷酶IA(MuMNS1A)，它们各自在 PpGAPDH启动子控制下组成性地表达，天然的巴氏毕赤酵母PDI1基 因座是完整的。通过用质粒载体pGLY1896(其使质粒载体靶向毕赤酵 母基因组中的脯氨酸1(PRO1)基因座)转化yGLY24-1，从菌株 yGLY24-1产生菌株yGLY645。质粒载体pGLY1896含有编码里氏木霉 甘露糖苷酶1(TrMNS1)和小鼠甘露糖苷酶IA(FB53，MuMNS1A)的表达 盒，它们各自在PpGAPDH启动子控制下组成性地表达。
为了测试在缺失内源巴氏毕赤酵母PDI1基因的情况下在巴氏毕赤 酵母细胞中表达的人PDI1的功效，建立菌株yGLY702和yGLY704。如 下构建菌株yGLY702和yGLY704(hPDI)。通过用质粒载体pGLY642(其 含有在组成型PpGAPDH启动子控制下的编码人PDI的表达盒)转化 yGLY24-1，建立菌株yGLY702。质粒载体pGLY642也含有编码巴氏毕 赤酵母URA5的表达盒，它是菌株yGLY702成为尿嘧啶原养型。通过在 5-FOA平板上反选择yGLY702，去除URA5表达盒，生成菌株yGLY704， 其中巴氏毕赤酵母PDI1基因已经被人PDI基因稳定地替换，且菌株是 尿嘧啶营养缺陷型。
通过菌落PCR，证实使用质粒载体pGLY642用人PDI对巴氏毕赤 酵母PDI1的替换，其中使用仅对PpPDI1开放读码框特异性的下述引物： PpPDI/UPi-1，5’-GGTGAGGTTGAGGTCCCAAGTGACTATCAAGGTC -3′；(SEQ ID NO：7)；PpPDI/LPi-1，5’-GACCTTGATAGTCAC TTGGGACCTCAACCTCACC-3′；(SEQ ID NO：8)；PpPDI/UPi-2，5’ CGCCAATGATGAGGATGCCTCTTCAAAGGT TGTG-3′；(SEQ ID NO：9)； 和PpPDI/LPi-2，5’-CACAACCTTTGAAGAGGCATCCTCATCATT GGCG-3′；(SEQ ID NO：10)。因而，PCR产物的缺失指示PpPDI1的敲除。 PCR条件是，1个在95℃持续2分钟的循环，25个在95℃持续20秒、 在58℃持续20秒和在72℃持续1分钟的循环，随后是1个在72℃持续 10分钟的循环。
使用另一个PCR证实pGLY642在PpPDI1基因座处的双交换，其 中使用PCR 引物：PpPDI-5’/UP，5’-GGCGATTGCATTCGCGA CTGTATC-3′；(SEQ ID NO：11)；和，hPDI-3’/LP 5’-CCTAGAGAGCGGT GGCCAAGATG-3′；(SEQ ID NO：12)。PpPDI-5′/UP引发在pGY642的 PpPDI1(5′)中不存在的PpPDI1的上游区域，hPDI-3′/LP引发pGLY642中 的人PDI开放读码框。PCR条件是，1个在95℃持续2分钟的循环，25 个在95℃持续20秒、在50℃持续30秒和在72℃持续2.5分钟的循环， 随后是1个在72℃持续10分钟的循环。
作为敲除(即双交换事件)或作为‘转入’(即质粒载体向基因组中的单 个整合)的质粒载体的整合效率，可以依赖于许多因素，包括载体和宿主 染色体DNA上的对应基因之间的同源区域的数目和长度、选择标记、 目标基因的作用和转入的基因补偿内源功能的能力。发明人发现，在有 些情况下，pGLY642作为双交换进行整合，导致人PpPDI对内源PpPDI 基因的替换，而在其它情况下，pGLY642质粒载体作为单个整合进行整 合，导致内源PpPDI1基因和人PpPDI基因都存在。为了区分这些事件， 发明人利用本文所述的序列ID NO.11至14的PCR引物。如果在 pGLY642质粒载体整合后保留PpPDI基因，指向内部PpPDI编码序列 的PpPDI-5’/UP和hPDI-3’/LP会产生扩增产物和对应的带。在敲除或双 交换的事件中，这些引物不会产生任何扩增产物，也不会看到对应的带。
用下述引物证实pGLY642的转入：编码PpPDI1的PpPDI/UPi(SEQ ID NO：7)和PpPDI/LPi-1(SEQ ID NO：8)，和编码人PDI的hPDI/UP， 5’-GTGGCCACACCAGGGGGCATGGAAC-3′；(SEQ ID NO：13)和 hPDI-3’/LP，5’-CCTAGAGAGCGGTGGCCAAG ATG-3′；(SEQ ID NO： 14)。PCR条件是，对于PpPDI1，1个在95℃持续2分钟的循环，25个 在95℃持续20秒、在58℃持续20秒和在72℃持续1分钟的循环，随 后是1个在72℃持续10分钟的循环，对于人PDI，1个在95℃持续2 分钟的循环，25个在95℃持续20秒、在50℃持续30秒和在72℃持续 2.5分钟的循环，随后是1个在72℃持续10分钟的循环。
菌株yGLY714是含有巴氏毕赤酵母PDI 1基因座且表达人PDI的菌 株，是通过单个交换事件进行整合的结果。如下从菌株yGLY24-1建立 菌株yGLY714：把质粒载体pGLY642(其包含在巴氏毕赤酵母GAPDH 启动子的组成性调控下的人PDI基因)整合进yGLY24-1的PpPDI 5′UTR 区域。该载体的整合不会破坏巴氏毕赤酵母PDI1基因座的表达。因而， 在yGLY714中，在有巴氏毕赤酵母内源PDI1存在下，组成性地表达人 PDI。
如下建立菌株yGLY733：把包含编码可操作地连接至巴氏毕赤酵母 AOX1启动子的里氏木霉甘露糖苷酶(TrMNS1)的表达盒 (PpAOX1-TrMNS1)的质粒载体pGLY1162转化进yGLY704的PRO1基 因座。该菌株具有被编码人PDI1的表达盒替换的编码巴氏毕赤酵母PD1 的基因，具有整合进PRO1基因座中的PpAOX1-TrMNS1表达盒，且是 URA5原养型。当在有甲醇存在下培养细胞时，PpAOX1启动子会实现 过表达。
如下构建菌株yGLY762：把编码TrMNS1和小鼠甘露糖苷酶 IA(MuMNS1A)(它们各自可操作地连接至质粒载体pGFI207t中的巴氏 毕赤酵母GAPDH启动子)的表达盒整合进菌株yGLY733的巴氏毕赤酵 母基因组中的5′PRO1基因座不翻译区。该菌株具有被编码人PDI的表 达盒替换的编码巴氏毕赤酵母PDI1的基因，具有整合进PRO1基因座 中的PpGAPDH-TrMNS1和PpGAPDH-MuMNS1A表达盒，且是URA5原 养型。
菌株yGLY730是菌株yGLY733的对照菌株。如下制备菌株 yGLY730：将包含编码可操作地连接至巴氏毕赤酵母AOX1启动子的里 氏木霉甘露糖苷酶(TrMNS1)的表达盒(PpAOX1-TrMNS1)的pGLY1162 转化进yGLY24-1的PRO1基因座。该菌株具有巴氏毕赤酵母PDI1，具 有整合进PRO1基因座中的PpAOX1-TrMNS1表达盒，且是URA5原养 型。
如下构建对照菌株yGLY760：把编码TrMNS1和小鼠甘露糖苷酶 IA(MuMNS1A)(它们各自可操作地连接至质粒载体pGFI207t中的巴氏 毕赤酵母GAPDH启动子)的表达盒整合进对照菌株yGLY730的巴氏毕 赤酵母基因组中的5′PRO1基因座不翻译区。该菌株具有编码巴氏毕赤 酵母PDI1的基因，具有整合进PRO1基因座中的PpGAPDH-TrMNS1 和PpGAPDH-MuMNS1A表达盒，且是URA5原养型。
如下制备菌株yGLY2263：使用使编码抗-DKK1抗体的表达盒靶向 TRP2基因座的整合/表达质粒pGLY2260转化菌株yGLY645。
通过在5-FOA平板上反选择yGLY733，产生菌株yGLY2674。该 菌株具有被编码人PDI1的表达盒替换的编码巴氏毕赤酵母PD1的基 因，具有整合进PRO1基因座中的PpAOX1-TrMNS1表达盒，且是URA5 营养缺陷型。
通过在5-FOA平板上反选择yGLY762，产生菌株yGLY2677。该 菌株具有被编码人PDI1的表达盒替换的编码巴氏毕赤酵母PD1的基因， 具有整合进PRO1基因座中的PpAOX1-TrMNS1表达盒，具有整合进 PRO1基因座中的PpGAPH-TrMNS1和PpGAPDH-MuMNS1A表达盒， 且是URA5营养缺陷型。
通过将编码人ERO1α蛋白的质粒载体pGLY2232整合进PRB1基因 座，产生菌株yGLY2690。该菌株具有被编码人PDI1的表达盒替换的编 码巴氏毕赤酵母PD1的基因，具有整合进PRO1基因座中的 PpAOX1-TrMNS1表达盒、整合进PRB1基因座的人ERO1α表达盒，且 是URA5原养型。
通过将编码人GRP94蛋白的质粒载体pGLY2233整合进PEP4基因 座，产生菌株yGLY2696。该菌株具有被编码人PDI1的表达盒替换的编 码巴氏毕赤酵母PD1的基因，具有整合进PRO1基因座中的 PpAOX1-TrMNS1表达盒，具有整合进PRO1基因座中的 PpGAPDH-TrMNS1和PpGAPDH-MuMNS1A表达盒，具有整合进PEP4 基因座的人GRP94，且是URA5原养型。
如下制备菌株yGLY3628：用整合/表达质粒pGLY2261转化菌株 yGLY2696，所述质粒将编码抗-DKK1抗体的表达盒靶向TRP2基因座。
如下制备菌株yGLY3647：用整合/表达质粒pGLY2261转化菌株 yGLY2690，所述质粒将编码抗-DKK1抗体的表达盒靶向TRP2基因座。
将在表达人PDI蛋白来替代巴氏毕赤酵母PDI1蛋白的菌株中生产 的蛋白的产量，与在表达人和巴氏毕赤酵母PDI蛋白的菌株中和在仅表 达巴氏毕赤酵母PDI1蛋白的菌株中生产的相同蛋白的产量相比较。
评价表达人PDI蛋白来替代巴氏毕赤酵母PDI1蛋白的菌株 yGLY733、表达人和巴氏毕赤酵母PDI1蛋白的菌株yGLY714和仅表达 巴氏毕赤酵母PDI1蛋白的菌株yGLY730，以确定使用人PDI蛋白替换 巴氏毕赤酵母PDI1蛋白对菌株生产的抗体效价的影响。用编码抗-DKK1 抗体的质粒载体pGLY2261转化所有3种酵母菌株。
根据Rasband，ImageJ，U.S.National Institutes of Health，Bethesda， Maryland，USA，1997-2007；和Abramoff，等人，Biophotonics International，11：36-42(2004)所述的NIH ImageJ软件方法，从深孔平板 筛选测定培养物生长的效价提高。简而言之，基本上如下进行96深孔 平板中的抗体筛选。将转化体接种至600μL BMGY，在24℃、在840 rpm、在微量培养板振荡器(Micro-Plate Shaker)中培养2天。将得到 的50μL种子培养物转移至2个96-孔平板，每个孔含有600μL新鲜的 BMGY，在与上面相同的培养条件下培养2天。将2个繁殖平板合并成 一个，然后在1000rpm离心5分钟，在每孔600μL BMMY中诱导细胞 沉淀物2天，然后使用蛋白A珠子，纯化离心的400μL澄清上清液。 对纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳，使用NIH ImageJ软件分析蛋白带 的密度。
代表性结果显示在图1中。图1(图B)表明，尽管表达巴氏毕赤酵母 PDI1和人PDI的yGLY714的产量比对照(yGLY730)(图A)提高了2倍， 仅表达人PDI的菌株yGLY733的产量增加了5倍(图C)。结果也显示在 表1中。
用编码抗-ADDL抗体的质粒载体pGLY2012转化菌株yGLY730和 yGLY733。通过如上所述的96深孔筛选，评价转化的菌株，使用下述 方法，在500mL SixFors和3L发酵罐中生产抗体。在下述条件下，在 0.5L罐(Sixfors multi-fermentation system，ATR Biotech，Laurel，MD) 中进行生物反应器筛选(SIXFORS)：pH6.5，24℃，0.3SLPM，起始搅拌 器速度为550rpm，起始工作体积为350mL(330mL BMGY培养基和 20mL接种物)。接种后1小时，使用IRIS multi-发酵罐软件(ATR Biotech，Laurel，MD)线性地增加搅拌器速度，经10小时从550rpm增 加至1200rpm。从琼脂平板直接接种种子培养物(200mL BMGY，在1L 带有挡板的烧瓶中)。在24℃温育种子烧瓶72小时，达到光密度 (OD600)95至100。给发酵罐接种200mL静止期烧瓶培养物，后者通过 离心浓缩至20mL。该批次阶段在完成起始装载甘油(18-24h)发酵时结 束，随后是通过加入17mL甘油补料溶液(50％[w/w]甘油，5mg/L生物 素，12.5mL/L PTM1盐(65g/L FeSO4·7H2O，20g/L ZnCl2，9g/L H2SO4， 6g/L CuSO4·5H2O，5g/L H2SO4，3g/L MnSO4·7H2O，500mg/L CoCl2·6H2O，200mg/L NaMoO4·2H2O，200mg/L生物素，80mg/L NaI， 20mg/L H3BO4))启动的第二批次阶段。溶解氧刺突信号指示第二批次阶 段结束后，通过在0.6g/h补加甲醇补料溶液(100％MeOH 5mg/L生物 素，12.5mL/L PTM1)32-40小时，开始诱导期。通过离心收获培养物。
在3L(Applikon，Foster City，CA)和15L(Applikon，Foster City，CA) 玻璃生物反应器和40L(Applikon，Foster City，CA)不锈钢原位蒸汽消毒 生物反应器中，进行生物反应器培养(3L)。通过在1％体积比用冷冻储存 瓶直接接种BMGY培养基，制备种子培养物。在24℃温育种子烧瓶48 小时，得到20±5的光密度(OD600)，以确保细胞在转移后指数地生长。 每升培养培养基含有40g甘油、18.2g山梨醇、2.3g K2HPO4、11.9g KH2PO4、10g酵母浸出物(BD，Franklin Lakes，NJ)、20g蛋白胨(BD， Franklin Lakes，NJ)、4x10-3g生物素和13.4g酵母氮碱基(BD，Franklin Lakes，NJ)。以10％体积比的种子/起始培养基，接种生物反应器。在下 述条件下，以补料-批次模式进行培养：温度设定在24±0.5℃，用NH4OH 把pH控制在6.5±0.1，通过级联加入O2时的搅拌速率把溶解氧维持在 1.7±0.1mg/L。气流速度维持在0.7vvm。耗尽起始装载甘油(40g/L)后， 在最大生长速率的50％指数地补加含有12.5mL/L PTM1盐的50％甘油 溶液8小时，直到达到250g/L湿细胞重量。30分钟饥饿阶段后开始诱 导，此时指数地补加甲醇，以维持0.01h-1的比生长速率。当达到150 mM/L/h的摄氧速率时，甲醇补料速率保持恒定，以避免氧限制。结果 显示在表2中，证实抗体效价增加了约3倍。
也分析抗体，以确定用编码人PDI的表达盒替换巴氏毕赤酵母PDI1 基因是否对抗体的O-糖基化有影响。一般而言，预期用于人的抗体的 O-糖基化是不希望的。
使用如下的Dionex-HPLC(HPAEC-PAD)，进行O-聚糖测定。为了 测量O-糖基化减少，使用蛋白A色谱法(Li等人Nat.Biotechnol. 24(2)：210-5(2006))，从生长培养基纯化蛋白，并通过碱性消除(β-消 除)(Harvey，Mass Spectrometry Reviews 18：349-451(1999))，从蛋白释 放和分离O-聚糖。该过程也将释放的O-聚糖(寡甘露糖或甘露糖)的新形 成的还原端还原成甘露醇。甘露醇基团因而用作每个O-聚糖的独特指示 物。β消除需要在100μL体积的PBS缓冲液中含有0.5nmol或更多的 蛋白。用25μL碱氢硼化物试剂处理样品，在50℃温育16小时。加入 约20uL阿糖醇内部标准品，然后加入10μL冰醋酸。然后通过含有 SEPABEADS和AG 50W-X8树脂的Millipore过滤器离心样品，并用水 洗涤。将样品(包括洗液)转移至塑料自动取样瓶，在离心蒸发器中蒸 发至干燥。将150μL 1％AcOH/MeOH加入样品，在离心蒸发器中蒸发 样品至干燥。将该最后一步重复另外5次。加入200μL水，通过与脉冲 电化学检测偶联的高pH阴离子交换色谱法-Dionex HPLC(HPAEC-PAD)，分析100μL样品。基于回收的甘露醇的量，测定 平均O-聚糖占据。
如表2所示，在用编码人PDI的表达盒替换巴氏毕赤酵母PDI1的 菌株中，O-糖基化减少。在菌株yGLY733中，O-聚糖占据(O-糖基化的 O-糖基化位点的数目)减少，且对于那些被占据的位点，由仅一个甘露糖 组成的O-聚糖的百分比增加。这些结果表明，用编码人PDI的表达盒替 换巴氏毕赤酵母PDI1，能在巴氏毕赤酵母中生产具有减少的O-糖基化 的抗体。
上述3种菌株(yGLY730，yGLY714，和yGLY733)生成具有巴氏毕赤 酵母N-糖基化模式的糖蛋白。GS 2.0菌株是已经遗传地工程化成生产主 要具有Man5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的巴氏毕赤酵母菌株。使用生产 主要具有Man5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的GS 2.0菌株，进行下述实验， 以确定用人PDI蛋白替换巴氏毕赤酵母PDI1蛋白对这些菌株生产的抗 体效价的影响。菌株yGLY2690和yGLY2696是生产主要具有 Man5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的GFI 2.0菌株，且用编码人PDI蛋白的 表达盒替换巴氏毕赤酵母PDI1基因(参见图3)。用编码抗-DKK1抗体的 质粒载体pGLY2261转化这2种菌株，生成菌株yGLY3647和 yGLY3628(参见图3)，通过上述的96深孔筛选评价菌株。使用上述的参 数，在500ml SixFors和3L发酵罐中生产抗体，以确定使用人PDI蛋白 替换巴氏毕赤酵母PDI1蛋白对菌株生产的抗体效价的影响。结果显示 在表3中。菌株yGLY2263是对照菌株，其中质粒载体pGLY2260转化 进菌株yGLY645，其生产主要具有Man5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白，且 仅表达内源PDI1基因。
表3表明，在遗传地工程化成生产主要具有Man5GlcNAc2 N-聚糖 的糖蛋白的酵母中，用编码人PDI的表达盒替换编码巴氏毕赤酵母PDI1 的基因，会提高酵母生产的抗体的效价。表3也表明，在遗传地工程化 成生产主要具有Man5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的这些菌株中，O-糖基 化占据仍然减少。另外，表3证实在用人PDI替换内源PDI1的菌株中 N-糖基化的量的增加。
实施例2
在表2和3中显示的菌株的益处是，制备用编码异源PDI的表达盒 替换内源PDI1基因的酵母菌株，不仅可以增加蛋白产量，而且可以减 少结合的O-聚糖(占据)的数目和减少不希望的Man2O-聚糖结构。与从 哺乳动物细胞培养生产的相同糖蛋白的组成相比，在酵母中生产的重组 蛋白经常表现出异常的O-糖基化结构，这反映出哺乳动物和酵母细胞的 糖基化机制之间的显著差异。这些异常的结构在人中可能是免疫原性 的。
发明人注意到，携带替代内源巴氏毕赤酵母PDI1基因的人PDI基 因的巴氏毕赤酵母宿主细胞是对PMT蛋白抑制剂的抗性更高的菌株(参 见公开的国际申请号WO2007061631)，这表明，这些菌株可能更好地适 用于耐受各种PMT基因的缺失。这是因为，在先前在巴氏毕赤酵母的 ΔOCH1/ΔPNO1/ΔPBS2菌株中制备ΔPMT敲除的尝试中，不能得到 ΔPMT1敲除和ΔPMT2敲除；推测因为它们在该遗传背景下是致死的 (未公开的结果)。可以得到ΔPMT4敲除，但是与亲代菌株相比，它们通 常仅表现出微弱的生长和较差的蛋白表达(参见图6和7)。尽管可以得 到ΔPMT5和ΔPMT6敲除，与亲代菌株相比，缺失对细胞生长或蛋白表 达无影响或影响微弱，表明这些PMT基因不能有效地减少O-糖基化。
按照Gentzsch和Tanner，EMBO J.15：25752-5759(1996)为酿酒酵母 描述的方法，其进一步描述在公开的国际申请号WO 2007061631中，在 适当的巴氏毕赤酵母菌株中建立PMT敲除酵母菌株。编码巴氏毕赤酵 母PMT1和PMT4的核酸分子显示在SEQ ID NO：47和49中。巴氏毕 赤酵母PMT1和PMT4的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：48和50中。在 下面列出了使用PCR重叠方法制备PMT缺失所用的引物和DNA模 板。
为了制备PMT1敲除，进行下述操作。建立3个PCR反应。PCR 反应A 包含引物PMT1-KO1：5′-TGAACCCATCTGTAAATAG AATGC-3′(SEQ ID NO：17)和PMT1-KO2：5′-GTGTCACCTAAATCG TATGTGCCCATTTACTGGA AGCTGCTAACC-3′(SEQ ID NO：18)，巴氏 毕赤酵母NRRL-Y11430基因组DNA作为模板。PCR反应B包含引物 PMT1-KO3：5′-CTCCCTATAGTGAGTCGTATTCATCATTGTACTTT GGTATATTGG-3′(SEQ ID NO：19)和PMT1-KO4： 5′-TATTTGTACCTGCGTCCTGTTTGC-3′(SEQ ID NO：20)，巴氏毕赤酵 母NRRL-Y11430基因组DNA作为模板。PCR反应C包含引物PR29： 5′-CACATACGATTTAGGTGACAC-3′(SEQ ID NO：21)和PR32： 5′-AATACGACTCACTATAGGGAG-3′(SEQ ID NO：22)，模板是质粒载体 pAG25(Goldstein和McCusker，Yeast 15：1541(1999))。所有3个PCR反 应的条件是，1个在98℃持续2分钟的循环，25个在98℃持续10秒、 在54℃持续30秒和在72℃持续4分钟的循环，随后是1个在72℃持续 10分钟的循环。然后在第二个PCR反应中，将来自上面的引物 PMT1-KO1+PMT1-KO4与从上面PCR反应A、B和C PCR产生的片段 相混合。PCR条件是，1个在98℃持续2分钟的循环，30个在98℃持 续10秒、在56℃持续10秒和在72℃持续4分钟的循环，随后是1个 在72℃持续10分钟的循环。
凝胶纯化在第二个PCR反应中产生的片段，并用于转化其中巴氏 毕赤酵母PDI1基因已经被替换为编码人PDI1蛋白的表达盒的适当菌 株。在含有100μg/mL诺尔丝菌素的富集培养基平板(YPD)上，选择转 化体。
为了制备PMT4敲除，进行下述操作。建立3个PCR反应。PCR 反应A包含引物PMT4-KO1：5′-TGCTCTCCGCGTGCAATAGAAACT -3′(SEQ ID NO：23)和PMT4-KO2：5′-CTCCCTATAGTGAGTCGTA TTCACAGTGTACCATCTTTCATCTCC-3′(SEQ ID NO：24)，巴氏毕赤酵 母NRRL-Y11430基因组DNA作为模板。PCR反应B包含引物 PMT4-KO3：5′-GTGTCACCTAAATCGTATGTGAACCTAACTCTAA TTCTTCAAAGC-3′(SEQ ID NO：25)和PMT4-KO4： 5′-ACTAGGGTATATAATTCCCAAGGT-3′(SEQ ID NO：26)，巴氏毕赤酵 母NRRL-Y11430基因组DNA作为模板。PCR反应C包含引物PR29： 5′-CACATACGATTTAGGTGACAC-3′(SEQ ID NO：21)和PR32： 5′-AATACGACTCACTATAGGGAG-3′(SEQ ID NO：22)，质粒载体pAG25 作为模板。
所有3个PCR反应的条件是，1个在98℃持续2分钟的循环，25 个在98℃持续10秒、在54℃持续30秒和在72℃持续4分钟的循环， 随后是1个在72℃持续10分钟的循环。
然后在第二个PCR反应中，将来自上面的引物PMT4-KO1+ PMT4-KO4与从上面PCR反应A、B和C PCR产生的片段相混合。PCR 条件是，1个在98℃持续2分钟的循环，30个在98℃持续10秒、在56 ℃持续10秒和在72℃持续4分钟的循环，随后是1个在72℃持续10 分钟的循环。
凝胶纯化在第二个PCR反应中产生的片段，并用于转化其中巴氏 毕赤酵母PDI1基因已经被替换为编码人PDI1蛋白的表达盒的适当菌 株。在含有100μg/mL诺尔丝菌素的富集培养基平板(YPD)上，选择转 化体。
为了测试菌株生产具有减少的O-糖基化的抗体的能力，构建了编码 抗-Her2抗体和抗-CD20抗体的表达载体。
表达/整合质粒载体pGLY2988含有编码抗-Her2抗体的重链和轻链 的表达盒。通过GeneArt AG，合成在N-末端与α-MAT前信号肽融合的 抗-Her2重链(HC)和轻链(LC)。合成后各自具有独特的5′EcoR1和3′Fse1 位点。抗-Her2 HC的核苷酸和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：29和 30。抗-Her2 LC的核苷酸和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：31和32。 使用5′EcoR1和3′Fse1独特位点，将编码HC和LC融合蛋白的核酸 分子片段分别亚克隆进表达质粒载体pGLY2198(含有靶向巴氏毕赤酵 母TRP2的核酸分子和Zeocin-抗性标记)，分别形成质粒载体pGLY2987 和pGLY2338。通过BamHI和NotI消化，从质粒载体pGLY2338取出在 巴氏毕赤酵母AOX1启动子和酿酒酵母Cyc终止子控制下的编码LC融 合蛋白的LC表达盒，然后将该DNA片段克隆进用BamH1和Not1消化 的质粒载体pGLY2987，从而产生最终的表达质粒载体pGLY2988(图 15)。
表达/整合质粒载体pGLY3200(除了LC和HC是具有α-淀粉酶信号 序列的抗-CD20以外，图谱与pGLY2988相同)。抗-CD20序列是来自 GenMab序列2C6，但是轻链(LC)框架序列与来自VKappa 3种系的那些 相匹配。通过GeneArt AG，合成在N-末端与α-淀粉酶(来自黑曲霉)信号 肽融合的重链(HC)和轻链(LC)可变序列。合成后各自具有独特的5′ EcoR1和3′KpnI位点，这允许将可变区直接克隆进含有IgG1和Vκ恒 定区的表达载体。抗-CD20 HC的核苷酸和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：37和38。抗-CD20 LC的核苷酸和氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：35和36。将HC和LC融合蛋白分别亚克隆进IgG1质粒载体 pGLY3184和V Kappa质粒载体pGLY2600(每个质粒载体含有靶向巴氏 毕赤酵母TRP2的核酸分子和Zeocin-抗性标记)，分别形成质粒载体 pGLY3192和pGLY3196。通过BamHI和NotI消化，从质粒载体 pGLY3196取出在巴氏毕赤酵母AOX1启动子和酿酒酵母Cyc终止子控 制下的编码LC融合蛋白的LC表达盒，然后将该DNA片段克隆进用 BamH1和Not1消化的质粒载体pGLY3192，从而产生最终的表达质粒 载体pGLY3200(图16)。
基本上如下所述，用上述抗-Her2或抗-CD20抗体表达/整合质粒载 体转化本文公开的适当菌株。在50mL YPD培养基(酵母浸出物(1％)， 蛋白胨(2％)，右旋糖(2％))中培养适当的巴氏毕赤酵母菌株过夜，至OD 为约0.2-6。在冰上温育30分钟后，通过在2500-3000rpm离心5分钟， 沉淀细胞。去除培养基，用冰冷却的无菌1M山梨醇洗涤细胞3次，然 后重新悬浮于0.5ml冰冷却的无菌1M山梨醇中。在电穿孔试管中合 并10μL线性化的DNA(5-20ug)和100μL细胞悬浮液，在冰上温育5 分钟。按照预设的巴氏毕赤酵母方案(2kV，25μF，200Ω)，在Bio-Rad GenePulser Xcell中进行电穿孔，随后马上加入1mL YPDS恢复培养基 (YPD培养基+1M山梨醇)。使转化的细胞在室温(24℃)恢复4小时过 夜，然后把细胞涂布在选择培养基上。
用于抗体生产的转化的菌株的细胞生长条件基本上如下。在含有由 1％酵母浸出物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1.34％酵 母氮碱基、4x10-5％生物素和1％甘油组成的缓冲甘油-复合培养基 (BMGY)的摇瓶中，在24℃进行转化的酵母菌株的蛋白表达。用于蛋白 表达的诱导培养基是缓冲的甲醇-复合培养基(BMMY)，其用1％甲醇替 代BMGY中的甘油。在加入诱导培养基时，将甲醇中的Pmt抑制剂 (Pmti-3)加入生长培养基，至0.2μM、2μM或20μM的终浓度，收获细 胞，在2,000rpm离心5分钟。
SixFors发酵罐筛选方案遵循在表4中所示的参数。
在接种后约18小时时，用目标菌株接种装有350mL培养基A(参 见下面的表6)+4％甘油的SixFors罐。与接种物一起加入小剂量(0.3mL 0.2mg/mL，在100％甲醇中)的Pmti-3(5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2- 苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧-2-硫代氧-3-噻唑烷醋酸)(参见公开的国 际申请号WO 2007061631)。在约20小时时，每罐加入一注射器的17mL 50％甘油溶液(甘油补料-批式补料，参见下面的表7)+更大剂量(0.3mL 4mg/mL)的Pmti-3。在约26小时时，当溶解氧(DO)浓度的正刺突指示 消耗完甘油时，开始0.7mL/小时的连续甲醇补料(参见下面的表8)。同 时，每罐加入另一剂量的Pmti-3(0.3mL 4mg/mL储液)。在约48小时时， 每罐加入另一剂量(0.3mL 4mg/mL)的Pmti-3。在接种后约60小时时， 收获并加工培养物。
使用如下的Dionex-HPLC(HPAEC-PAD)，进行O-聚糖测定。为了 测量O-糖基化减少，使用蛋白A色谱法(Li等人Nat.Biotechnol. 24(2)：210-5(2006))，从生长培养基纯化蛋白，并通过碱性消除(β-消 除)(Harvey，Mass Spectrometry Reviews 18：349-451(1999))，从蛋白释 放和分离O-聚糖。该过程也将释放的O-聚糖(寡甘露糖或甘露糖)的新形 成的还原端还原成甘露醇。甘露醇基团因而用作每个O-聚糖的独特指示 物。β消除需要在100μL体积的PBS缓冲液中含有0.5nmol或更多的 蛋白。用25μL碱氢硼化物试剂处理样品，在50℃温育16小时。加入 约20uL阿糖醇内部标准品，然后加入10μL冰醋酸。然后通过含有 SEPABEADS和AG 50W-X8树脂的Millipore过滤器离心样品，并用水 洗涤。将样品(包括洗液)转移至塑料自动取样瓶，在离心蒸发器中蒸 发至干燥。将150μL 1％AcOH/MeOH加入样品，在离心蒸发器中蒸发 样品至干燥。将该最后一步重复另外5次。加入200μL水，通过与脉冲 电化学检测偶联的高pH阴离子交换色谱法-Dionex HPLC(HPAEC-PAD)，分析100μL样品。基于回收的甘露醇的量，测定 平均O-聚糖占据。
图4-7表明，与含有内源PDI1且不缺失PMT1或PMT4基因的菌 株中的抗体生产相比，其中内源PDI1被替换为异源PDI(其来自与要 在菌株中生产的重组蛋白相同的物种)和其中已经去除天然的PMT1或 PMT4基因的巴氏毕赤酵母菌株，能生产具有更高的效价、具有减少的 O-糖基化的重组人抗体。
图4A和4B显示了来自摇瓶(A)和0.5L生物反应器(B)表达研究的代 表性结果，其中在用人PDI基因(hPDI)替换内源PDI1的巴氏毕赤酵母 菌株中，和在用人PDI替换内源PDI1且破坏PMT1基因(hPDI+Δpmt1) 的菌株中，生产人抗-Her2抗体。回收抗体，并通过非还原的和还原的 聚丙烯酰胺凝胶上的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。在非还原条件下， 抗体保持完整，而在还原条件下，抗体分解成HC和LC。泳道1-2显示 了由用编码抗-Her2抗体的质粒载体pGLY2988转化菌株yGLY2696生 成的2个克隆生产的抗体，泳道3-6显示了由用编码抗-Her2抗体的质粒 载体pGLY2988转化去除PMT1基因的菌株yGLY2696生成的4个克隆 生产的抗体。这些图表明，PMT1缺失提高了抗体产量。
图5显示了来自摇瓶表达研究的代表性结果，其中在用人PDI(hPDI) 基因替换内源PDI1的巴氏毕赤酵母菌株中，和在用人PDI替换内源 PDI1且破坏PMT1基因(hPDI+Δpmt1)的菌株中，生产人抗-DKK1抗体。 回收抗体，并通过非还原的和还原的聚丙烯酰胺凝胶上的聚丙烯酰胺凝 胶电泳进行分离。在非还原条件下，抗体保持完整，而在还原条件下， 抗体分解成HC和LC。泳道1和3显示了由用编码抗-DKK1抗体的质 粒载体pGLY2260转化菌株yGLY2696和yGLY2690生成的2个克隆生 产的抗体，泳道2和4显示了由用编码抗-DKK1抗体的质粒载体 pGLY2260转化去除PMT1基因的菌株yGLY2696和yGLY2690生成的 2个克隆生产的抗体。该图表明，PMT1缺失提高了抗体产量。
图6显示了来自0.5L生物反应器表达研究的结果，其中在用人PDI 替换内源PDI1且破坏PMT4基因(hPDI+Δpmt4)的巴氏毕赤酵母菌株 中，和在仅表达内源PDI1但是破坏PMT4基因(PpPDI+Δpmt4)的菌株 中，生产人抗-Her2抗体。回收抗体，并通过非还原的聚丙烯酰胺凝胶 上的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。泳道1和2显示了由用编码抗-Her2 抗体的质粒载体pGLY2988转化菌株yGLY24-1生成的2个克隆生产的 抗体，泳道3-5显示了由去除PMT4基因的菌株yGLY2690的转化生成 的3个克隆生产的抗-Her2抗体。该图表明，PMT4缺失提高了抗体产 量，但是为了具有产量的提高，细胞也必须用编码人PDI的表达盒替换 内源PDI1基因。
图7显示了来自摇瓶表达研究的结果，其中在用人PDI替换内源 PDI1且破坏PMT4基因(hPDI+Δpmt4)的巴氏毕赤酵母菌株中，和在仅 表达内源PDI1但是破坏PMT4基因(PpPDI+Δpmt4)的菌株中，生产人 抗-CD20抗体。回收抗体，并通过非还原的和还原的聚丙烯酰胺凝胶上 的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。泳道1显示了由用编码抗-CD20抗体 的质粒载体pGLY3200转化的菌株yGLY24-1生产的抗体，泳道2-7显 示了由去除PMT4基因的菌株yGLY2690的转化生成的6个克隆生产的 抗-CD20抗体。该图表明，PMT4缺失提高了抗体产量，但是为了具有 产量的提高，细胞也必须用编码人PDI的表达盒替换内源PDI1基因。
实施例3
本实施例描述嵌合的BiP基因，其中人ATP酶结构域被替换为巴氏 毕赤酵母KAR2的ATP酶结构域，其与人BiP肽结合域融合，在KAR2 或来自巴氏毕赤酵母的其它内质网特异性启动子的控制下。人BiP的核 苷酸和氨基酸序列在表11中分别显示为SEQ ID NO：55和56。嵌合的 BiP的核苷酸和氨基酸序列在表11中分别显示为SEQ ID NO：57和58。 通过组合如上所述替换内源PDI1基因和使用嵌合的BiP和人ERdj3(分 别是SEQ ID NO：76和77)，可以进一步提高产量。
实施例4
本实施例证实，当巴氏毕赤酵母高尔基体Ca2+ ATP酶(PpPMR1) 或拟南芥内质网Ca2+ ATP酶(AtECA1)在菌株中过表达时，可以显著减 少在表达人PDI来替代巴氏毕赤酵母PDI1的上述菌株中生成的蛋白的 O-聚糖占据。在该实施例中，使用糖工程化的巴氏毕赤酵母菌株解释该 效应，所述菌株生产主要具有Man5GlcNAc2 N-聚糖的抗体。
如下构建编码PpPMR1基因的表达盒。使用，引物(PpPMR1/UP： 5′-GAATTCATGACAGCTAATGAAAATCCTTTTGAGAATGAG-3′(SEQ ID NO：64)和PpPMR1/LP：5′-GGCCGGCCTCAAACAGCCATGCTGTAT CCATTGTATG-3′(SEQ ID NO：65)，从巴氏毕赤酵母NRRL-Y11430基 因组DNA PCR扩增巴氏毕赤酵母高尔基体Ca2+ ATP酶(PpPMR1)的开 放读码框。PCR条件是，1个在95℃持续2分钟的循环；5个在95℃持 续10秒、在52℃持续20秒和在72℃持续3分钟的循环；20个在95℃ 持续10秒、在55℃持续20秒和在72℃持续3分钟的循环；然后是1 个在72℃持续10分钟的循环。将得到的PCR产物克隆进pCR2.1和指 定的pGLY3811。通过用PstI和FseI消化质粒，从pGLY3811取出 PpPMR1，且在使用FseI消化之前，已经用T4DNA聚合酶使PstI末端 平整。将编码PpPMR1的DNA片段克隆进用EcoRI消化的pGFI30t，用 T4DNA聚合酶和FseI使末端平整，产生pGLY3822，其中PpPMR1可 操作地连接至AOX1启动子。质粒pGLY3822靶向巴氏毕赤酵母URA6 基因座。质粒pGLY3822显示在图17中。PpPMR1的DNA序列显示在 SEQ ID NO：60中，PpPMR1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：61中。
如下构建编码拟南芥ER Ca2+ ATP酶(AtECA1)的表达盒。从 GeneArt AG(Regensburg，Germany)合成编码AtECA1的DNA，并克隆， 制备pGLY3306。通过用MlyI和FseI消化，从pGLY3306取出合成的 AtECA1，将编码AtECA1的DNA片段克隆进用EcoRI消化的pGFI30t， 用T4DNA聚合酶和FseI使末端平整，产生整合/表达质粒pGLY3827。 质粒pGLY3827靶向巴氏毕赤酵母URA6基因座。质粒pGLY3827显示 在图18中。为在巴氏毕赤酵母中的表达，对AtECA1的DNA序列进行 密码子优化，显示在SEQ ID NO：62中。编码的AtECA1具有在SEQ ID NO：63中所示的氨基酸序列。
使用SpeI将整合/表达质粒pGLY3822(含有编码PpPMR1的表达盒) 或pGLY3827(含有编码AtECA1的表达盒)线性化，转化进巴氏毕赤酵母 菌株yGLY3647或yGLY3693的URA6基因座。通过菌落PCR(cPCR)证 实pGLY3822或pGLY3827在URA6基因座处的基因组整合，其中使用 引物，5′AOX1(5′-GCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTT-3′(SEQ ID NO： 66)和PpPMR1/cLP(5′-GGTTGCTCTCGTCGATACTCAAGTGGGAAG -3′(SEQ ID NO：67)证实PpPMR1整合进URA6基因座，使用5′AOX1和 AtECA1/cLP(5′-GTCGGCTGGAACCTTATCACCAACTCTCAG-3′(SEQ ID NO：68)证实AtECA1整合进URA6基因座。PCR条件是，1个在95 ℃持续2分钟的循环，25个在95℃持续10秒、在55℃持续20秒和在 72℃持续1分钟的循环；然后是1个在72℃持续10分钟的循环。
通过用编码PpPMR1且靶向URA6基因座的整合/表达质粒 pGLY3833转化菌株yGLY3647，产生菌株yGLY8238。在菌株yGLY3647 中，已经如实施例1所述用人PDI基因替换巴氏毕赤酵母PDI1伴侣基 因，显示在图3A和3B中。
通过用编码AtECA1且靶向URA6基因座的质粒pGLY3827转化菌 株yGLY3647，产生菌株yGLY8240。菌株的基因图谱(geneology)显 示在图3A和3B中。
关于向人源化的伴侣菌株添加PpPMR1或AtECA1可能减少菌株生 产的抗体的O-糖基化的作用，评价菌株。如表9所示，与表达人PDI 来替代巴氏毕赤酵母PDI1的菌株yGLY3647或仅表达内源PDI1但是能 生产具有Man5GlcNAc2糖形的抗体的菌株yGLY2263(如菌株 yGLY3647)相比，向菌株yGLY3647中添加PpPMR1或AtECA1可以 显著减少O-糖基化占据。结果也表明，表达它的内源PDI1且不表达人 PDI和过表达Ca2+ ATP酶的酵母菌株会生成具有减少的O-聚糖占据的 糖蛋白。
实施例5
从人肝cDNA库(BD Biosciences，San Jose，CA)，PCR扩增编码没 有它的天然信号序列的人钙网织蛋白(hCRT)的DNA片段，其中使用引 物hCRT-BstZ17I-HA/UP：5′-GTATACCCATACGACGTCCCAGACTA CGCTGAGCCCGCCGTCTACTTCAAGGAGC-3′(SEQ ID NO：73)和 hCRT-PacI/LP：5′-TTAATTAACTACAGCTCGTCATGGGCCTGGCC GGGGACATCTTCC-3′(SEQ ID NO：74)。PCR条件是，1个在98℃持续 2分钟的循环；30个在98℃持续10秒、在55℃持续30秒和在72℃持续 2分钟的循环，随后是1个在72℃持续10分钟的循环。将得到的PCR 产物克隆进pCR2.1Topo载体，制备pGLY1224。编码hCRT的DNA 另外包含修饰，使编码的截短的hCRT在它的N-末端具有HA标签，在 它的C-末端具有HDEL。通过BstZ17I和PacI消化，从pGLY1224释放 出编码hCRT的DNA，将该DNA片段与具有NotI和PacI兼容末端的 编码酿酒酵母α-交配因子前信号序列的DNA片段一起，克隆进已经用 NotI和PacI消化的表达载体pGLY579，建立pGLY1230。该质粒是编码 hCRT的整合/表达质粒，其可操作地连接至巴氏毕赤酵母GAPDH启动 子，并靶向巴氏毕赤酵母的HIS3基因座，所述hCRT在N-末端具有酿 酒酵母α-交配因子前信号序列和HA标签，且在它的C-末端具有HDEL 序列。
通过GeneArt AG合成具有NotI和PacI兼容末端的编码人 ERp57(hERp57)的DNA片段。然后将该DNA片段克隆进用NotI和PacI 消化的pGLY129，生成pGLY1231。该质粒编码可操作地连接至巴氏毕 赤酵母PMA1启动子的hERp57。
用SwaI消化质粒pGLY1231，将编码hERp57的DNA片段克隆进 用PmeI消化的质粒pGLY1230。因而，整合/表达质粒pGLY1234编码 hCRT和hERp57。质粒pGLY1234显示在图19中。
通过在有5′FOA存在下反选择菌株yGLY2690，产生菌株 yGLY3642，它是URA5营养缺陷型。
通过用编码hCRT和hERp57且靶向HIS3基因座的整合/表达质粒 pGLY1234转化yGLY3642，产生菌株yGLY3668。
通过用整合/表达质粒pGLY2261转化菌株yGLY3668，产生菌株 yGLY3693，所述质粒pGLY2261使编码抗-DKK1抗体的表达盒靶向 TRP2基因座。
通过用编码PpPMR1且靶向URA6基因座的整合/表达质粒 pGLY3833转化菌株yGLY3693，产生菌株yGLY8239。
通过用编码AtECA1且靶向URA6基因座的整合/表达质粒 pGLY3827转化菌株yGLY3693，产生菌株yGLY8241。
在该实施例中描述的菌株的基因图谱显示在图3A和3B中。
评价上述菌株，以观察向前述实施例的表达PpPMR1或AtECA1的 人源化伴侣蛋白菌株添加hCRT和hERp57是否会进一步减少生产的抗 体的O-聚糖占据。如表10所示，在只表达hCRT和hERp57的菌株 yGLY3693中，O-聚糖占据减少约2-倍，在另外表达PpPMR1或AtECA1 的菌株中，进一步降低最高达4-倍。结果也表明，表达它的内源PDI1、 不表达人PDI且过表达Ca2+ATP酶的酵母菌株会生产具有减少的O- 聚糖占据的糖蛋白。
尽管在本文中参考解释的实施方案描述了本发明，应当理解，本发 明不限于此。具有本领域的普通技术并获知本文的教导的人员，会认识 到在其范围内的其它改进和实施方案。因此，本发明仅受到本文所附权 利要求书的限制。