技术领域
本发明涉及定性和定量测定样品中分枝硫醇(mycothiol)的方法。
背景技术
放线菌纲(Actinobacteria)包含大量的革兰氏阳性，高G+C％细菌，这些细菌形 态多样，有小的球菌，也有复杂分支的菌丝体。放线菌在自然界分布非常广泛，土壤、 海洋、动物皮肤、肺和消化系统中都可以找到它们的身影。放线菌与人类的关系非常 密切：许多放线菌可以用来生产各种重要的商业产品，如氨基酸、维生素和抗生素； 某些放线菌也用于有机污染的生物修复；最重要的是许多放线菌是人类和动物的病原 菌，可以引起各种严重的疾病，如引起麻风病的Mycobacterium laprae，引起结核病的 Mycobacterium tubercolusis，以及引起白喉的Corynebacterium diphtheriae。
绝大多数放线菌的一个重要的共同点是它们可以合成mycothiol(MSH， AcCys-GlcN-Ins)，一种小分子量的硫醇，以微摩尔的量存在于细胞内，我们将其命 名为分枝硫醇。分枝硫醇的结构式如图1所示，其化学名称为 1-O-[2-[[(2R)-2-(acetylamino)-3-mercapto-l-oxopropyl]amino]-2-deoxy-α-D-glucopyranos yl]-D-myo-inositol。该小分子硫醇最初是从Streptomyces菌株和Mycobacterium bovis菌株 中分离并进行了结构鉴定，由Spies和Steenkamp命名为Mycothiol。
分枝硫醇在细胞内的作用与放线菌中不存在的glutathione(GSH，谷胱甘肽)的作 用相似。分枝硫醇是放线菌中主要的小分子量硫醇及氧化还原缓冲。分枝硫醇的一个 重要特点是它有较强的抗自氧化的能力。分枝硫醇有一还原性的巯基，可以与细胞内 其他还原性物质一起维持细胞内的氧化还原平衡。许多细胞代谢中都需要分枝硫醇相 关的酶，包括各种亲电化合物的解毒作用，活性氧氮化合物的灭活，还原和异构化。 分枝硫醇可以和多种烷基化试剂形成复合物，使有毒烷基化试剂的毒性降低。由于分 枝硫醇是结核分枝杆菌中主要的硫醇，并与菌株的抗药性有关，因此对分枝硫醇的研 究可能帮助人类找到潜在的药物作用靶位点用以治疗结核病。可能的药物靶位点包括 MshA，MshC，Mtr和MscR等分枝硫醇合成过程的酶及其他相关蛋白。
对放线菌中的分枝硫醇的详细的生物化学研究，和分枝硫醇在分枝杆菌感染中的 作用研究，都需要有高灵敏，高特异的方法来对分枝硫醇进行分析。对分枝硫醇的定 性和定量分析方法对研究分枝硫醇及放线菌尤其是一些病原菌有很重要的作用。不论 是对实验室的科学研究还是临床诊断，都需要简单，快捷，灵敏，特异，准确的分枝 硫醇定性和定量方法。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)可以通过一个依赖于分枝硫醇的龙 胆酸途径降解3-羟基苯甲酸和龙胆酸，首先龙胆酸被龙胆酸1，2-双加氧酶(G12D， NCgl2920)开环生成马来酰丙酮酸(顺丁烯二酸-单酰丙酮酸，maleylpyruvate)，马 来酰丙酮酸在依赖于分枝硫醇的马来酰丙酮酸异构酶(MDMPI，NCgl2918)作用下异 构为富马酰丙酮酸(反丁烯二酸-单酰丙酮酸，fumarylpyruvate)，最后在富马酰丙酮 酸水解酶(FPH，NCgl2919)的作用下水解为丙酮酸和延胡索酸，进入中心代谢途径。
马来酰丙酮酸的结构式如式II所示；
式II
发明内容
本发明的一个目的是提供一种辅助检测样品中分枝硫醇含量的方法，即定量检测 方法。
本发明所提供的辅助检测样品中分枝硫醇含量的方法，包括如下步骤：
(1)用酶活反应体系测定马来酰丙酮酸异构酶酶活，制作反应体系中分枝硫醇标 准品的浓度对应马来酰丙酮酸异构酶酶活的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；
所述酶活反应体系包括马来酰丙酮酸、马来酰丙酮酸异构酶和分枝硫醇标准品；
(2)将所述酶活反应体系中的分枝硫醇标准品替换为待测样品，测定马来酰丙酮 酸异构酶酶活，根据所述标准曲线，得到所述待测样品中分枝硫醇的浓度；
所述分枝硫醇标准品为分枝硫醇；
所述马来酰丙酮酸异构酶为将马来酰丙酮酸异构为富马酰丙酮酸且依赖于分枝硫 醇的酶。
上述定量检测方法中，所述马来酰丙酮酸异构酶酶活为单位时间内催化单位量的 马来酰丙酮酸转化为富马酰丙酮酸所需的酶量；
上述定量检测方法中，所述酶活反应体系包括富马酰丙酮酸水解酶。所述富马酰 丙酮酸水解酶为将富马酰丙酮酸水解的酶。
上述定量检测方法中，所述酶活反应体系中，各种物质在体系中的浓度满足如下 三个条件：
马来酰丙酮酸的浓度：分枝硫醇标准品中最高浓度≥6.7×104，
马来酰丙酮酸异构酶的浓度：分枝硫醇标准品中最高浓度≥11U/mL∶1nM，
富马酰丙酮酸水解酶的浓度：分枝硫醇标准品中最高浓度≥1.5。
上述定量检测方法中，所述酶活反应体系由马来酰丙酮酸、马来酰丙酮酸异构酶、 分枝硫醇标准品、富马酰丙酮酸水解酶和缓冲液组成；
上述定量检测方法中，所述酶活反应体系中，马来酰丙酮酸的浓度为120μM，马 来酰丙酮酸异构酶的浓度为19.73U/mL，富马酰丙酮酸水解酶的浓度为2.78U/mL；
所述分枝硫醇标准品在所述酶活反应体系中的浓度为0.05nM、0.07nM、0.09nM、 0.11nM、0.14nM、0.18nM、0.22nM、0.28nM、0.37nM、0.45nM、0.56nM、0.74nM、 0.89nM、1.12nM、1.49nM、1.78nM。
上述定量检测方法中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液；
上述定量检测方法中，所述缓冲液浓度为20-100mM，具体为20mM、50mM或 100mM；
上述定量检测方法中，所述酶活反应体系的pH值为7.0-8.0，具体为7.0、7.5或 8.0。
上述定量检测方法中，所述测定马来酰丙酮酸异构酶酶活的方法包括如下步骤： 检测酶反应开始时酶活反应体系在330nm处的吸光度值，将其记作吸光度值I；检测 酶反应后酶活反应体系在330nm处的吸光度值，将其记作吸光度值II，吸光度值I与 吸光度值II之差为吸光度差值，根据吸光度差值得到马来酰丙酮酸异构酶酶活值；
上述定量检测方法中，所述酶反应后为自酶反应开始时计起1分钟内，具体为自 酶反应开始时计起第30秒；将酶反应开始时记作第0秒；
上述定量检测方法中，所述酶反应的温度为25℃；
上述定量检测方法中，所述马来酰丙酮酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示；
上述定量检测方法中，所述富马酰丙酮酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。
本发明的另一个目的是提供一种辅助鉴别待测样品中是否含有分枝硫醇的方法， 即定性检测。
本发明所提供的辅助鉴别待测样品中是否含有分枝硫醇的方法，包括以下步骤：
(1)配制酶反应体系，进行酶反应；
(2)检测所述酶反应体系中马来酰丙酮酸的浓度是否变化，若马来酰丙酮酸的浓 度降低，则确定所述待测样品中含有分枝硫醇；若不变化，则确定所述待测样品中不 含有分枝硫醇；
所述酶反应体系由马来酰丙酮酸、马来酰丙酮酸异构酶、待测样品溶液和缓冲液 组成；
所述马来酰丙酮酸异构酶为依赖于分枝硫醇的且将马来酰丙酮酸异构为富马酰丙 酮酸的酶。
上述定性检测方法中，所述检测所述酶反应体系中马来酰丙酮酸的浓度是否变化 的方法包括如下步骤：检测酶反应开始时酶反应体系在330nm处的吸光度值，将其记 作吸光度值I；检测酶反应后酶反应体系在330nm处的吸光度值，将其记作吸光度值 II，若与吸光度值I相比，吸光度值II降低，则确定马来酰丙酮酸的浓度降低；若与 吸光度值I相比，吸光度值II不变，则确定马来酰丙酮酸的浓度不变；
上述定性检测方法中，所述酶反应后为自酶反应开始时计起5分钟内，具体为酶 反应开始时计起第5分钟，将酶反应开始时记作第0分钟；
上述定性检测方法中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液；所述缓冲 液浓度为20-100mM，具体为50mM、20mM或100mM；
上述定性检测方法中，所述酶反应体系中，所述马来酰丙酮酸的浓度为90μM-150 μM，具体为90μM、120μM或150μM；所述马来酰丙酮酸异构酶的浓度为0.3 U/mL-1.3U/mL，具体为0.3U/mL、0.8U/mL或1.3U/mL；
上述定性检测方法中，所述酶反应体系的pH值为7.0-8.0，具体为7.0、7.5或8.0；
上述定性检测方法中，所述酶反应的温度为25℃；
上述定性检测方法中，所述马来酰丙酮酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示。
上述任一所述定量检测方法在辅助检测分枝硫醇产生菌中分枝硫醇含量中的应用 也属于本发明的保护范围。
上述任一所述定性检测方法在辅助检测菌中是否含有分枝硫醇中的应用也属于本 发明的保护范围。
马来酰丙酮酸异构酶在检测分枝硫醇中的应用也属于本发明的保护范围，所述马 来酰丙酮酸异构酶为依赖于分枝硫醇的且将马来酰丙酮酸异构为富马酰丙酮酸的酶； 所述马来酰丙酮酸异构酶的氨基酸序列具体如SEQ ID NO：1所示；
上述应用中包括如下制备菌粗提物的步骤：用质量百分比为3％高氯酸水溶液和 待测菌体细胞混匀，25℃或30℃或25℃-30℃反应30分钟，离心，取上清液，上清 液即为菌粗提物。
实际应用中，将菌粗提物作为待测样品，用上述辅助检测样品中分枝硫醇含量的 方法进行测定或用上述辅助鉴别待测样品中是否含有分枝硫醇的方法进行测定。制备 的菌粗提物稳定，在其制备完成后12小时内均可用上述方法进行检测；优选为在所述 菌的粗提物制备完成后0.2小时起到6小时。
本发明的另一个目的是提供一种辅助鉴别待测样品中是否含有分枝硫醇的试剂 盒。
本发明所提供的辅助鉴别待测样品中是否含有分枝硫醇的试剂盒，包括独立包装 的马来酰丙酮酸异构酶、马来酰丙酮酸和缓冲液；所述马来酰丙酮酸异构酶为依赖于 分枝硫醇的且将马来酰丙酮酸异构为富马酰丙酮酸的酶；所述马来酰丙酮酸异构酶的 氨基酸序列具体如SEQ ID NO：1所示。
本发明的另一个目的是提供一种辅助检测样品中分枝硫醇含量的试剂盒。
本发明所提供的辅助检测样品中分枝硫醇含量的试剂盒，包括独立包装的马来酰 丙酮酸异构酶、马来酰丙酮酸、缓冲液、富马酰丙酮酸水解酶和标准品分枝硫醇，所 述马来酰丙酮酸异构酶为依赖于分枝硫醇的且将马来酰丙酮酸异构为富马酰丙酮酸的 酶；所述马来酰丙酮酸异构酶的氨基酸序列具体如SEQ ID NO：1所示，所述富马酰 丙酮酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
上述任一所述检测方法不仅可以测定放线菌细胞中分枝硫醇的含量，还可以测其 它样品中分枝硫醇的含量。
本发明所提供定性和定量测定分枝硫醇的方法，操作简单，需要的试剂较少，仪 器设备简单常见，对分枝硫醇的特异性高，检测灵敏度较高，检测时间短，不仅可以 快速检测到分枝硫醇的存在，还能对样品中的分枝硫醇进行定量，可以对样品中是否 存在分枝硫醇进行大规模的筛选，尤其对鉴定分枝杆菌等病原菌的临床应用也有重要 意义。
附图说明
图1为分枝硫醇(Mycothiol)结构式
图2为纯化的分枝硫醇质谱结果，其中A为一级质谱结果，B为m/z为487.4片 段的二级质谱结果。
图3为谷胱甘肽浓度与峰面积的标准曲线。
图4为阳性对照，即在反应体系中加入纯化的分枝硫醇后330nm处吸光值的变化 (箭头所示为330nm)。
图5为阴性对照，即反应体系中加入Escherichia coli裂解液(无分枝硫醇)后330nm 处吸光值的变化(箭头所示为330nm)。
图6为菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4.1072T的定性测定结果(箭头所示为 330nm)。
图7为菌株Clavibacter michiganensis AS 1.1909的定性测定结果(箭头所示为330 nm)。
图8为菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4.1072T的巯基特异性结合荧光试剂衍生 化和HPLC结果(图7中A)及质谱分析结果(图7中B-D)。
图9为菌株Clavibacter michiganensis AS 1.1909的巯基特异性结合荧光试剂衍生 化和HPLC结果。
图10为测定体系中分枝硫醇终浓度与马来酰丙酮酸异构酶酶活关系。
图11为测定体系中分枝硫醇终浓度与马来酰丙酮酸异构酶酶活标准曲线。
图12不同比例湿菌体重量(毫克)：高氯酸水溶液体积(微升)对分枝硫醇提取 的影响。
图13为不同处理时间对分枝硫醇提取的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、酶、底物和分枝硫醇的制备
一、异源表达龙胆酸1，2-双加氧酶(G12D)，依赖于分枝硫醇的马来酰丙酮 酸异构酶(MDMPI)和富马酰丙酮酸水解酶(FPH)
质粒pET28a-ncgl2918，pET28a-ncgl2919和pET28a-ncgl2920在文献(Shen，X.H.， C.Y.Jiang，et al.(2005).Functional identification of novel genes involved in the glutathione-independent gentisate patheway in Corynebacterium glutamicum.Appl. Environ.Microbiol.71(7)：3442-3452)中公开过，分别用于异源表达MDMPI，FPH和 G12D，公众可从中国科学院微生物研究所处获得。
将质粒pET28a-ncgl2918，pET28a-ncgl2919和pET28a-ncgl2920分别转化到 Escherichia coli BL21(DE3)菌株中，鉴定，将阳性克隆接入Luria-Bertani(LB)液体培 养基(含50μg/mL的卡那霉素)37℃，摇床转速150rpm，培养到OD600约为0.5-0.6 时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度0.5mM，16℃诱导表达8小 时；收集细胞；将200mg湿菌体重新悬浮在1mL缓冲液中(50mM的Tris-HCl，pH 8.0)冰上超声破碎，离心取上清，用His-Bind蛋白纯化试剂盒(Novagen)进行纯化， 按照试剂盒说明书操作，收集合并活性蛋白，超滤置换缓冲液并浓缩；浓缩后的目的 蛋白用Superdex 200预装柱(GE)FPLC凝胶过滤纯化。凝胶柱预先用流动相(50mM 的Tris-HCl，pH 8.0)平衡2个柱体积，上样量2mL，流速0.5mL/min；上样后收集 活性组分并超滤浓缩，超声破碎后所有的操作均在4℃进行。用Bradford法进行蛋白 浓度测定。酶活测定方法如文献(Zhou，N.Y.，S.L Fuenmayor et al.(2001).nag genes of Ralstonia(formerly Pseudomonas)sp.strain U2encoding enzymes for gentisate catabolism. J.Bacteriol.183(2)：700-708)中所述，并进行了修改，测定MDMPI时加入的不是谷胱 甘肽，而是终浓度为0.3μM的分枝硫醇，反应温度为25℃。1个单位的酶活力(U) 定义为25℃时，每1分钟内催化1μmol底物转化为产物所需要的酶量。
同时以转入pET28a的E.coli(DE3)为对照。
结果：转pET28a-ncgl2918的菌表达得到的蛋白具有MDMPI活性；转 pET28a-ncgl2919的菌表达得到的蛋白具有富马酰丙酮酸水解酶活性；转 pET28a-ncgl2920的菌表达得到的蛋白具有龙胆酸1，2-双加氧酶活性。转入pET28a 的E.coli(DE3)的表达产物无以上任何酶活性。
依赖于分枝硫醇的马来酰丙酮酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
富马酰丙酮酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
龙胆酸1，2-双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
二、马来酰丙酮酸(顺丁烯二酸-单酰丙酮酸，maleylpyruvate)的制备
3mL反应体系：120μM龙胆酸、0.03U/mL龙胆酸1，2-双加氧酶(G12D)、 50mM的Tris-HCl缓冲液、pH 8.0；室温(25℃)反应5分钟，330nm处吸光值不再变 化，反应完全，得到马来酰丙酮酸。制备方法按照文献(Liu，D.Q.，H.Liu，et al.(2005). Production of maleylpyruvate and fumarylpyruvate.Journal of Zhejiang Univesity(Agric.&Life Sci.)31(3)：301-304.)中所述。
将产物进行质谱鉴定，马来酰丙酮酸结构式如下
式II
三、分枝硫醇的制备，鉴定及浓度测定
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)AS 1.1886T(即ATCC 13032)购自 中国普通微生物菌种保藏管理中心。
分枝硫醇纯化及浓度测定按照文献(Feng，J.，Y.Che，et al.(2006).The gene ncgl2918encodes a novel maleylpyruvate isomerase that needs mycothiol as cofactor and links mycothiol biosynthesis and gentisate assimilation in Corynebacterium glutamicum.J.Biol.Chem.281(16)：10778-10785)和(Newton，G.L.，K.Amold，et al.(1996). Distribution of thiols in microorganisms：mycothiol is a major thiol in most actinomycetes.J.Bacteriol.178(7)：1990-1995)中所述，并修改，具体如下：
1)用LB培养谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，30℃培养，16-24小 时后收集细胞，按1/1(溶液体积(mL)/细胞湿菌体重量(g))加入高氯酸水溶液(750 mM)，室温放置3-5小时，溶解菌体，15000g离心30分钟取上清；用KOH(4M)调 pH到4.6；冰上放置2-3小时，15000g离心30分钟取上清；加入2倍体积冰预冷无水乙 醇，冰上1-2小时，15000g离心30分钟取上清，旋转蒸发乙醇，温度小于等于35℃； 将上清与上样缓冲液(0.4M Tris-HCl，4mM EDTA，2M NaCl，pH 7.5)按3/1比例(上 清与上样缓冲液的体积比)混合，4℃过夜，15000g离心30分钟取上清0.2μm滤膜过滤 后上巯基亲和柱(Thiopropyl Sepharose 6B(GE))。
2)巯基亲和柱预先用活化缓冲液(饱和2’，2’-dipyridyl disulphide(Sigma)，0.1M Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.9)低速冲洗5个柱体积(流速0.05mL/min)，再用稀释4 倍的上样缓冲液(用去离子水稀释)平衡3个柱体积(流速0.5mL/min)。
3)上样后，再用稀释4倍的上样缓冲液洗2个柱体积(流速0.5mL/min)。
4)最后用洗脱缓冲液(0.1M Tris-HCl，1mM EDTA，30mM DTT，pH 7.5)洗脱 (流速1mL/min)，DTT为二硫苏糖醇。
5)巯基亲和柱洗脱下来的样品过分子筛Sephadex LH-20(GE)，流动相为甲醇∶ 水(1∶1)，pH 4.6(用乙酸调)，流速为0.5mL/min，每6分钟收集一管，收集可激 活MDMPI活性的部分，旋转蒸发去除甲醇并浓缩，-70℃保存。
6)纯化的分枝硫醇的质谱鉴定：结果见图2，图2中A和图2中B分别是一级和二级 质谱结果，核质比(m/z)为509.2的物质是结合一个Na+离子的分枝硫醇，核质比为487.1 的物质即为分枝硫醇，核质比为307.1的物质是分枝硫醇丢失一个肌醇基团(分子量为 180)后的片段。从质谱结果可以确定纯化出的物质就是分枝硫醇。分枝硫醇的分子结 构式如图1所示。
7)纯化的分枝硫醇浓度测定：用Fahey和Newton等人发明的衍生化和HPLC法， 以谷胱甘肽作为标准品，建立谷胱甘肽浓度和GSmB(谷胱甘肽与巯基特异性衍生化 试剂monobromobimane结合的产物)峰面积的标准曲线(图3)。称取一定量的谷胱 甘肽(99.9％，Merck)标准品用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)配制成浓度为 800uM，400μM，200μM，100μM，50μM，25μM和12.5μM的标准溶液，分别取 200μL与60℃预热的monobromobimane(mBBr，Sigma)溶液(2mM，50％乙腈水 溶液，20mM Tris-HCl，pH 8.0)等体积混合，60℃避光水浴15min，加入1μL5N 的甲烷磺酸(methanesulfonic acid，国药集团化学试剂北京有限公司)水溶液终止反应， 取200μL与10mM的甲烷磺酸等体积混合，用0.2μm滤膜过滤后进行HPLC分析， HPLC分析柱为ZORBAX EXTEND-C18250×4.6mm，流动相A为0.25％的乙酸水溶 液(用NaOH调pH 3.5)，流动相B为甲醇。HPLC程序如下：0-5min 15％B；5- 15min 15％-23％B：15-45min 23％-42％B；45-50min 42％-100％B。流速为0.9 mL/min，上样量20μL。将纯化的分枝硫醇也进行相同的处理，通过标准曲线(图3) 测定纯化的分枝硫醇的浓度。
实施例2、定性检测放线菌中的分枝硫醇
马来酰丙酮酸在330nm处有最大吸收，当马来酰丙酮酸异构为富马酰丙酮酸时， 330nm处的吸光值会降低，因此可以设计反应体系，利用紫外分光光度计测定体系的 A330变化。在设定的条件下，测定200-400nm范围内吸光值的变化，阳性对照是纯化 的分枝硫醇，阴性对照是不含有分枝硫醇的大肠杆菌的细胞裂解液。5分钟内，330nm 处吸光值变化超过0.1，认定为阳性；5分钟内，阴性对照的330nm和340nm处吸光值 变化不会超过0.05。
菌株Clavibacter michiganensis AS 1.1909购自中国普通微生物菌种保藏管理中心， 菌株号为AS 1.1909；)
菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4.1072T购自中国普通微生物菌种保藏管理中 心，菌株号为AS 4.1072T；
方法I
(一)检测方法
1、制备待测样品：
方法一：收集对数生长末期到平台前期的菌体细胞约200mg(湿重)，重新悬浮 于1mL的Tris-HCl缓冲液中(50mM，pH 8.0)，冰上超声破碎细胞(120W，超声3s， 间隔5s，100次)；超声破碎后的裂解液沸水浴5分钟，使蛋白失活，15000g离心5分 钟，取上清液，该上清液即为待测样品；
方法二：收集对数生长末期到平台前期的菌体细胞约200mg(湿重)，按照1∶2 的湿菌体重量(mg)比溶液体积(μL)，加入3％高氯酸水溶液(质量百分比)，混 匀，25℃放置30分钟；4℃，15000g离心10分钟，取上清，该上清用超纯水稀释1- 100倍，稀释液为待测样品溶液。
2、检测：
(1)配制反应体系：3mL的反应体系中各种组分的浓度为：120μM的马来酰丙 酮酸、0.8U/mL的MDMPI、10μL待测样品，用50mM的Tris-HCl缓冲液补足体积， pH值8.0，反应温度为25℃。
阴性对照：检测样品是大肠杆菌裂解液(不含分枝硫醇)，处理方法相同。
阳性对照：实施例1中制备的分枝硫醇。
(2)测量仪器为紫外分光光度计，使用光程为1cm的石英杯。检测酶反应开始时 (0min)反应体系在330nm处的吸光度值，将其记作吸光度值I；从酶反应开始时 计起(酶反应开始时记作第0min)，在第5min起检测反应体系在330nm处的吸光 度值，将其记作吸光度值II，若与吸光度值I相比，吸光度值II降低，则确定所述待 测样品中含有分枝硫醇；若与吸光度值I相比，吸光度值II不变，则确定所述待测样 品中不含有分枝硫醇。
因为紫外分光光度计检测的实际操作中会有操作误差及系统误差，一般认为两次差 值小于等于0.05即是不变的，两次差值大于等于0.1即是有变化的。
实验设3次重复，结果取平均数。
(二)检测结果：结果如表1和图4-7所示。
表1待测样品在330nm处吸光值的变化
酶反应开始时(第0min)A330 酶反应后(第5min)A330 N.roseoviolacea 1.65 1.35 C.michiganensis 1.85 1.81 阳性对照 1.9 1.5 阴性对照 1.9 1.9
酶反应后(第5min)，阴性对照在330nm处吸光值的变化在0.05之内，阳性对照 在330nm处吸光值降低0.4；菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4.1072T在330nm处吸光 值降低0.3，即吸光度值I与吸光度值II之差大于等于0.1，说明该菌株含有分枝硫醇； 菌株Clavibacter michiganensis AS 1.1909在330nm处吸光值降低0.04，即吸光度值I与 吸光度值II之差小于等于0.05，说明该菌株不含分枝硫醇。
(三)验证
为了验证菌株中是否含有分枝硫醇，将菌株用巯基特异性结合荧光试剂衍生化和 HPLC方法(Newton，G.L.，K.Arnold，et al.(1996).Distribution of thiols in microorganisms：mycothiol is a major thiol in most actinomycetes.J.Bacteriol.178(7)： 1990-1995.)，同时结合质谱分析对菌株进行了检测。具体如下：(1)菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4.1072T对数末期到平台前期细胞约100mg(湿菌体)，加入1mL 60℃ 预热的50％乙腈水缓冲液(含20mM的Tris-HCl，pH 8.0，2mM的mBBr)，漩涡振 荡混匀，60℃避光水浴15分钟；加入5μL甲烷磺酸水溶液(5N，methanesulfonic acid) 终止反应；离心后取上清；(2)用10mM的甲烷磺酸水溶液稀释2倍后HPLC上样 分析。HPLC方法与分枝硫醇浓度测定方法相同；在这个体系中，mBBr与分枝硫醇的 衍生物(MSmB)大约在15分钟时出峰(质谱验证，图8)。
菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4.1072T的验证结果见图8。图8中A为巯基特 异性结合荧光试剂衍生化和HPLC方法的结果，分枝硫醇与巯基特异性结合荧光试剂 monobromobimane(mBBr，Sigma)结合后形成MSmB化合物，该化合物在设定的液 相条件下保留时间约为14.993min；将该组分进行质谱分析得到质谱结果(图8B-D)。
菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4.1072T的巯基特异性结合荧光试剂衍生化和 HPLC结果(图8A)，保留时间为14.993分钟的峰一级质谱分析结果如图8B，二级 质谱分析结果如图8C，三级质谱分析结果如图8D。根据质谱分析该核质比为699.1 的片段即为[MSmB]Na+，即MSmB结合一个Na+的化合物，HPLC和质谱分析结果表 明在菌种Nonomuraea roseoviolacea AS 4.1072T中含有分枝硫醇。
对菌株Clavibacter michiganensis AS 1.1909进行鉴定，没有发现洗脱峰(15分钟 处)，见图9。表明该检测方法可靠准确。
方法II
(一)检测方法
1、制备待测样品：与方法I相同；
2、检测：检测方法中除所配制反应体系与方法I有差别外，其余方法与方法I均 相同。
配制反应体系：3mL的反应体系中各种组分的量为：90μM的马来酰丙酮酸、0.3 U/mLMDMPI、10μL待测样品、用20mM的磷酸盐缓冲液补足体积，pH值7.0。
(二)检测结果
检测结果与方法I无显著差异。
方法III
(一)检测方法
1、制备待测样品：与方法I相同；
2、检测：检测方法中除所配制反应体系与方法I有差别外，其余方法与方法I均 相同。
配制反应体系：3mL的反应体系中各种组分的量为：150μM的马来酰丙酮酸、1.3 U/mLMDMPI、50μL待测样品、用100mM的磷酸盐缓冲液补足体积，pH值7.5。
(二)检测结果
检测结果与方法I无显著差异。
实施例3、测定放线菌中分枝硫醇的含量
在反应体系中，MDMPI和底物马来酰丙酮酸的量远远大于分枝硫醇的量时，分枝 硫醇的量与酶反应速度成线性关系，利用该线性关系可以进行分枝硫醇的定量检测。 而马来酰丙酮酸在330nm处有最大吸收，富马酰丙酮酸在340nm处有最大吸收，当在 反应体系中加入足够量的富马酰丙酮酸水解酶时，可以将产生的富马酰丙酮酸立即水 解，消除富马酰丙酮酸在330nm处的干扰，因此可以测定反应体系330nm处的吸光度 的变化来计算酶反应速度(酶活力)，其摩尔消光系数为13000M-1cm-1。首先也必需用 一系列已知量的分枝硫醇对设计的体系(固定的缓冲液，固定量的酶和底物)构建分 枝硫醇量与酶活力的标准曲线。待测样品利用同样的体系进行酶活力测定，然后从标 准曲线可以得到样品中分枝硫醇的量。考虑到是进行定量测定，样品处理方式应用的 是3％高氯酸提取，按照一定的质量体积比在收集的细胞内加入3％高氯酸，提取菌体 中的分枝硫醇，离心后的上清稀释后加入到设计好的反应体系中进行测定。阴性对照 是大肠杆菌。
表2中的菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
(一)标准曲线的构建
1、标准品溶液的量及其制备
将纯化并定量的分枝硫醇用超纯水稀释成以下浓度的标准液：60nM、80nM、105 nM、125nM、155nM、205nM、250nM、310nM、415nM、500nM、620nM、830nM、 995nM、1245nM、1660nM、1990nM、2488nM、3317nM、3980nM。分别取2μL 加入到下面所述酶活体系中。
体系中加入的分枝硫醇的量分别为0.12pmol、0.16pmol、0.21pmol、0.25pmol、 0.31pmol、0.41pmol、0.5pmol、0.62pmol、0.83pmol、1.0pmol、1.24pmol、1.66pmol、 1.99pmol、2.49pmol、3.32pmol，3.98pmol，4.98pmol，6.63pmol和7.96pmol。
体系中分枝硫醇终浓度分别为0.05nM、0.07nM、0.09nM、0.11nM、0.14nM、 0.18nM、0.22nM、0.28nM、0.37nM、0.45nM、0.56nM、0.74nM、0.89nM、I.12nM、 1.49nM、1.78nM、2.23nM、2.97nM和3.57nM。
2、测定标准品酶活方法
配制反应体系：2.23mL反应体系：120μM马来酰丙酮酸、19.73U/mL马来酰丙 酮酸异构酶(MDMPI)、2.78U/mL富马酰丙酮酸水解酶(FPH)和2μL的分枝硫醇 标准品，用50mM Tris-HCl缓冲液补足体积，pH值8.0，反应温度为25℃。
酶活定义：在最适反应条件下(温度25℃)，每分钟催化1微摩尔马来酰丙酮酸 转化为富马酰丙酮酸所需的马来酰丙酮酸异构酶酶量定为一个酶活力单位，即1U。
检测酶反应开始时反应体系在330nm处的吸光度值，将其记作吸光度值I；从酶 反应开始时计起(酶反应开始时记作第0秒)，第30秒起检测反应体系在330nm处 的吸光度值，将其记作吸光度值II，吸光度值I与吸光度值II之差为吸光度差值，根 据如下公式计算得到马来酰丙酮酸异构酶的酶活，所述公式为：E＝(ΔA×4.64× 106)/ε330，其中，E为马来酰丙酮酸异构酶的酶活，E的单位为纳摩尔每分钟 (nmol/min)；ΔA为吸光度差值；ε330为马来酰丙酮酸在330nm处的摩尔消光系数， ε330＝13000M-1cm-1；每个样品都做3个平行。
3、制作分枝硫醇标准品终浓度与马来酰丙酮酸异构酶酶活对应的标准曲线
以加入的分枝硫醇终浓度(单位为pmol/L)为x轴，测得的酶活(单位为nmol/min) 为y轴作图(图10A)，从图中可以看出，分枝硫醇终浓度较低时，反应体系中分枝 硫醇标准品的量对应马来酰丙酮酸异构酶酶活的一元线性回归曲线的线性关系较好， 取全部的点做一元线性回归曲线，R2＝0.963(图10B)；取分枝硫醇终浓度0-2.97nM 的点做一元线性回归曲线，R2＝0.9714(图10C)；取分枝硫醇终浓度0-2.23nM的 点做一元线性回归曲线，R2＝0.9789(图10D)；而取分枝硫醇终浓度0-1.78nM的 点做一元线性回归曲线，R2＝0.9916＞0.98(图11)，发现在分枝硫醇终浓度0-1.78nM 时线性关系较好，把该曲线(图11)作为标准曲线进行分枝硫醇的定量计算。该方法 至少可以检测到0.12pmol的分枝硫醇。
较好的线性关系是定量测量分枝硫醇的基础，因此无论体系组成如何，可以得到 R2大于等于0.98的标准曲线，即可以用该体系进行定量测定。从图10A可以推断， 当底物和酶的终浓度远远大于分枝硫醇终浓度时，分枝硫醇终浓度与酶活的线性关系 才比较好，因此体系中底物，酶终浓度与分枝硫醇终浓度的比例尤其重要，根据图11， 可以得到线性关系成立的底物，酶与分枝硫醇终浓度的比例。
当底物(马来酰丙酮酸)的终浓度等于120μM，
马来酰丙酮酸的浓度：分枝硫醇标准品中最高浓度≥6.7×104，
马来酰丙酮酸异构酶的浓度∶分枝硫醇标准品中最高浓度≥11U/mL∶1nM，
富马酰丙酮酸水解酶的浓度：分枝硫醇标准品中最高浓度≥1.5，可以得到较好的 线性关系(图11)。
(二)待测样品检测
1、培养菌
各种菌的培养方法：表2中菌株均用Tryptic Soy Broth(TSB，Becton Dickenson) 培养基培养，30℃，150rpm振荡培养，培养约12-36小时后(对数生长末期到平台 前期)离心收集菌体。
2、待测样品的制备
待测样品为菌的提取物，具体按照如下方法提取：离心收集放线菌菌体细胞，将 湿菌体按照1mg湿菌体重量：2μL 3％高氯酸水溶液(质量百分比)的比例加入3％高 氯酸水溶液，称重，得到的重量为重量I，混匀，30℃反应30分钟，离心取上清，该 上清即为待测样品液体，该上清稀释200倍(用去离子水稀释)后用于酶活测定。
3、测定待测样品的酶活：方法与实验(一)中相同。
4、计算待测样品中分枝硫醇的含量
根据步骤(一)所建立的标准曲线(图11)和步骤3测定的马来酰丙酮酸异构酶 的酶活计算待测样品中分枝硫醇的含量。
将待测样品中分枝硫醇的含量换算成每克干菌体中分枝硫醇的含量。菌体用3％ 高氯酸水溶液处理后离心的残渣，真空冷冻干燥后即为干菌体残渣，称重，得到的重 量为重量II。重量I与重量II的差值即为用于检测的上清液的总重量，按照水的密度 (1g/mL)进行换算，得到用于检测的上清液的总体积。从标准曲线可以得到待测样 品液体中分枝硫醇的浓度，结合用于检测的上清液的总体积、干菌体重量和稀释倍数， 即可以计算得到每克干菌体中分枝硫醇的摩尔含量。
每个菌株分3批培养并检测(生物学重复)，每批中均设3次重复(统计学重复)。 结果取平均值±标准差(表2)。
结果如表2所示。每个批次间，菌都是重新培养的，由于批次间的培养差异等， 菌中分枝硫醇的量在不同批次间会有差异，因此测得同一菌株不同批次间的结果是有 差异的，且差异均在可接收的范围内，即这种差异不是测量方法造成的，是由生物学 特征造成的。三个统计学重复的标准差在4.7％-16.3％之间，结果说明本发明方法的 重复性好。
在不含有高氯酸的分枝硫醇样品中，加入终浓度为3％的高氯酸后(相当于提取 的样品不经稀释)进行测定，测定结果与不加高氯酸的结果一致，表明样品不经稀释， 其中含有的高氯酸对酶也没有很大的影响，可以忽略。
表2各菌株样品中分枝硫醇含量
(三)各个菌巯基特异性结合荧光试剂衍生化和HPLC鉴定
将表2中各菌分别按照定性检测中的鉴定方法进行鉴定。结果均含有分枝硫醇， 分枝硫醇的结构式如图1所示。
实施例4、高氯酸溶液对放线菌细胞中的分枝硫醇提取的影响
1)高氯酸溶液体积与细胞质量的关系：收集对数生长后期的谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamieum)细胞，湿菌体称重，同样的样品分成三份，分别按照1 mg湿菌体重量：1μL3％(质量百分含量)高氯酸水溶液比例、1mg湿菌体重量：2μL 3％高氯酸水溶液比例、1mg湿菌体重量：5μL3％高氯酸水溶液比例加入3％高氯酸 溶液，混匀后在30℃反应30分钟后，离心取上清，测定上清中分枝硫醇的量，发现三 种比例测得的分枝硫醇的量(μmol/g)相差不大(图12)，随着高氯酸溶液量的增加， 提取效率也没有明显的变化，说明按照1mg湿菌体重量：1μL3％高氯酸水溶液比例就 可以很好的将细胞内的分枝硫醇提取出来，为了更好的提取，选择1mg湿菌体重量：2 μL或3μL3％高氯酸水溶液比例进行提取。
2)高氯酸溶液处理时间对分枝硫醇提取的影响：3％高氯酸溶液加入到谷氨酸棒杆 菌(Corynebacterium glutamicum)细胞中，在冰上放置0.2-6小时后，其分枝硫醇的 含量变化不大，将该提取物放入-70℃保存12小时后，该提取物中分枝硫醇的量降低了 约10％，放置10天后，该提取物中分枝硫醇的量只有原来的30％左右，因此，3％高氯 酸溶液处理0.5小时就可以很好的将细胞中的分枝硫醇提取出来，用3％高氯酸溶液提 取出来的样品必需在12小时内进行检测。3％浓度的高氯酸可以很好的提取出细胞内的 小分子量的硫醇并去除蛋白，分枝硫醇在该溶液中能稳定存在至少6小时(图13)。