一种GFP膜型表达的载体及转染该载体的阳性细胞的分选方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101985634 B (45)授权公告日 2012.06.13 CN 101985634 B *CN101985634B* (21)申请号 201010531802.7 (22)申请日 2010.11.04 C12N 15/85(2006.01) C12N 5/07(2010.01) (73)专利权人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市长乐西路 169 号 (72)发明人 庄然 张圆 金伯泉 李琦 张宇丝 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 陆万寿 US 6316181 B1,2001.11.13, 全。

2、文 . CN 101463362 A,2009.06.24, 全文 . 曲笑霞， 等 . 一个用于转染细胞分选的双顺 反子载体的构建及其应用 .生物化学与生物物 理进展 .2005, 第 32 卷 ( 第 9 期 ),889 894. RAN ZHUANG, ET AL.Purification of GFP fusion proteins with high purity and yield.PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION .2008, 第 59 卷 138-143. (54) 发明名称 一种 GFP 膜型表达的载体及转染该载体的阳 性细胞的分选方法 。

3、(57) 摘要 本发明公开了一种 GFP 膜型表达的载体及转 染该载体的阳性细胞的分选方法， 所述的 GFP 膜 型表达的载体， 包括多克隆位点， 多克隆位点之后 依次连接有核糖体进入位点和编码绿色荧光蛋白 的序列， 构成多克隆位点与绿色荧光蛋白的转录 双顺反子 ； 在核糖体进入位点与编码绿色荧光蛋 白的序列之间插入编码信号肽的序列， 在编码绿 色荧光蛋白的序列终止密码子之前加入编码疏水 性跨膜区的序列。克隆入目的基因的 GFP 膜型表 达载体转染细胞成功之后， 会在细胞表面形成独 特的筛选标签膜型 GFP， 而没有转染成功的 则不会形成。 利益磁场分选结合磁珠的阳性细胞， 简化了筛选步骤， 。

4、可以快速有效富集阳性细胞， 是 一种可以高效分选出转染阳性细胞的技术手段。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴汀晨 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种 GFP 膜型表达的载体， 其特征在于， 包括多克隆位点， 多克隆位点之后依次连接 有核糖体进入位点和编码绿色荧光蛋白的序列， 构成多克隆位点与绿色荧光蛋白的转录双 顺反子 ； 在核糖体进入位点与编码绿色荧光蛋白的序列之间插入编码信号肽的序列， 在编 。

5、码绿色荧光蛋白的序列终止密码子之前加入编码疏水性跨膜区的序列 ； 所述的信号肽的序列如 SEQ.ID.NO.1 所示 ； 所述的疏水性跨膜区序列如 SEQ.ID.NO.2 所示。 2.如权利要求1所述的GFP膜型表达的载体， 其特征在于， 所述的编码信号肽的序列如 SEQ.ID.NO.3 所示 ； 所述的编码疏水性跨膜区的序列如 SEQ.ID.NO.4 所示。 3. 权利要求 1 所述的 GFP 膜型表达载体转染细胞后的阳性转染细胞的分选方法， 其特 征在于， 包括以下步骤 ： 1) 在 GFP 膜型表达载体的多克隆位点插入外源目的基因， 构成外源目的基因与绿色荧 光蛋白的转录双顺反子 ； 然。

6、后在 GFP 膜型表达载体转染宿主细胞后， 收集待分离的细胞制 成单细胞悬浮液 ； 2) 将抗 GFP 单克隆抗体与二抗磁珠混合均匀， 使抗 GFP 单克隆抗体结合到二抗磁珠的 表面 ； 3) 在制成的单细胞悬浮液加入结合了抗 GFP 单克隆抗体的二抗磁珠， 充分混匀， 使结 合了抗 GFP 单克隆抗体的二抗磁珠与 GFP 膜型表达的阳性转染的细胞结合 ； 4) 在磁场作用下， 将结合了二抗磁珠的阳性转染的细胞与未结合二抗磁珠的细胞分 离 ； 收集结合了二抗磁珠的阳性转染的细胞， 并将磁珠与阳性转染的细胞分离， 得到纯化的 阳性转染的细胞。 4. 如权利要求 3 所述的 GFP 膜型表达载体转。

7、染细胞后的阳性转染细胞的分选方法， 其 特征在于， 所述的二抗磁珠是磁珠通过连接 DNA 与能够识别抗 GFP 单克隆抗体的抗体相连 接。 5. 如权利要求 3 所述的 GFP 膜型表达载体转染细胞后的阳性转染细胞的分选方法， 其 特征在于， 所述的抗GFP单克隆抗体为鼠源性抗体， 二抗磁珠是磁珠通过连接DNA与人抗小 鼠的单抗连接。 权 利 要 求 书 CN 101985634 B 2 1/7 页 3 一种 GFP 膜型表达的载体及转染该载体的阳性细胞的分选 方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及外源目的基因表达阳性细胞的筛选， 特别涉及一 种GFP(绿色荧光蛋白)膜型表达。

8、作为分选标记的真核表达载体， 以及利用该载体的进行转 染细胞分选的方法。 背景技术 0002 在现代生物技术中， 利用质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞， 在宿主细胞 中扩增、 转录、 翻译从而使外源基因高效表达是一项非常重要的技术 ； 不管是通过外源基因 的导入改变宿主细胞原有的生物学行为， 还是利用宿主细胞表达具有生物学活性的外源蛋 白都有着十分广泛的应用。但该项技术有一个关键的瓶颈， 就是转染效率不高的问题。 0003 一般而言， 随细胞系和转染试剂的不同， 转染效率也各不相同， 但总体都偏低。由 于转染效率的低下， 目的基因转染宿主细胞后， 不表达外源基因的野生型宿主细胞仍然占 大部。

9、分 ； 这样的异质性细胞群体对于需要研究的特定细胞而言， 大大影响了实验结果的科 学性。 因而， 在基因转染操作完成后， 如何从数量巨大的细胞群中检测并分选出为数极少的 目的基因转染阳性的细胞、 提高转染效率， 就成为建立真核细胞表达系统的一个关键。 0004 目前筛选转染阳性细胞常用的方法是在真核表达载体中加入一段药物抗性基因， 通过在细胞培养体系中加入相应的细胞毒性药物产生选择压力进行筛选， 例如普遍应用的 新霉素抗性基因 (neor)。其原理在于氨基糖苷类抗生素新霉素及其类似物 G418 可以通过 抑制核糖体的功能和蛋白质的合成从而杀死野生型细胞。真核表达载体上携带的 neo 基因 编码。

10、氨基糖苷磷酸转移酶， 其蛋白产物能够分解新霉素和 G418， 可以使转染了目的载体的 阳性细胞获得抗性而能在含有 G418 的选择性培养基中生长。与此原理类似的还有 Zeocin 抗性选择、 Hygromycine 抗性选择、 Puromycine 抗性选择等。 0005 上述的药物抗性基因筛选技术虽然可以有效的去除未导入质粒的野生型细胞， 扩 大了基因转染技术的应用范围， 但仍存在不足之处。具体说来， 对于瞬时转染而言， 尽管抗 性基因的表达和目的基因的表达是同步的， 但在瞬时表达的较短时间 ( 数天 ) 内， 细胞毒 性的抗生素还不能够有效的杀死野生型细胞， 转染后的异质性细胞群仍不能满足。

11、大多数实 验的要求 ； 进行抗性筛选往往是要获得可以长期表达目的基因的稳定细胞株， 这时由于质 粒的抗性基因与目的基因分别属于不同启动子控制下的两个转录本， 其整合到宿主细胞基 因组的过程是随机的， 因而两个基因不一定同时整合到基因组， 即使整合到同一个细胞的 基因组中， 由于基因插入的位置影响， 两个基因并不一定同时表达， 因此通过抗性基因选择 压力的方法对转染细胞进行筛选时， 最终所获得的转染细胞其实是抗性基因稳定表达的细 胞， 而研究者所关心的目的基因表达水平却成为随机数。 而且， 随着培养时间的延长和细胞 传代次数的增加， 同时表达抗性基因和目的基因的细胞负荷较只表达抗性基因的细胞负荷。

12、 要大一些， 在细胞群中占的比例将进一步下降 ( 除外目的基因可以促进细胞增殖的个别特 殊情况)。 这种方案既耗时效率又低， 要分选出表达了目的基因的细胞株通常需耗费一个甚 说 明 书 CN 101985634 B 3 2/7 页 4 至几个月的时间， 而最终获得的细胞株很有可能仍然是异质性细胞群。 0006 所以， 为了解决如何获得高纯度表达外源基因的宿主细胞的问题， 除了开发新的 转染试剂提高转染效率外， 近年来有越来越多的技术应用于如何分选转染了目的基因的阳 性细胞。 利用转染细胞所获得的某些特性， 比如转染细胞表达特异性染色或荧光蛋白， 通过 流式细胞仪来进行分选。 0007 绿色荧光。

13、蛋白 (GFP) 来源于维多利亚多管发光水母， 经基因工程改造后的突变型 GFP 蛋白在 488nm 激光照射下会发出绿色荧光， 其发射峰在 509nm， 处于可见光谱的绿色区 域。GFP 作为一种筛选标记， 在现有商品化的真核表达载体中一般位于两处， 一是在多克隆 位点(MCS)处， 目的基因插入MCS后与GFP形成融合表达， 即成熟蛋白的N端或C端带有GFP 标签 ； 第二种情况是 GFP 位于核糖体进入位点 (IRES) 后， 转录成双顺反子， GFP 游离表达于 细胞质内部。一般而言， GFP 作为筛选标记可以通过流式细胞术分选出转染阳性的细胞群， 但是普通的流式细胞仪不能进行分选操作。

14、， 流式分选依赖于昂贵的大型专业仪器设备 ( 如 BD 公司的 FACS Aria 型 )， 所需费用较高且对细胞有一定的损伤， 使其推广应用受到限制。 0008 近年来， 利用细胞表面的特定蛋白分子， 通过抗原抗体特异性结合反应来分选某 种类型细胞的方法在生命科学研究和临床实践中有着越来越广泛的应用。 例如军事医学科 学研究院裴雪涛等人的发明 “含有 CD34 标志基因用于转染细胞分选的载体的构建及其应 用” ( 公开号 CN1712535A)。利用 CD34 分子作为筛选标志， 可以分选出同时表达目的基因和 CD34 分子的转染阳性细胞， 但该方案仍然存在影响其广泛应用的弊端 ： CD34。

15、 分子是哺乳动 物细胞的天然蛋白， 表达于多种细胞表面， 如造血干 / 祖细胞， 以 CD34 作为标签蛋白分子， 其应用范围就受到局限。CD34 分子可以与 CD62L 分子发生特异性相互作用， 转染细胞异位 表达 CD34 会对部分细胞学实验造成干扰。 发明内容 0009 本发明解决的技术问题在于提供一种 GFP 膜型表达的载体， 以及转染该载体的阳 性细胞的分选方法， 克服上述转染效率低、 耐药细胞假阳性高、 分选技术存在局限的缺陷， 简化传统转染细胞筛选过程， 提高转染细胞的分选效率。 0010 本发明通过以下技术方案实现 ： 0011 一种 GFP 膜型表达的载体， 包括多克隆位点，。

16、 多克隆位点之后依次连接有核糖体 进入位点和编码绿色荧光蛋白的序列， 构成多克隆位点与绿色荧光蛋白的转录双顺反子 ； 在核糖体进入位点与编码绿色荧光蛋白的序列之间插入编码信号肽的序列， 在编码绿色荧 光蛋白的序列终止密码子之前加入编码疏水性跨膜区的序列。 0012 所述的信号肽的序列如 SEQ.ID.NO.1 所示 ； 所述的疏水性跨膜区序列如 SEQ. ID.NO.2 所示。 0013 所述的编码信号肽的序列如 SEQ.ID.NO.3 所示 ； 所述的编码疏水性跨膜区的序列 如 SEQ.ID.NO.4 所示。 0014 GFP 膜型表达载体转染细胞后的阳性转染细胞的分选方法， ， 包括以下步。

17、骤 ： 0015 1) 在 GFP 膜型表达载体的多克隆位点插入外源目的基因， 构成外源目的基因与绿 色荧光蛋白的转录双顺反子 ； 然后在 GFP 膜型表达载体转染宿主细胞后， 收集待分离的细 胞制成单细胞悬浮液 ； 说 明 书 CN 101985634 B 4 3/7 页 5 0016 2) 将抗 GFP 单克隆抗体与二抗磁珠混合均匀， 使抗 GFP 单克隆抗体结合到二抗磁 珠的表面 ； 0017 3) 在制成的单细胞悬浮液加入结合了抗 GFP 单克隆抗体的二抗磁珠， 充分混匀， 使结合了抗 GFP 单克隆抗体的二抗磁珠与 GFP 膜型表达的阳性转染的细胞结合 ； 0018 4) 在磁场作用。

18、下， 将结合了二抗磁珠的阳性转染的细胞与未结合二抗磁珠的细胞 分离 ； 收集结合了二抗磁珠的阳性转染的细胞， 并将磁珠与阳性转染的细胞分离， 得到纯化 的阳性转染的细胞。 0019 所述的二抗磁珠是磁珠通过连接 DNA 与能够识别抗 GFP 单克隆抗体的抗体相连 接。 0020 所述的抗 GFP 单克隆抗体为鼠源性抗体， 二抗磁珠是磁珠通过连接 DNA 与人抗小 鼠的单抗连接。 0021 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ： 0022 1、 本发明提供的 GFP 膜型表达的载体， 绿色荧光蛋白表达后在信号肽的引导下穿 出细胞膜， 并在疏水性跨膜区的作用下固着于细胞膜表面， 成为阳。

19、性转染细胞新的筛选标 签膜型 GFP(mGFP) ； 而同时由于目的基因插入多克隆位点之后将会与绿色荧光蛋白基 因形成转录双顺反子， 实现目的基因和膜型GFP的共表达， 这样膜型GFP就成为了目的基因 被表达的阳性转染细胞的表面分子标记。也即， 克隆入目的基因的 GFP 膜型表达载体转染 细胞成功之后， 会在细胞表面形成独特的筛选标签膜型 GFP， 而没有转染成功的则不会 形成。 0023 而通过针对 GFP 单克隆抗体的特异性结合、 免疫磁珠吸附进行分选细胞， 并且由 于表达的特异性和抗原抗体识别反应的特异性， 这样能够保证所筛选的重组细胞目的基因 和GFP筛选标签阳性表达的一致性 ； 尤其。

20、是膜型GFP作为细胞表面分子标记， 在筛选的时候 只是细胞表面的抗原抗体识别， 能够简化筛选步骤， 实现阳性细胞的快速富集。 0024 2、 常用的真核细胞没有内源性 GFP 基因， 除非外源转染， 否则不表达膜型 GFP 分 子， 膜型 GFP 作为鉴定或选择标记不会造成假阳性结果 ； 而且， 真核细胞上不存在可以与 GFP 高亲和力结合的天然配体蛋白分子， 不会影响表达 GFP 细胞的生物学行为， 减少了实验 操作对结果的干扰。 0025 3、 本发明利用基因工程方法使 GFP 通过跨膜区序列固定于细胞膜表面， 该序列为 29 个疏水性氨基酸构成， 插入细胞膜脂质双层从而将 GFP 分子固。

21、定于细胞膜外表面， 并不 含有胞质区部分， 所以不会转导外界信号而影响细胞的生物学行为。 0026 4、 外源目的基因插入MCS后与mGFP转录成为一条双顺反子mRNA， 绿色荧光蛋白的 氨基端连接有信号肽序列， 羧基端连接有疏水性氨基酸的跨膜区序列， 细胞转染该表达载 体后可以在膜上表达 GFP 蛋白， 同时还可以表达外源目的基因。在同一个启动子下分别表 达两段基因的开放读框， 使得外源目的基因的表达和细胞表面新标志的表达具有良好的相 关性， 而这种相关性保证了分选出的表达膜标志 mGFP 的细胞同时也是表达目的基因的细 胞。 0027 5、 本发明提供的转染 GFP 膜型表达载体的细胞分选。

22、方法， 通过 GFP 抗原抗体特异 性结合、 免疫磁珠吸附、 磁场分选结合磁珠的阳性细胞的流程， 简化了筛选步骤， 可以快速 有效富集阳性细胞， 而避免了抗生素长期筛选的缺陷， 还能够提高转染阳性细胞的筛选比 说 明 书 CN 101985634 B 5 4/7 页 6 率， 是一种可以高效分选出转染阳性细胞的技术手段。 0028 一般而言， 普通哺乳动物细胞的转染效率在 20左右， 即转染后的细胞群中有大 约 20的细胞表达目的基因 ； 而通过本技术的分选， 富集阳性细胞， 使阳性细胞比例上升 到 95以上。 附图说明 0029 图 1 是本发明构建的膜型 GFP 表达载体 pIRES-mG。

23、FP 的质粒图谱 ； 0030 图 2 是转染膜型 GFP 表达载体的细胞分选方法的流程示意图。 具体实施方式 0031 本发明构建了一种 GFP 膜型表达的载体， 在多克隆位点之后依次连接有核糖体进 入位点和编码绿色荧光蛋白的序列， 构成多克隆位点与绿色荧光蛋白的转录双顺反子， 使 得绿色荧光蛋白与插入多克隆位点的目的基因共表达 ； 而且在编码绿色荧光蛋白的序列终 止密码子之前加入编码疏水性跨膜区的序列 ； 20 个疏水性氨基酸的信号肽序列 (leading sequence， LS) 如 SEQ.ID.NO.1 所示， 作为跨膜区 (transmembrane sequence， TM) 。

24、的 29 个 疏水性氨基酸的序列如 SEQ.ID.NO.2 所示。 0032 这样使得与目的基因共表达的绿色荧光蛋白在信号肽的引导下穿出细胞膜， 并在 疏水性跨膜区的作用下固着于细胞膜表面， 成为阳性转染细胞新的筛选标签膜型 GFP。 0033 本发明提供的转染 GFP 膜型表达载体的细胞分选方法， 不仅简化了传统的转染细 胞筛选烦琐又耗时的过程， 而且提高了转染细胞的分选效率， 在生命科学领域将会有广泛 的应用。 0034 一种膜型表达绿色荧光蛋白作为分选标记的真核表达载体， 编码绿色荧光蛋白的 序列位于核糖体进入位点之后， 构建成多克隆位点与绿色荧光蛋白的转录双顺反子， 在核 糖体进入位点。

25、与编码绿色荧光蛋白的序列之间插入 0035 下面对 GFP 膜型表达的载体做详细说明 ： 0036 首先， 选择绿色荧光蛋白 (GFP) 作为细胞表面标志分子。GFP 作为细胞膜表面标 志， 有以下几方面的优点 ： 1.GFP 对细胞毒性极低， 瞬时和稳定表达均不影响细胞的存活与 生物学行为， 目前已经广泛应用于生命科学的诸多研究领域 ； 2.GFP 三维结构是典型的 桶形， 包含 折叠和 螺旋， 将荧光基团包含在其中， 具有良好的防淬灭结构， 可以耐受 较长时间的操作 ； 3.GFP 受激发后发出明亮的绿色荧光， 转染细胞可以通过荧光显微镜、 板 式荧光定量仪或流式细胞仪等多种仪器定性定量的。

26、检测 ； 4. 常用的真核细胞没有内源性 GFP 基因， 除非外源转染， 否则不表达 GFP 分子， 作为鉴定或选择标记不会造成假阳性结果 ； 5. 在真核细胞上不存在可以与 GFP 高亲和力结合的天然配体蛋白分子， 不会影响表达 GFP 细胞的生物学行为， 减少了实验操作对结果的干扰。 0037 其次， 通过在 IRES 与 GFP 之间插入信号肽序列 (leading sequence， LS)， 在 GFP 终止密码子前加入跨膜区 (transmembrane sequence， TM) 序列， 该基因工程操作使得 GFP 表达后穿出并锚定于细胞膜外侧表面， 成为转染细胞新的筛选标签 -。

27、 膜型 GFP， 称为 mGFP。 TM 序列仅插入细胞膜脂质双层， 不含胞质区部分， 不会传递细胞外信号而影响细胞的生物 学行为。 说 明 书 CN 101985634 B 6 5/7 页 7 0038 由于 IRES 序列的作用， 外源目的基因插入 MCS 后与 mGFP 转录成为一条双顺反子 mRNA， 在同一个启动子下分别表达两段基因的开放读框 (ORF)。因此， 宿主细胞经过转染操 作后， 如果膜上表达 GFP 标签蛋白， 则一定会表达外源目的基因。这样的基因工程改建， 可 以使得外源目的基因的表达和细胞表面新标志的表达具有良好的相关性， 而这种相关性保 证了分选出的表达膜标志 mG。

28、FP 的细胞同时也是表达目的基因的细胞。 0039 下面以 PIRES2-AcGFP1 载体到如图 1 所示的 PIRES2-mGFP 载体的构建为实施例， 说明绿色荧光蛋白作为分选标记的真核表达载体的构建过程。 0040 pIRES2-AcGFP 载体到 pIRES2-mGFP 载体的构建步骤 ： 0041 化学合成编码信号肽与跨膜区序列的核苷酸， 5 端添加 BstXI 位点， 3 端添加 XbaI 位点， 两者中间设计加入 BamHI、 KpnI、 EcoRI、 HindIII 四种酶切位点 ( 即从 5 端到 3端为 ： BstXI-LS-(BamHI、 KpnI、 EcoRI、 Hi。

29、ndIII)-TM-XbaI)， 序列以 T-A 克隆方式插入 pUC57-T-simple 载体， 命名为 pUC-LSTM， 其中编码信号肽的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.3 所 示， 编码跨膜区序列的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.4 所示。 0042 以 pIRES2-AcGFP 载体 (Clontech 公司， 货号 632435) 为模板， 设计引物扩增出 GFP， 并在 GFP 片段两端添加 BamHI 和 HindIII 位点， 酶切后连入上述 pUC-LSTM 载体， 命名 为 pUC-LGT ； 0043 用 BstXI 和 XbaI 酶 从 上 述 pUC-LGT 。

30、载 体 中 切 出 LS-GFP-TM，并 酶 切 pIRES-AcGFP， 分别胶回收片段和载体 ； 0044 连接 LS-GFP-TM 和切除 GFP 的 pIRES-AcGFP 载体， 构建成功载体 pIRES2-mGFP。 0045 通过上述基因工程操作， 原有的pIRES2-AcGFP载体改构成为表达膜型GFP蛋白的 pIRES2-mGFP 载体。 0046 参见图 2， 转染 GFP 膜型表达载体的细胞分选方法， 包括以下步骤 ： 0047 1) 通过基因工程方法， 将需要研究的目的基因核酸片段插入到上述载体的多克隆 位点处， 构建表达外源目的基因的 GFP 膜型表达载体 ； 利用。

31、脂质体介导法或是磷酸钙介导 法或是电穿孔法等方法将构建成功的表达载体转染宿主细胞， 24 48 小时后收集转染细 胞， 制成单细胞悬浮液 ； 0048 2) 将抗 GFP 单克隆抗体与二抗磁珠混合均匀， 使抗 GFP 单克隆抗体结合到二抗磁 珠的表面 ； 0049 3) 在制成的单细胞悬浮液加入结合了抗 GFP 单克隆抗体的二抗磁珠， 充分混匀， 使二抗磁珠与阳性转染的细胞表面表达的膜型 GFP 结合 ； 0050 4) 利用外界磁场分选出表达膜型 GFP 的转染阳性细胞， 再利用剪切缓冲液 (Releasing Buffer) 作用， 使表达膜型 GFP 的转染阳性细胞与免疫磁珠分离， 从而。

32、得到分 选纯化的转染阳性细胞。 0051 下面对该方法做详细说明。主要的商品化试剂和器材 ： 抗鼠二抗磁珠 ： CELLectionTM Pan Mouse IgG Kit 试剂盒 (Dynal 公司， 货号 115-31D) ； 磁架， 用来提供 外界磁场， 采用 Dynal MPC-S 型磁架 (Dynal 公司， 货号 120-20D) ； RPMI1640 细胞培养基 (Hyclone 公司 ) ； 新生牛血清 ( 四季青公司 ) ； 牛血清白蛋白 BSA(Sigma 公司 ) ； 垂直混合 仪 ( 宁波新芝公司 HS-3 型 )。 0052 白行配制试剂 ： PBS 缓冲液 ： 0.。

33、15mol/L， pH 7.4 ； Buffer1 ： 含质量 / 体积比为 说 明 书 CN 101985634 B 7 6/7 页 8 0.1 BSA 的 PBS 缓冲液 ； Buffer2 ： 含有体积比为 1的新生牛血清的 RPMI1640 细胞培养 基 ； 特异性结合 GFP 的鼠源性单克隆抗体 FMU-GFP.5。 0053 1、 转染细胞的收集 0054 利用脂质体介导法或是磷酸钙介导法或是电穿孔法等方法将构建成功的表达载 体转染宿主细胞， 24 48 小时后收集转染细胞， 制成单个细胞悬浮液。 0055 如果宿主细胞是悬浮培养细胞， 则 1200rpm， 5min 离心， 弃上。

34、清， 用适当体积的新 鲜培养基重悬细胞沉淀 ； 如果是贴壁培养的细胞， 需要吸尽培养基， 用 0.25胰酶 -0.02 EDTA-PBS 缓冲液进行消化， 使细胞变为悬浮状态， 然后 1200rpm， 5min 离心， 弃上清， 用适当 体积的新鲜培养基重悬细胞沉淀， 制成单个细胞悬浮液。 0056 2) 抗 GFP 的单克隆抗体与二抗磁珠的结合 ： 0057 取 100l 二抗磁珠混悬液 ( 含 4107个磁珠 )， 加入 1ml Buffer1 充分洗涤后， 于磁架上静置 1min， 吸弃上清， 加入 1ml Buffer1 混匀 ； 再加入 2g 单抗 FMU-GFP.5， 置于 垂直混。

35、匀仪上 4颠倒混匀 30 60min ； 于磁架上静置 1min， 吸弃上清， 再用 Buffer1 洗涤 2 次。 0058 抗GFP的单克隆抗体可以是商品化试剂或者白行制备， 商品化试剂 ： 包括Sigma在 内的多家生物技术公司都有商品化的单克隆抗体提供。 0059 本发明的实施例选择 FMU-GFP.5 单抗， 该单抗的制备方法 ： 免疫原采用的是原 核表达的重组 GFP 蛋白， 免疫 Balb/c 小鼠， 取脾细胞与 Sp2/0 骨髓瘤细胞融合， 经间接 ELISA 法筛选、 有限稀释法克隆化得到可以结合 GFP 蛋白的单克隆抗体。具体方法见已公 开文献 ： Ran Zhuang， 。

36、Yuan Zhang， Rui Zhang， Chaojun Song， Kun Yang， Angang Yang， Boquan Jin.Purification of GFP fusion proteins with high purity and yield by monoclonal antibody-coupled affinity column chromatography.Protein Expression and Purification.2008 ； 59(1) ： 138-143， 本领域的研究人员可以方便的从上述文献公开 的实验室索取 FMU-GFP.5 单抗。本步骤。

37、所需抗 GFP 特异性单抗也可以从生物技术公司购买 获得， 例如碧云天生物技术公司 ( 产品货号 ： AG281)。 0060 3) 加入结合有抗 GFP 单克隆抗体的二抗磁珠 0061 抗 GFP 的单克隆抗体与二抗磁珠结合后加入到制成的单个细胞悬浮液中， 在液相 缓冲系统中， 固相化的特异性结合 GFP 的 GFP 抗单克隆抗体可以高亲和力的结合表达膜型 GFP 的阳性转染细胞。 0062 4) 利用外界磁场分选表达特定膜表面标志的细胞 0063 1、 用 Buffer1 调整转染细胞密度为 1107， 取 1ml 细胞悬液与结合有单抗的磁珠 混匀， 置垂直混匀仪上 4颠倒混匀 20min。

38、 ； 然后于磁架上静置 2min， 吸弃上清以去除未结 合磁珠的阴性细胞 ； 加入 1ml Buffer1 混匀， 于磁架上静置 1min， 吸弃上清， 重复 3 次洗涤 细胞， 最后一次吸尽上清。 0064 2、 加入 200l 于 37预热的 Buffer2 重悬细胞， 加入 4l DNase I 溶液消化连 接免疫磁珠与人抗小鼠单抗间的连接 DNA( 商品化试剂免疫磁珠上具有的连接抗体与磁珠 的 DNA 链或连接 DNA)， 室温下颠倒混匀 15min， 用移液器吸头用力吹打混悬液 5 10 次以 使免疫磁珠与阳性细胞解离。于磁架上静置 2min， 吸弃上清， 重复 3 次洗涤细胞。获得。

39、的细 胞即为高纯度的转染阳性细胞。 说 明 书 CN 101985634 B 8 7/7 页 9 0065 实施例 1 ： pIRES2-mGFP-CD226 载体的构建 0066 将 CD226 基 因 插 入 如 图 1 所 示 的 pIRES2-mGFP 载 体。CD226 基 因 来 源 于 pEF-BOS-CD226 载体， 根据 pIRES2-mGFP 多克隆位点限制性酶切位点和 CD226 的开放读框 ORF 基因序列， 设计引物引入 XhoI 和 BamHI 酶切位点， 引物序列和高保真 PCR 反应条件如 下 ： 0067 P1 ： gcctcgagat ggattatcct。

40、 actttact 28( 下划线为 XhoI 位点 ) 0068 P2 ： ggggatcctt aaactctagt ctttggtct 29( 下划线为 BamHI 位点 ) 0069 100l 反应体系包括 ： pEF-BOS-CD226 质粒 0.1l， 引物 P1 和 P2(10M) 各 5ul， dNTP(2.5mM)8ul， 高保真 DNA 聚合酶 PrimerStar(TaKaRa 公司 )0.5l， 5PCR Buffer 20ul， 双蒸水81.4l。 反应条件 ： 94预变性5min ； 94变性30sec ； 59退火45sec， 72 延伸 90sec ； 35 个。

41、循环 ； 72延伸 10min。 0070 PCR 产物经快速纯化试剂盒提纯后， 采用 XhoI 和 BamHI 进行双酶切， 再次进行 快速纯化 ； 同时取 pIRES2-mGFP 用 XhoI 和 BamHI 进行双酶切， 使用快速纯化试剂盒提纯。 酶切后的 PCR 产物和线性载体在 T4DNA 连接酶作用下连接， 条件为 ： 16， 过夜反应。转 化大肠杆菌 E.coli， 铺 Kan 抗性 LB 平板， 37过夜培养后挑取克隆进行鉴定， 获得质粒 pIRES2-mGFP-CD226。 0071 实施例 2 ： pIRES2-mGFP-CD226 载体转染 CHO 细胞 0072 用含有。

42、 10新生牛血清的 DMEM 细胞培养基在 75cm2 培养瓶中培养 CHO 细胞， 至 80汇合率， 吸尽培养基， 用0.25胰酶-0.02EDTA-PBS缓冲液进行消化， 使细胞变为悬 浮状态， 将细胞转入 15ml 离心管中， 1200rpm， 5min 离心， 弃上清， 用适当体积的电穿孔缓冲 液重悬细胞沉淀， 然后 1200rpm， 5min 离心弃上清， 洗涤细胞 2 次， 制成单个细胞悬浮液， 计 数细胞， 将细胞重新悬浮于电穿孔缓冲液中， 调整细胞终浓度为 1107个细胞 /ml。取 1ml 细胞悬液放入电转杯中， 加入50g重组载体pIRES2-mGFP-CD226， 冰浴1。

43、0min， 电穿孔法转 染 CHO 细胞， 电穿孔仪参数设置 ： 电压 300V， 电量 250F。转染后用适量的培养基稀释细 胞， G418 选择性培养 48h， 按前述方法收获细胞。 0073 实施例 3 ： 转染阳性细胞的免疫磁珠分选 0074 取 100ul 二抗磁珠混悬液 ( 含 4107个磁珠 )， 加入 1ml Buffer1 充分洗涤， 于磁 架上静置1min， 吸弃上清， 加入1ml Buffer1混匀， 加入2g单抗FMU-GFP.5， 置于垂直混匀 仪上颠倒混匀， 4， 30 60min。于磁架上静置 1min， 吸弃上清， 再用 Buffer1 洗涤 2 次 ； 007。

44、5 电穿孔转染后 CHO 细胞常规培养 48 小时， 使外源基因得以表达。吸尽培养基， 用 0.25胰酶 -0.02 EDTA-PBS 缓冲液进行消化， 使细胞变为悬浮状态， 将细胞转入 15ml 离 心管中， 1200rpm， 5min离心， 弃上清， 用适当体积Buffer1洗涤细胞2次， 并调整细胞密度为 1107。取 1ml 细胞悬液与结合有单抗的磁珠混匀， 置垂直混匀仪上颠倒混匀， 4， 20min ； 然后于磁架上静置2min， 吸弃上清以去除未结合磁珠的阴性细胞。 加入1ml Buffer1混匀， 于磁架上静置 1min， 吸弃上清， 重复 3 次洗涤细胞， 最后一次吸尽上清。 。

45、0076 加入 200ul 于 37预热的 Buffer2 重悬细胞， 8 加入 4ul DNase I 溶液消化连接 DNA， 以切断磁珠与阳性细胞的连接， 室温下颠倒混匀 15min， 用移液器吸头用力吹打混悬液 5-10 次以使细胞与磁珠分离。于磁架上静置 2min， 吸弃上清， 重复 3 次洗涤细胞。获得的 细胞即为高纯度的转染阳性细胞， 可直接进行下一步的分析或者加入培养基后继续培养。 说 明 书 CN 101985634 B 9 1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 101985634 B 10 2/2 页 11 序 列 表 CN 101985634 B 11 1/1 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101985634 B 12 。