发明领域
本发明关注具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体及其制备方法。
发明背景
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞溶胞。已知在人IgG类的抗体中，IgG1亚类具有最高的ADCC活性和CDC活性，而且当前临床肿瘤学实践中的大多数人源化抗体，包括商品化的HERCEPTIN(曲妥单抗)和RITUXAN(利妥昔单抗)(它们需要高效应器功能来实现它们的效果)是人IgG1亚类的抗体。
为了增强治疗性抗体的效力，常常希望在效应器功能方面修饰抗体，例如为了增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这在肿瘤学领域会是特别有益的，其中治疗性单克隆抗体结合肿瘤细胞上的特定抗原并诱导免疫应答，导致对肿瘤细胞的破坏。通过增强IgG与携带Fc受体的杀伤细胞的相互作用，能使得这些治疗性抗体更有效力。
效应器功能，诸如ADCC的增强可以通过多种手段来实现，包括在抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸替代。或者/另外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，由此容许在此区域中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改良的内在化能力和/或升高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)及Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用异双功能交联剂来制备，如Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中所记载的。或者，可改造抗体，其具有双重Fc区且可由此具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
另一种增强抗体(包括IgG类的抗体)的效应器功能的办法是改造抗体Fc区的糖基化样式。IgG分子含有N-连接的寡糖，其共价附着于Fc区中每个CH2结构域的保守Asn297。在血清IgG的Fc区中找到的寡糖大多是复合类型的双触角聚糖。已经报告了多种抗体糖型对抗体效应器功能(包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))具有正影响。如此，Fc部分的碳水化合物成分的糖工程，特别是还原性核心岩藻糖基化，已经报告于Shinkawa T，et al.，J Biol Chem.2003；278：3466-73；Niwa R，et al.，Cancer Res 2004；64：2127-33；Okazaki A，et al.，J Mol Biol 2004；336：1239-49；及Shields RL，et al.，J BiolChem 2002；277：26733-40。
具有选定糖型的抗体已经通过多种手段生成，包括使用糖基化途径抑制剂，具有缺失的或降低的糖基化途径中特定酶活性的突变细胞系，糖基化途径中的基因表达增强或敲除的改造细胞，及用糖苷酶和糖基转移酶体外再塑。Rothman et al.，1989；Molecular Immunology 26：1113-1123在存在葡萄糖苷酶抑制剂澳粟精胺和N-甲基脱氧野艽霉素和甘露糖苷酶I抑制剂脱氧甘露糖野艽霉素下表达单克隆IgG。Umana et al.，Nature Biotechnology 1999；17：176-180记载了表达GNT-III的CHO细胞系中表达的嵌合IgG1的增强的效应器功能。Shields et al.，2002；JBC 277：26733-26740，2002记载了其添加岩藻糖的能力缺陷的Lec13细胞系中表达的人IgG1的增强的ADCC。Shinkawa et al.，2003；JBC 278：3466-3473，2003显示了YB2/0细胞中表达的抗CD20 IgG1显示比那些由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系所生成的高超过50倍的ADCC，其中使用纯化的人外周血单个核细胞细胞作为效应器。单糖组成和寡糖序型分析显示了与CHO生成的IgG1的高岩藻糖(Fuc)含量相比，复合型寡糖的低Fuc含量在YB2/0生成的IgG1中是特征性的。Kanda et al.，2006；Glycobiology 17，104-118记载了携带无岩藻糖基复合物，无岩藻糖基杂合物，Man5，和Man8，9聚糖的利妥昔单抗中增强的ADCC。Yamane-Ohnuki et al.，Biotechnol Bioeng 2004；87：614-22通过在缺乏核心岩藻糖基转移酶活性的CHO细胞中重组抗体表达实现了核心岩藻糖基化降低，而Mori et al.，Biotechnol Bioeng 2004；88：901-8使用岩藻糖基转移酶特异性短干扰RNA(siRNA)使所表达的抗体的效应器功能最大化。
主要携带Man5糖型的抗体已经记载于Wright and Morrison；1994，J.Exp.Med.180：1087-1096；1998；J.Immunology 160：3393-3402。抗体在不具有活性GlcNAc转移酶I的lec1细胞系中表达。根据J.Exp.Med.论文的图8中的两阶段清除曲线判断，看来有至少两种具有不同清除特征的不同抗体群。清除更快速的IgG群大概是携带Man7，8，9糖型的抗体。
发明概述
一方面，本发明关注一种缺乏GlcNAc转移酶I活性的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段。在一个具体的实施方案中，所述哺乳动物细胞还具有增强的α-1，2-甘露糖苷酶(在本文中也称作α-甘露糖苷酶I)活性。
另一方面，本发明关注一种其中GlcNAc转移酶I活性通过RNAi敲低被降低的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段。在一个具体的实施方案中，所述哺乳动物细胞还具有增强的α-1，2-甘露糖苷酶活性。
另一方面，本发明关注一种其中GlcNAc转移酶I活性通过RNAi敲低被降低且其还可具有增强的α-1，2-甘露糖苷酶活性的哺乳动物细胞，这足以产生包含5％或更多，或10％或更多，或20％或更多，或25％或更多，或30％或更多，或35％或更多Man5，Man6聚糖的碳水化合物结构，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。
另一方面，本发明关注一种其中GlcNAc转移酶I活性通过高尔基UDP-GlcNAc转运蛋白RNAi敲低被降低且其还可具有增强的α-1，2-甘露糖苷酶活性的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。
又一方面，本发明关注一种其中GlcNAc转移酶I活性通过高尔基UDP-GlcNAc转运蛋白RNAi敲低被降低且GlcNAc转移酶I通过RNAi也被敲低的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段，其中the片段包含至少一个糖基化位点。
还有一方面，本发明关注一种用于制备主要携带Man5聚糖的抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段的方法，包括在使得所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段生成的条件下培养依照权利要求2或权利要求22的哺乳动物细胞系。
又一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中具有受控量的Man5聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在由于RNAi敲低而具有降低的GlcNAc转移酶I活性的哺乳动物细胞系中表达编码所述抗体或抗体片段的核酸。
仍有一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在存在α-1，2-甘露糖苷酶下培养缺乏GlcNAc转移酶I活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述抗体，免疫粘附素，或其片段，或者使所表达的产物接触此类α-1，2-甘露糖苷酶，其中Man7，8，9聚糖被转变成Man5，6聚糖。
仍有一方面，本发明关注一种用于制备携带5％或更多，或10％或更多，或20％或更多，或25％或更多，或30％或更多，或35％或更多Man5聚糖的抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段的方法，包括在使得所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段生成的条件下培养依照权利要求2或权利要求14的哺乳动物细胞系，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。
本发明还关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在存在α-1，2-甘露糖苷酶下培养由于RNAi敲低而具有降低的GlcNAc转移酶I活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述抗体，免疫粘附素，或其片段，或者使所表达的产物接触此类α-1，2-甘露糖苷酶，其中Man7，8，9聚糖被转变成Man5，6聚糖。
另一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在存在毒性凝集素下培养哺乳动物细胞系以选择出具有降低的GlcNAc转移酶I活性的克隆，改造一个或多个所述具有降低的GlcNAc转移酶I活性的克隆来在存在α-1，2-甘露糖苷酶下表达所述抗体，免疫粘附素，或其片段，或者使所表达产物接触α-1，2-甘露糖苷酶，其中Man7，8，9聚糖被转变成Man5聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。在一个具体的实施方案中，所述甘露糖苷酶是用于重组生产的细胞中内源的。
还有一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5聚糖的抗体，免疫粘附素，或其片段的方法，包括在存在α-1，2-甘露糖苷酶下培养缺乏UDP-GlcNAc转运蛋白活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述抗体，免疫粘附素，或其片段，或者使所表达的产物接触此类α-1，2-甘露糖苷酶，其中Man7，8，9聚糖被转变成Man5聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点。在一个具体的实施方案中，所述甘露糖苷酶是用于重组生产的细胞中内源的。
在所有方面中，所述哺乳动物细胞系可以是例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
在所有方面中，本发明的细胞系和方法可用于生产任何抗体，包括但不限于诊断上或治疗上感兴趣的抗体，诸如结合一种或多种下述抗原的抗体：CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD22，CD34，CD40，EGF受体(EGFR，HER1，ErbB1)，HER2(ErbB2)，HER3(ErbB3)，HER4(ErbB4)，LFA-1，Mac1，p150，95，VLA-4，ICAM-1，VCAM，αv/β3整联蛋白，CD11a，CD18，CD11b，VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C，DR5，EGFL7，neuropilin及受体，导蛋白及受体，slit及受体，sema及受体，脑信号蛋白及受体，robo及受体，和M1。
所述抗体和抗体片段可以是嵌合的或人源化的，而且具体包括嵌合的和人源化的抗CD20抗体，其中，在一个具体的实施方案中，所述抗体是rituximab或ocrelizumab。
在另一个实施方案中，所述人源化抗体是HER2，抗HER1，抗VEGF或抗IgE抗体，包括但不限于trastuzumab，pertuzumab，bevacizumab，ranibizumab，和omalizumab，以及此类抗体的片段，变体和衍生物。
抗体片段包括例如互补决定区(CDR)片段，线性抗体，单链抗体分子，微型抗体，双抗体，自抗体片段形成的多特异性抗体，和含有免疫球蛋白至少一部分的多肽，该部分足以赋予多肽以特异性抗原结合，前提是它们是糖基化的。
附图简述
图1描绘N-聚糖生物合成途径的一部分。
图2。用于添加N端FLAG标签至GlcNAc转移酶I(GnT-I)蛋白质的质粒载体(Stratagene)。
图3。用于表达小抑制性RNA的质粒载体(Ambion，Austin.TX)。
图4。siRNA探针序列(SEQ ID NO：2-6)及其在全长GnT-I基因中的相对位置(圆括号中)。每一种siRNA探针序列标有下划线(a)。接近BamHI位点的标有下划线的序列与GnT-I mRNA序列互补。两种标有下划线的序列彼此互补，导致形成发夹环siRNA。
图5。对来自各siRNA探针和带FLAG标签的GnT-I构建物的共转染的溶胞物的Western印迹分析。五种siRNA表达构建物以及空载体与带FLAG标签的GnT-I构建物瞬时共转染。使用抗FLAG抗体(Sigma MO)通过Western印迹分析含有等量细胞蛋白质的细胞溶胞物。
图6A。生成ocrelizumab的细胞系用siRNA表达质粒瞬时转染。转染后第1，2和5天收集来自每种样品条件的细胞团粒，然后分离mRNA，供TaqMan分析用。对照的GnT-I mRNA表达水平设为100％。
图6B。来自每份用所示RNAi载体转染的样品的转染后第5天的Man5水平。
图7。为一项14天的实验，杂乱和RNAi13载体瞬时转染入ocrelizumab生成细胞系。使用CE-聚糖测定所示培养期间收集的HCCF的Man5水平。误差棒代表来自两次运行的标准偏差。
图8A。CHOα-甘露糖苷酶I的cDNA序列。
图8B。CHO和小鼠α-甘露糖苷酶I之间的氨基酸序列比对。
图8C。SV40GS.CMV.Man1.RNAi13表达质粒的构造。
图9A。通过TAQMAN测定法测定的稳定克隆中的相对GnT-I mRNA水平。对照代表未转染基线中的GnT-I水平。
图9B。14天的生产运行结束时稳定克隆的Man5水平。通过CE-聚糖分析测定Man5％。
图10A。培养期间各天的Man5水平。通过CE-聚糖测定法测定Man5水平，而误差棒代表标准偏差。
图10B。22天培养后Man5水平的比较。测试基本培养基中的四种不同摩尔渗透压浓度(300，330，360，400mOsm)。通过CE-聚糖测定法测定Man5水平。
图10C。总共14天的培养的不同天添加MnCl2下的Man5水平。通过CE-聚糖测定法测定Man5水平。
图10D。不同细胞培养条件下GnT-I敲低克隆6D的Man5水平(CE-聚糖测定法)。对照代表标准生产培养基。高osmo代表基本培养基中的摩尔渗透压浓度升高至400mOsm。无Mn代表缺乏锰的标准生产培养基。
图11。抗体对Fcγ受体IIIa-V158的结合。空心圆形代表HERCEPTIN(trastuzumab)，空心正方形代表RITUXAN(rituximab)，空心三角形代表具有5％Man5(7-9％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体，空心菱形代表具有16％Man5(14.6％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体，而实心圆形代表具有62％Man5(11％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体。
图12。抗体对Fcγ受体IIIa-F158的结合。空心圆形代表HERCEPTIN(trastuzumab)，空心正方形代表RITUXAN(rituximab)，空心三角形代表具有5％Man5(7-9％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体，空心菱形代表具有16％Man5(14.6％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体，而实心圆形代表具有62％Man5(11％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体。
发明详述
I.定义
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如如本文所述从血液或PBMC分离。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)；Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))，并介导较慢的异化，和如此较长的半衰期。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子(例如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域中的残基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变域中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域中的残基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。
术语“框架区”指在更加趋异的CDR区间存在的公认的抗体可变区部分。此类框架区通常指框架1至4(FR1，FR2，FR3，和FR4)，而且在三维空间中为支持在重链或轻链抗体可变区中找到的三个CDR提供支架，使得CDR能形成抗原结合表面。
根据其重链恒定域氨基酸序列，抗体可归入不同的类。抗体分成五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。
将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“单克隆抗体”用于指由单一克隆合成的抗体分子。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。如此，单克隆抗体可以通过首次由Kohler and Milstein，Nature 256：495(1975)；Eur.J.Immunol.6：511(1976)记载的杂交瘤方法，通过重组DNA技术来制备，或者也可以自噬菌体或其它抗体文库分离。
术语“多克隆抗体”用于指由一群B细胞合成的一群抗体分子。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合域或可变域。抗体片段的例子包括但不限于Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，(scFv)2，dAb，和互补决定区(CDR)片段，线性抗体，单链抗体分子，微抗体，双抗体，自抗体片段形成的多特异性抗体，及一般而言至少含有免疫球蛋白的足以赋予多肽以特异性抗原结合的一部分的多肽。本发明的范围内具体有双特异性抗体片段。
抗体是在Fc区中有糖基化的糖蛋白。如此，例如，IgG免疫球蛋白的Fc区是包含链间二硫键合的铰链区，在天冬氨酸297(Asn-297)处携带N-连接的寡糖的糖基化CH2域，和非共价配对的CH3域的同二聚体。糖基化在FcγRI，FcγRII，FcγRIII，和C1q介导的效应器机制中发挥重要作用。如此，本发明的抗体片段必然包括糖基化Fc区和抗原结合区。
术语“双特异性抗体”和“双特异性抗体片段”在本文中用于指对至少两种靶物具有结合特异性的抗体或抗体片段。如果需要，可以通过多效价来组合多特异性，以生成对它们的每一种靶物拥有超过一个结合位点的多价双特异性抗体。例如，通过经螺旋-转角-螺旋基序二聚化两个scFv融合物，(scFv)1-铰链-螺旋-转角-螺旋-(scFv)2，生成了四价双特异性微型抗体(Müller et al.，FEBS Lett.432(1-2)：45-9(1998))。所谓的“双-二-微型抗体”对它的每一种靶抗原拥有两个结合位点。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密，非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，各可变域的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链中。优选的是，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述参见Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，Vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994。HER2抗体scFv片段记载于WO93/16185；美国专利No.5,571,894；及美国专利No.5,587,458。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性，亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠，大鼠，兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“裸抗体”或“裸露的抗体”指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块，或放射性标记物的抗体(如本文中所定义的)。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶，激素，和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至根据非还原性SDS-PAGE，CD-SDS，或Bioanalyzer的测定，抗体重量超过95％。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”，例如受体，配体或酶)的结合域与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(抗原结合位点)(即是“异源”的)，具有期望结合特异性的粘附素氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型，IgA，IgE，IgD或IgM。关于免疫粘附素，配体结合域和受体结合域的更多详情参见例如美国专利No.5,116,964；5,714,147；及6,406,604，通过述及将明确其公开内容收入本文。
II.详细说明
本发明提供一种通过操纵生成抗体或抗体样分子的重组哺乳动物宿主细胞的糖基化机械在哺乳动物宿主细胞中制备主要携带Man5聚糖但具有降低量的Man7，Man8，和Man9的的抗体和抗体样分子，诸如Fc融合蛋白(免疫粘附素)的方法。
用于重组生产抗体的一般方法
本文中的抗体和其它重组蛋白可通过重组DNA技术的公知技术来生产。如此，在上文具体鉴定的抗体之外，熟练从业人员能生成针对感兴趣抗原的抗体，例如使用下文所述技术。
依照本发明生产的抗体针对感兴趣抗原。优选的是，所述抗原是生物学重要多肽，而且给患有疾病或病症的哺乳动物施用所述抗体能在该哺乳动物中产生治疗性好处。然而，也涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见美国专利No.5,091,178)的抗体。若抗原是多肽，则它可以是跨膜分子(例如受体)或配体(诸如生长因子)。本发明所涵盖的抗体的例示性分子靶物包括CD蛋白，诸如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD22，CD34，CD40；ErbB受体家族的成员，诸如EGF受体(EGFR，HER1，ErbB1)，HER2(ErbB2)，HER3(ErbB3)或HER4(ErbB4)受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1，Mac1，p150，95，VLA-4，ICAM-1，VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗CD11a，抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C，neutropilin及受体，EGF-C，肝配蛋白及受体，导蛋白及受体，slit及受体，抗M1，或本文所述任何其它抗原。上文所列抗体所针对的抗原明确包括在本发明范围内。
为了重组生产抗体，可以分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体中，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。在另一个实施方案中，可以通过同源重组来生产抗体，例如如美国专利No.5,204,244中所记载的，通过述及明确收入本文。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列，复制起点，一种或多种标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列，例如如1996年7月9日公告的美国专利No.5,534,615中所记载的，通过述及明确收入本文。
本发明的抗体必然是糖基化的，且如此适合于克隆或表达编码抗体链或其它抗体样分子的DNA的宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞。哺乳动物宿主细胞得到很大关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
将宿主细胞用用于抗体生产的表达或克隆载体转化，并在为了诱导启动子，选择转化子，或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。
可以在多种培养基中培养哺乳动物宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)，极限必需培养基(MEM，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素，运铁蛋白或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲剂(诸如HEPES)，核苷酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GentamycinTM药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度，pH等，就是那些先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言会是显而易见的。
可以使用例如羟磷灰石层析，离子交换层析，凝胶电泳，透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，主要的纯化步骤是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1，人γ2或人γ4重链的抗体(Lindmark等，1983，J.Immunol.Meth.62：1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，1986，EMBO J.5：1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可使用BAKERBOND ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离，乙醇沉淀，反相HPLC，硅土上的层析，肝素SEPHAROSETM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂上的层析，层析聚焦，SDS-PAGE，疏水相互作用层析，和硫酸铵沉淀。
在任何初步的纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可以进行别的纯化步骤以实现期望的纯度水平。
人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中本质上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于制备人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体的人FR(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，CDR残基直接且最实质性地涉及对抗原结合的影响。
或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol.，7：33(1993)；及Duchosal等，Nature，355：258(1992)。还可从噬菌体展示库衍生人抗体(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech.，14：309(1996))。
多特异性抗体具有对至少两种不同抗原的结合特异性。尽管此类分子通常只结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。
依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如，可以将异源偶联物中的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，及EP 03089)。异源偶联抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No.4,676,980。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.J.Immunol.147：60(1991)。
免疫粘附素s
最简单且最直接的免疫粘附素设计将粘附素的结合结构域(例如受体的胞外结构域(ECD))与免疫球蛋白重链的铰链和Fc区组合在一起。通常，在制备本发明的免疫粘附素时，将编码粘附素结合结构域的核酸融合在编码免疫球蛋白恒定域序列N-末端的核酸的C-末端，然而N-末端融化也是可能的。
通常，在此类融合物中，所编码的嵌合多肽将至少保留有功能活性的免疫球蛋白重链恒定区铰链，CH2和CH3结构域。还可以对恒定域Fc部分的C-末端进行融合，或者紧挨着重链CH1或轻链对应区的N-末端进行。进行融合的精确位点不是至关重要的；具体位点是众所周知的，而且可以进行选择以优化免疫粘附素的生物学活性，分泌或结合特征。
在一个优选的实施方案中，将粘附素序列融合在免疫球蛋白G1(IgG1)Fc域的N-末端。有可能将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而，更优选的是，在融合中使用在铰链区中紧挨着在化学上定义IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216，以重链恒定区的第一个残基为114)或其它免疫球蛋白的类似位点上游开始的序列。在一个特别优选的实施方案中，将粘附素氨基酸序列与IgG重链的(a)铰链区，CH2和CH3或(b)CH1，铰链，CH2和CH3结构域融合。
对于双特异性免疫粘附素，将免疫粘附素装配成多聚体，特别是异二聚体或异四聚体。一般而言，这些装配好的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。基本的四链结构单元就是IgG，IgD和IgE存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM一般作为通过二硫键保持在一起的四链基本单元的五聚体存在。IgA球蛋白及偶尔的IgG球蛋白也可以以多聚体的形式存在于血清中。在多聚体的情况中，各个四链单元可以是相同的或不同的。
正如抗体和抗体片段，本发明的免疫粘附素结构必然具有Fc区。下面示意性的列举了在本文范围内的各种例示性的装配好的免疫粘附素：
ACH-(ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；
ACL-ACH-(ACL-ACH，ACL-VHCH，VLCL-ACH，或VLCL-VHCH)
ACL-VHCH-(ACH，或ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；
VLCL-ACH-(ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；和
(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2，
其中各个A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；
VL是免疫球蛋白轻链可变域；
VH是免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH是免疫球蛋白重链恒定域；
n是大于1的整数；
Y代表共价交联剂的残基。
为简短起见，上述结构只显示了关键特征；它们没有标示免疫球蛋白的连接(J)或其它结构域，也没有显示二硫键。然而，若结合活性需要此类结构域，则它们应当构建成存在于它们在免疫球蛋白分子中所占据的通常位置。
或者，可以将粘附素序列插入免疫球蛋白重链与轻链序列之间，从而得到包含嵌合重链的免疫球蛋白。在该实施方案中，将粘附素序列融合在免疫球蛋白每个臂中的免疫球蛋白重链的3’端，或是在铰链与CH2结构域之间，或是在CH2与CH3结构域之间。类似的构建物已报道于Hoogenboom et al.，Mol.Immunol.28：1027-1037(1991)。
尽管本发明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白轻链，然而可以存在免疫球蛋白轻链，或是与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合，或是直接与粘附素融合。在前一种情况中，通常将编码免疫球蛋白轻链的DNA与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。在分泌后，杂合重链与轻链将共价结合以提供包含两对二硫键相连的免疫球蛋白重链-轻链的免疫球蛋白样结构。适于制备此类结构的方法披露于例如1989年3月28日公告的美国专利No.4,816,567。
最方便的是通过将编码粘附素部分的cDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列以符合读码框的形式融合来构建免疫粘附素。然而，也可以使用与基因组免疫球蛋白片段的融合(参见例如Aruffo et al.，Cell 61：1303-1313(1990)；Stamenkovic et al.，Cell 66：1133-1144(1991))。后一种类型的融合要求存在Ig调控序列以供表达。编码IgG重链恒定区的cDNA可以根据已发表的序列自衍生自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库分离，通过杂交或者通过聚合酶链式反应(PCR)技术。将编码免疫粘附素的“粘附素”和免疫球蛋白部分的cDNA串联插入在所选宿主细胞中指导高效表达的质粒载体。
具有增强的ADCC功能的抗体
在真核，例如哺乳动物宿主细胞中表达蛋白质之后，蛋白质进行翻译后修饰，常常包括酶促添加糖残基，一般称作“糖基化”。
多肽的糖基化通常是N-连接的O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着至天冬氨酸残基的侧链。三肽序列，天冬氨酸(Asn)-X-丝氨酸(Ser)和天冬氨酸(Asn)-X-苏氨酸(Thr)，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是碳水化合物酶促附着至天冬氨酸侧链的识别序列。O-连接的糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺，半乳糖，岩藻糖，N-乙酰基葡萄糖胺，或木糖之一附着至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可涉及O-连接的糖基化。
由哺乳动物生成的蛋白质的糖基化样式详细记载于The Plasma Proteins：Structure，Function and Genetic Control，Putnam，F.W.编，第2版，Vol.4，Academic Press，New York，1984，尤其是pp.271-315。在此章中，讨论了天冬氨酸连接的寡糖，包括它们细分的至少三组，称作复合，高甘露糖，和杂合结构，以及糖苷连接的寡糖。
在N-连接聚糖的情况中，有酰胺键连接寡糖的还原性末端N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)残基的异头碳(C-1)和多肽的天冬氨酸(Asn)残基的氮。在动物细胞中，O-连接聚糖经N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)，半乳糖(Gal)，岩藻糖，N-乙酰基葡萄糖胺，或木糖和数种羟基氨基酸之一(最常见的是丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)，但是在有些情况中是羟基脯氨酸或羟基赖氨酸)之间的糖苷键附着。
O-连接寡糖的生物合成途径由一系列特异性糖基转移酶对来自核苷酸糖的单个糖残基的逐步转移组成。发挥单糖供体功能的核苷酸糖是尿苷-二磷酸-GalNAc(UDP-GalNAc)，UDP-GlcNAc，UDP-Gal，胍-二磷酸-岩藻糖(GDP-Fuc)，和胞苷-单磷酸-唾液酸(CMP-SA)。
在N-连接寡糖合成中，N-连接寡糖装配的启动不直接发生于蛋白质的Asn残基，而是涉及预装配脂质连接的前体寡糖，然后在自mRNA翻译的期间或之后不久转移至蛋白质。此前体寡糖(Glc3Man9GlcNAc2)是在经焦磷酸酯桥附着至聚类异戊二烯载体脂质，即一种长醇时借助多种膜结合的糖基转移酶合成的。脂质连接的前体装配完成后，另一种膜结合的酶将它转移至空间可及的Asn残基，该残基作为序列-Asn-X-Ser/Thr-的一部分存在。
新合成的糖蛋白的糖基化Asn残基只瞬时携带一类寡糖，即Glc3Man9GlcNAc2。对此寡糖结构的加工产生成熟糖蛋白上找到的很大结构多样性。
对N-连接寡糖的加工是通过多种膜结合酶的序贯作用来实现的，而且包括消除三个葡萄糖残基，消除不同数目的甘露糖残基，和添加各种糖残基至所得经过修整的核心。
图1显示N-聚糖生物合成途经的一部分。
α-甘露糖苷酶I能消除Man9GlcNAc2模块的四个甘露糖残基以生成N-连接Man5-9GlcNAc2，它们都是在脊椎动物糖蛋白中常见的。如图1所示，Man5GlcNAc2能充当GlcNAc转移酶I(GlcNAcT-I)的底物，该酶将β1→2-连接GlcNAc残基自UDP-GlcNAc转移至α1→3-连接甘露糖残基以形成GlcNAcMan5GlcNAc2，它进而被α-甘露糖苷酶II修整，该酶消除两个甘露糖残基以生成具有组成GlcNAcMan3GlcNAc2的蛋白质连接的寡糖。此结构是GlcNAc转移酶II的底物(未显示)。
此阶段之后是一系列复杂的加工步骤，包括一系列膜结合的糖基转移酶序贯添加单糖至寡糖链，所述糖基转移酶在不同细胞类型间不同。因此，生成“复杂”寡糖的多样家族，包括各种分支的，诸如双触角的(两个分支的)，三触角的(三个分支的)或四触角的(四个分支的)结构。
已经报告了多种抗体糖型对抗体效应器功能(包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))具有正影响。这在肿瘤学领域会是特别有益的，其中治疗性单克隆抗体结合肿瘤细胞上的特定抗原并诱导免疫应答，导致对肿瘤细胞的破坏。通过增强IgG与携带Fc受体的杀伤细胞的相互作用，能使得这些治疗性抗体更有效力。
本发明公开用于生产相对于先前所记载的，Man5糖型的量升高同时Man7，8，9的量降低的抗体的方法。还描述了一种用于调控所生成的Man5糖型的量的方法。
如上文所讨论的，在N-聚糖生物合成途径(图1描绘其一部分)中，GlcNAc转移酶I添加GlcNac模块至Man5的末端α-1，3臂，这然后能受到α-甘露糖苷酶II的作用。通过消除或调控GlcNAc转移酶I的活性，能提高携带Man5聚糖的抗体的比例。
可以通过增强α-1，2-甘露糖苷酶活性来降低Man7，8，9糖型的量。通过在体内或在体外使用α-1，2-甘露糖苷酶，能将清除更快速的Man7，8，9聚糖转变成Man5。
本发明还提供一种使用RNA干扰(RNAi)敲低来生产具有可变量的Man5的抗体的方法。
RNA干扰(RNAi)是一种用于调节基因表达的方法。RNA分子能结合具有互补序列的单链mRNA分子并遏制特定基因的翻译。RNA可以外源(小干扰RNA，或siRNA)或通过RNAshch基因内源(微小RNA，或miRNA)引入。例如，与GlcNAc转移酶I互补的双链RNA能降低抗体表达细胞系中表达的此糖基转移酶的量，导致所生成的抗体中Man5糖型水平升高。与靶定基因的表达水平降低至零的基因敲除不同，通过使用特定基因的不同片段，抑制的量可有所变化，而且可采用特定片段来生成最佳量的期望糖型。最佳水平可通过本领域公知方法来确定，包括Fc受体结合，效应器功能(包括ADCC)，功效，和毒性的体内和体外测定法。RNAi敲低办法，而非完全敲除的使用容许精密调节Man5糖型的量至最佳水平，这可能有很大好处，如果希望生产携带少于100％Man5聚糖的抗体的话。
可以以多种方式来增强α-1，2-甘露糖苷酶活性。例如，可以通过提供在用于抗体生产的重组宿主细胞中存在的α-甘露糖苷酶I的额外拷贝来增强α-1，2-甘露糖苷酶活性。
在其它实施方案中，可以将来自微生物细胞系的α-1，2-甘露糖苷酶转染入表达细胞系。来自不同物种的α-1，2-甘露糖苷酶对各种高甘露糖聚糖具有不同特异性。一种商品化α-甘露糖苷酶I，即来自斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)的α-1，2-甘露糖苷酶，展示出有力地将高度富含Man9的糖型体外修整成Man5。Contreras等人显示了来自瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的α-1，2-甘露糖苷酶能单独将所有四个甘露糖自Man9进行修整以产生同质Man5聚糖(Maras et al.，J.Biotechnol.，77：255-263(2000)；Petegem et al.，J.Mol.Biol.，312：157-165(2001))。可以以蛋白质A纯化的具有高水平Man 9的ocrelizumab作为底物使用斋藤曲霉或瑞氏木霉α-1，2-甘露糖苷酶。
在另一个实施方案中，可以将来自其它哺乳动物物种的α-1，2-甘露糖苷酶转染入表达细胞系。
在高等生物体中也显而易见的是，每一个甘露糖自Man9转变成Man5的修整涉及不同的内源甘露糖苷酶。事实上，大多数物种利用两种甘露糖苷酶(一种在内质网(ER)中，而另一种在高尔基体中)在两步反应中将Man9修整成Man5(Gonzalez et al.，J.Biol.Chem.，274(30)：21375-21386(1999)；Mast and Moremen，Methods Enzymol.，415：31-46(2006))。Ichishima等人的论文(Ichishima et al.，Biochem.J.，339：589-597(1999))中讨论了该两步加工。看起来Man8B是最佳中间体，其具有使用高尔基甘露糖苷酶被转变成Man5的最高概率。已经鉴定出许多ER甘露糖苷酶成功地将Man9转变成Man8B(Gonzalez et al.，J.Biol.Chem.，274(30)：21375-21386(1999)；Jelinek-Kellyand Herscovics，J.Biol.Chem.，263(29)：14757-14763(1988))，在备选实施方案中，随后使用来自斋藤曲霉或瑞氏木霉的α-1，2-甘露糖苷酶能被修整成Man5。
另一种用于生成同质Man5糖型的办法涉及组合上文讨论的RNA干扰技术和体外修整反应。由于CHO细胞使用两种甘露糖苷酶来将Man9转变成Man5，所以可以使用RNAi来敲低CHO高尔基甘露糖苷酶，这会导致Man8B积累。随后可纯化富含Man8B的抗体，然后使用来自斋藤曲霉或瑞氏木霉的α-1，2-甘露糖苷酶通过相同的体外修整反应转变成Man5。或者，可以通过在CHO高尔基甘露糖苷酶被特异性敲低的同一细胞系中表达α-1，2-甘露糖苷酶来体内掺入体外修整反应。这会消除Man8B转变成Man5之前的纯化步骤。
在还有一个实施方案中，可以在体外表达后使用任何先前记载的甘露糖苷酶以将Man6，7，8，9修整成Man5。
提供下列实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。
通过述及将本说明书中引用的所有专利和参考文献完整收入本文。
实施例
实施例1：小干扰RNA(siRNA)对N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶I(GnT-I)的敲低
克隆GnT-I cDNA和用FLAG标记分离的cDNA：
为了在CHO细胞中获得具有寡甘露糖型聚糖的抗体，采用RNAi办法来敲低内源GnT-I基因的表达。使用自CHO DP12细胞纯化的总RNA通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆GnT-I编码序列(NCBI登录号：U65791)的一个1.3kb片段。然后将PCR片段克隆入来自Strategene的pCMV-3Tag-6载体(产品目录号240195)(图2)。在BamHI和HindIII位点中克隆编码全长GnT-I蛋白质的DNA序列。将三个拷贝的FLAG标签(MetAspTyrLysAspAspAspAspLys)(SEQ ID NO：1)融合至分离的GnT-I cDNA序列的5’末端，供用抗FLAG抗体进行的Western印迹分析用。
小抑制性RNA(siRNA)探针设计和克隆入表达载体：
用于设计靶向CHO GnT-I基因的5 siRNA探针(SEQ ID NOs：2-6)的方法记载于Elbashir et al，Methods 26(2)：199-213(2002)。使用退火的独立克隆入来自Ambion公司(Austin，TX)的pSilencer 3.1-H1 hygro质粒(图3)的合成寡核苷酸构建siRNA探针以生成短发夹siRNA。将编码siRNA探针的DNA序列克隆入BamHI和HindIII位点，在PolIII型H1启动子控制下。来自H1启动子的转录物形成发夹-环siRNA，其包含对GnT-I基因特异性的19个核苷酸的有义序列，通过9个核苷酸的发夹-环序列连接至其反向互补反义序列。
每种siRNA探针包含对GnT-I基因特异性的19个核苷酸的有益序列，其通过9个核苷酸的发夹-环序列连接至其反向互补反义序列，接着是3’末端的56U(图3)。图4显示5种靶向GnT-I基因的siRNA序列。通过瞬时共转染每种siRNA表达探针质粒与带FLAG标签的GnT-I质粒入CHO细胞测试了这些siRNA探针切割GnT-I转录物的能力。还共转染充当阴性对照的pSilencer(Ambion，Inc.)空载体质粒与带FLAG标签的GnT-I质粒。转染后24小时溶胞提取细胞并通过用抗FLAGM2抗体(Sigma，MO)进行的Western印迹分析细胞溶胞物。如预期的，对照质粒不抑制带FLAG标签的GnT-I的表达，而siRNA探针具有不同程度的对带FLAG标签的GnT-I融合蛋白表达的抑制(图5)。选择展现出比其余RNAi显著更强抑制效果的RNAi1和RNAi3供进一步评估用。
瞬时表达siRNA表达质粒入生成ocrelizumab的细胞系
将5种siRNA表达质粒(RNAi1，RNAi2，RNAi3，RNAi4，和RNAi5)以及含有RNAi1和RNAi3序列的组合siRNA质粒(RNAi13)瞬时转染入用于ocrelizumab生产的细胞系。作为对照，平行转染含有与GnT-I或任何已知基因没有同源性的随机小鼠序列的杂乱质粒。转染方法遵循用LIPOFECTAMINETM 2000进行的标准的含有血清的瞬时转染方案。简言之，在转染那天，在存在胎牛血清(FBS)下在非选择性生长培养基中以1.5x106细胞/mL接种细胞。将DNA和LIPOFECTAMINETM添加至不同管中的转染培养基，随后混合并于室温温育30分钟。然后将DNA复合物添加至细胞培养物。24小时后，将转染后的培养物更好培养基入生产培养基。在转染后第1，2和5天收集收获的细胞培养液(HCCF)和细胞团粒。使用CE-聚糖测定法分析HCCF以测定不同糖型的水平，并使用细胞团粒进行定量qPCR分析以测量内源GnT-I mRNA水平。为了实施qPCR，使用RNeasy 96孔试剂盒(Qiagen)或MagMAXTM-96孔总RNA分离试剂盒(Ambion)分离mRNA。实验过程中实施TAQMAN分析以测量GnT-I mRNA表达水平(图6A)。覆盖cDNA 3’端(bp1260-1324)的引物和探针的序列如下：
正向引物
CGTTGTCACTTTCCAGTTCAG(SEQ ID NO：7)
反向引物
AGCCTTCCCAGGTTTGTG(SEQ ID NO：8)
探针
FAM-ACGTGTCCACCTGGCACCCC-TAMRA(SEQ ID NO：9)
图6A所示mRNA分析证明了所有靶向GnT-I的RNAi质粒均能够显著敲低GnT-I mRNA，转染后5天与对照(用杂乱质粒转染)相比最多敲低80％。将对照的GnT-I表达水平设为100％。TAQMAN测定法中的敲低活性与带FLAG标签的GnT-I的Western印迹分析关联很好，其中RNAi1和RNAi3在这两种测定法中似乎是最强的抑制剂。与单独的RNAi1和RNAi3相比，RNAi13提供额外的抑制，选择它作为所有后续研究的主要RNAi载体。
实施例2：测量抗体的Man5水平
为了测定HCCF中收集的抗体的实际Man5水平，选择称作“CE-聚糖”的毛细管电泳作为标准方法来测定自抗体释放的聚糖。简言之，使用制备性蛋白A纯化方法自HCCF纯化抗体。然后通过于37℃温育过夜用肽-N-糖苷酶F(PNGase F)切下附着至Fc区的N-连接聚糖。反应后沉淀蛋白质以将蛋白质与切下的聚糖分开，然后通过还原性氨化用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯(APTS)标记聚糖。然后使用毛细管电泳分析标记聚糖，比照具有特定洗脱图谱的APTS标记的聚糖标准品。测定法的详情可见于Beckman Coulter网站。第5天测定的抗体的Man5含量与TAQMAN数据关联很好(图6A)，RNAi13具有最高Man5含量，大约9％(图6B)。
Man5水平在瞬时转染实验的14天运行期间稳定。
为了用RNAi13质粒的瞬时表达提高Man5水平，在同一细胞系中测试了更长的细胞培养持续时间(长至14天)。用其它抗体获得的经验指示随着生产培养持续时间延长，Man5水平会升高(图10A)。在14天的实验中使用相似的瞬时转染方案。使用LIPOFECTAMINETM用杂乱或RNAi13载体转染细胞系。在转染后不同天数收集HCCF，并使用CE-聚糖测定法分析样品以测定Man5水平。图7显示所示培养持续时间的Man5水平，其中RNAi13质粒产生比对照条件粗略高10倍的Man5水平，而且该水平看来在整个运行期间是稳定的。另外，此特定实验的GnT-I mRNA水平与5天的培养相似(数据未显示)。
实施例3：克隆CHO α-甘露糖苷酶I cDNA
如上所述用于克隆GnT-I的相同总RNA也用于克隆CHO α-甘露糖苷酶I。α-甘露糖苷酶I是糖基化途径中另一种重要的酶。它负责将高甘露糖结构Man7，8，9转变成Man5，6。通过过表达此蛋白质，会潜在导致更均一地转变成Man5。首先，比对来自人类、小鼠、大鼠的同系物的编码序列以揭示能用于克隆出CHO基因的保守区。自CHO α-甘露糖苷酶I克隆出在编码序列5’端上游的一个保守区域和终止密码子后的一个小区域。该cDNA具有1.9kB的大小(图8A)。当在蛋白质水平进行比对时，基于氨基酸序列，在来自小鼠和CHO细胞的甘露糖苷酶之间有显著高的同源性(95％)(图8B)。将CHO α-甘露糖苷酶I的cDNA和GnT-I RNAi13盒克隆入另一种表达载体SV40.GS.CMV.nbe(图8C)。
实施例4：开发稳定细胞系来表达shRNA以恒定敲低GnT-I
瞬时转染RNAi13载体入ocrelizumab导致Man5水平升高粗略10倍，自0.5-1％升高至9％。在进一步提高Man5水平的努力中，进行稳定细胞系开发来创建稳定克隆，其将shRNA掺入基因组并由此预期提供稳定表达水平来以更一致的方式敲低GnT-I。用RNAi13质粒进行用于开发稳定细胞克隆的标准方案(Shen et al.(2007)，Metabolic engineering to control glycosylation In M.Butler(Ed.)，Cell culture and Upstream Processing(pp.131-148).New York，NY：Taylor & Francis Group)，并由于该载体上存在的抗性基因而使用潮霉素选择(图3)。简言之，使用LIPOFECTAMINETM以与瞬时转染实验相同的方式进行转染。不是在转染后24小时更换入生产培养基，而是将细胞更换入含有0.5mg/mL潮霉素选择压力的选择培养基，然后以各种接种密度涂布到皮氏皿上。将皿(总共20-50个皿)在CO2增湿温箱中于37℃温育2-3周，直至观察到克隆。将各克隆转移入96孔板(1个克隆/孔)，而且第一个阶段挑取大约200-300个克隆。为了选择具有潜在高Man5水平的克隆，使用TAQMAN测定法测定所有克隆的GnT-I mRNA水平以选择具有最低GnT-I mRNA水平的克隆。随后，将所选择的克隆扩大至48孔板，24孔板，6孔板，T75培养瓶，和最后的摇瓶。选择粗略12个克隆来实施初始生产培养，这是在生产培养基中进行的14天的培养，第3天添加10％营养补充物。储存和保存具有最高量Man5的头名克隆，供未来使用。
实施了多次转染实验以创建更大量的稳定克隆供筛选用。使用TAQMAN测定法筛选了总共约350个克隆以测定内源GnT-I mRNA水平，其中mRNA水平的百分比是相对于未转染细胞系中的GnT-I mRNA水平。数轮扩大后，选择来自一次转染实验的前5名克隆和来自另一次转染实验的前13名克隆，而且图9A显示了它们的相对GnT-I mRNA水平。稳定克隆中的GnT-I敲低水平与用瞬时转染观察到的敲低水平非常相似，最大敲低为80％。在14天的生产运行中进一步评估18个克隆，然后在运行结束时使用CE-聚糖分析评估HCCF。图9B显示了Man5水平。结果再次指示稳定克隆的Man5糖型百分比(Man5％)与用瞬时转染实验观察到的那些相似。观察到Man5水平的粗略5倍升高，最高水平的Man5为克隆P2-10C的6％。
实施例5：操纵细胞培养条件以提高Man5水平
优化的细胞培养参数联合GnT-I RNAi敲低的使用能提高所获得的Man5量。用另一种所评估的抗体已经发现延长培养持续时间和提高培养基摩尔渗透压浓度是有益的，而且其他人得到的结果(美国专利申请US2007/0190057-A1图2，图4)还显示了提高摩尔渗透压浓度能提高具有高甘露糖糖型的抗体的比例。
图10A是所评估的抗体的生产运行的一个例子，其清楚显示了到14天的培养结束时生成了大量的Man5抗体。另外，还关于Man5水平测试了基本培养基中升高的NaCl(或摩尔渗透压浓度)。如图10B所示，将基本摩尔渗透压浓度自300提高至400mOsm能进一步提高Man5含量。然而，添加高摩尔渗透压浓度的营养补充物溶液没有增强Man5水平超出高摩尔渗透压浓度基本培养基的好处(数据未显示)。高摩尔渗透压浓度和延长的培养持续时间效果可以组合使用以为其它分子提高Man5水平。由于这些发现，设计了一项实验用生成ocrelizumab的细胞系和前面部分所述ocrelizumab的前5名GnT-I敲低稳定克隆来测试这些条件。
在由摩尔渗透压浓度和培养持续时间引起的效果之外，已经显示出当小量的氯化锰补料入培养物时添加锰降低Man5水平。图10C汇总了用同一抗体进行的14天生产运行的结果，其中在第3天，第3和6天，或第3，6，和9天补料1μM氯化锰。在所有情况中，Man5水平与对照相比降低50％。为了提高Man5水平，锰浓度较低的条件会是有益的。
此实验中包括前5名通过RNAi敲低GnT-I活性生成的稳定克隆。图10D显示了来自克隆6D的结果的一个例子。一般而言，对于所有条件，Man5水平随培养持续时间延长而升高。基本培养基中的高摩尔渗透压浓度看来在提高Man5水平方面具有最强效果，而且锰的缺失与对照相比具有轻微好处。通过将生产培养自14天延长至21天及使用高摩尔渗透压浓度基本培养基，Man5水平能提高高至2倍。由此，与RNAi敲低办法联合，通过操纵细胞培养条件，能进一步提高Man5水平。
实施例6：使用凝集素来结合和杀死携带GnT-I下游生成的聚糖的细胞
可以与GnT-I敲低分开地或组合地使用导致细胞中GnT-I活性降低的其它方法。还可以通过筛选具有会导致GnT-I活性丧失和Man5糖型积累的GnT-I突变的细胞克隆来选择具有高水平Man5的细胞系。Stanley等人(Stanley et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，72(9)：3323-3327(1975)；Patnaik and Stanley，Methods Enzymol.，416：159-182(2006))已经研究了凝集素抗性方法。例如，结合GnT-I下游生成的聚糖的凝集素能选择具有高水平RNAi敲低的细胞。可以在细胞培养中添加植物血凝素(PHA)，一种毒性植物凝集素，以选择具有低量的复合聚糖的细胞。缺乏GnT-I活性的细胞会产生细胞表面上存在的缺陷凝集素结合糖蛋白，这继而容许细胞在含有PHA的环境中幸存。这种办法可以与GnT-I的RNAi敲低联合使用以提高细胞在凝集素压力条件下幸存的概率。这还能提高找到具有高水平敲低的突变体的效率。
实施例7：敲低UDP-GlcNAc高尔基膜转运蛋白
或者，敲低或敲除一种或多种别的基因提高Man5的百分比。GnT-I需要UDP-GlcNAc作为底物。UDP-GlcNAc在细胞溶胶中合成，并转运至高尔基内腔。Guillen等人(PNAS 95：7888-7892，1998)克隆了哺乳动物高尔基膜转运蛋白。敲低或敲除此转运蛋白消除或大大降低UDP-GlcNAc在高尔基体中的储库。因而，降低GnT-I的底物UDP-GlcNAc的水平导致更高的Man5水平。
实施例8：纯化和表征携带不同量的Man5聚糖的抗体
自结合可溶性受体的人源化IgG1的CHO细胞发酵通过Con A Sepharose层析自收获的，澄清的细胞培养液(HCCF)纯化富含Man5糖型的抗体。表达这种抗体的细胞系生成比常规量高的携带Man5的聚糖(5-20％)。
在用25mM Tris，25mM NaCl，5mM EDTA pH 7.1平衡的PROSEPTM A柱(2.5x14cm，Millipore)上纯化2L HCCF(1.29g/L mAb)。使用平衡缓冲液和0.4M磷酸钾缓冲液进行的一系列加载后清洗步骤后，使用0.1M乙酸，pH 2.9洗脱结合的抗体，并用1.5M Tris碱调节至pH 7.4。然后在用1mM MnCl2，1mM CaCl2，0.5M NaCl，25mM Tris，pH 7.4平衡的Con A SEPHAROSETM柱(2.5x5cm，GE Healthcare)上加工洗脱的蛋白质A集合。用0.5M α-D-吡喃甘露糖苷，0.5M NaCl，25mM Tris，pH 7.4洗脱结合的抗体。
在蛋白质A柱上回收Con A SEPHAROSETM集合中的抗体，然后第二次在Con A SEPHAROSETM上进行层析。在蛋白质A上回收后，将集合第三次在Con A SEPHAROSETM上再层析，而且这次用15个柱体积的平衡缓冲液和洗脱缓冲液梯度进行洗脱。再次通过蛋白质A层析分离产物。
聚糖分析揭示了起始材料含有15％的Man5糖型。经过Con A一次后，Man5含量升高至43％，第二次经过后，Man5提高至57％，而第三次经过后升高至62％的Man5。
通过ELISA对未富集(5％Man5和16％Man5)的抗体的两份样品和Con A富集的抗体的一份样品(62％)评估Fcγ受体IIIa结合，并与RITUXAN(rituximab)和HERCEPTIN(trastuzumab)比较。
图11显示了抗体对Fcγ受体IIIa-V158的结合。空心圆形代表HERCEPTIN(trastuzumab)，空心正方形代表RITUXAN(rituximab)，空心三角形代表具有5％Man5(7-9％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体，空心菱形代表具有16％Man5(14.6％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体，而实心圆形代表具有62％Man5(11％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体。
图12显示了抗体对Fcγ受体IIIa-F158的结合。空心圆形代表HERCEPTIN(trastuzumab)，空心正方形代表RITUXAN(rituximab)，空心三角形代表具有5％Man5(7-9％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体，空心菱形代表具有16％Man5(14.6％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体，而实心圆形代表具有62％Man5(11％无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体。
下表汇总了Fcγ受体结合测定法数据(相对亲和力)。
贯穿上述说明，已经参照某些实施方案讨论了本发明，但是本发明不限于此。事实上，根据上述说明，在本文所示和所述之外对本发明的各种修改对于本领域技术人员是显而易见的，而且落在所附权利要求的范围内。