化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用.pdf

本发明化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析，筛选出HSV1病毒gB糖蛋白内的强抗原表位，第1个氨基酸至第696个氨基酸，共696个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备HSV1病毒gB糖蛋白的强抗原表位片段。表达的HSV1病毒gB糖蛋白的强抗原表位片段可用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。

1.一种化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白的胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区片段，即第1个氨基酸至第696个氨基酸，共696个氨基酸，在该基因片段的5’端增加了BamHI酶切位点及两个保护碱基GC，在3’端增加了终止密码子TGA和EcoRI酶切位点及两个保护碱基GC，化学合成的基因序列全长2107bp，序列如下：GC CCT ACC TCT CCT GGT ACT CCT GGT GTG GCT GCC GCT ACC CAG GCC GCTAAC GGT GGT CCT GCC ACT CCT GCT CCT CCT CCT CTG GGT GCC GCT CCT ACT GGTGAC CCT AAG CCT AAG AAG AAC AAG AAG CCT AAG AAC CCT ACT CCT CCT AGG CCTGCT GGT GAC AAC GCC ACC GTG GCC GCT GGC CAC GCC ACT CTG AGA GAG CAC CTGAGA GAC ATC AAG GCT GAG AAC ACC GAC GCT AAC TTC TAC GTG TGT CCT CCT CCTACT GGT GCC ACC GTG GTG CAG TTC GAG CAG CCT CGC AGG TGC CCT ACC AGG CCTGAA GGT CAG AAC TAC ACC GAA GGC ATC GCC GTG GTG TTC AAG GAG AAC ATC GCTCCT TAC AAG TTC AAG GCC ACC ATG TAC TAC AAG GAC GTG ACC GTG AGC CAG GTGTGG TTC GGC CAC CGC TAC TCC CAG TTC ATG GGC ATC TTC GAG GAC CGC GCT CCTGTG CCT TTC GAG GAG GTG ATC GAC AAG ATC AAC GCC AAG GGT GTG TGT AGG TCCACC GCT AAG TAC GTG CGC AAC AAC CTG GAG ACC ACT GCT TTC CAC AGA GAC GATCAC GAG ACC GAC ATG GAG CTG AAG CCT GCC AAC GCC GCT ACT CGC ACC AGC AGAGGC TGG CAC ACC ACT GAC CTG AAG TAC AAC CCT AGC AGA GTG GAG GCC TTC CACAGG TAC GGC ACC ACC GTG AAC TGC ATC GTG GAG GAG GTG GAC GCT CGC AGC GTGTAC CCT TAC GAC GAG TTC GTG CTG GCC ACT GGT GAC TTC GTG TAC ATG TCT CCTTTC TAC GGC TAC AGA GAA GGT AGC CAC ACC GAG CAC ACT ACC TAC GCT GCT GACAGG TTC AAG CAG GTG GAC GGC TTC TAC GCT CGC GAC CTG ACC ACC AAG GCT AGAGCC ACT GCT CCT ACC ACT AGG AAC CTG CTG ACC ACT CCT AAG TTC ACC GTG GCTTGG GAC TGG GTG CCT AAG CGC CCT AGC GTG TGC ACC ATG ACC AAG TGG CAG GAGGTG GAC GAG ATG CTG CGC TCC GAG TAC GGC GGT TCC TTC AGG TTC TCC TCT GACGCT ATC TCC ACT ACC TTC ACT ACC AAC CTG ACC GAG TAC CCT CTG TCC AGA GTGGAC CTG GGT GAC TGC ATC GGT AAG GAC GCT CGC GAC GCC ATG GAC CGC ATC TTCGCT CGC AGG TAC AAC GCT ACT CAC ATC AAG GTG GGC CAG CCT CAG TAC TAC CAGGCC AAC GGT GGT TTC CTG ATC GCC TAC CAG CCT CTG CTG AGC AAC ACT CTG GCTGAG CTG TAC GTG AGA GAG CAC CTG AGA GAG CAG AGC CGC AAG CCT CCT AAC CCTACG CCT CCT CCT CCC GGT GCT AGC GCC AAC GCT TCC GTG GAG CGC ATC AAG ACTACC TCT AGC ATC GAG TTC GCC AGG CTG CAG TTC ACC TAC AAC CAC ATC CAG CGCCAC GTG AAC GAC ATG CTG GGT CGC GTG GCT ATC GCT TGG TGC GAG CTG CAG AACCAC GAG CTG ACT CTG TGG AAC GAG GCT CGC AAG CTG AAC CCT AAC GCT ATC GCCAGC GTG ACC GTG GGC AGG AGA GTG AGC GCT AGA ATG CTG GGC GAC GTG ATG GCCGTG TCC ACC TGC GTG CCT GTG GCT GCT GAC AAC GTG ATC GTG CAG AAC AGC ATGCGC ATC AGC TCC AGA CCT GGT GCC TGC TAC AGC AGA CCT CTG GTG AGC TTC AGGTAC GAG GAC CAA GGT CCT CTG GTG GAA GGT CAG CTG GGT GAG AAC AAC GAG CTGAGG CTG ACT CGC GAC GCT ATC GAG CCT TGC ACC GTC GGT CAC AGA CGC TAC TTCACC TTC GGT GGC GGT TAC GTG TAC TTC GAG GAG TAC GCT TAC TCT CAC CAG CTGAGC CGC GCT GAC ATC ACT ACC GTG AGC ACC TTC ATC GAC CTG AAC ATC ACC ATGCTG GAG GAC CAC GAG TTC GTG CCT CTG GAG GTG TAC ACC CGC CAC GAG ATC AAGGAC AGC GGC CTG CTG GAC TAC ACC GAG GTG CAG CGC CGC AAC CAG CTG CAC GACCTG CGC TTC GCT GAC ATC GAC ACC GTG ATC CAC GCC GAC GCC TGA GC 2.权利要求1所述的基因片段编码的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区片段的纯化表达方法，其特征在于采用基因工程技术表达该基因序列编码的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下：表达HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建：用Bam HI和EcoR I双酶切质粒pGEX4T-2和化学合成的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4DNA连接酶连接，使HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoR I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长934个氨基酸，该融合蛋白N端融合了载体上的238个氨基酸，C端包含HSV1病毒的gB糖蛋白内的第1个氨基酸至第696个氨基酸，全长氨基酸序列如下：Met Pro Met Ile Leu Gly Tyr Trp Asp Ile Arg Gly Leu Ala His Ala Ile ArgLeu Leu Leu Glu Tyr Thr Asp Ser Ser Tyr Glu Glu Lys Lys Tyr Thr Met GlyGly Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Ser Gln Trp Leu Asn Glu Lys Phe Lys Leu GlyLeu Asp Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Ile Asp Gly Ala His Lys Ile Thr GlnSer Asn Ala Ile Leu Cys Tyr Ile Ala Arg Lys His Asn Leu Cys Gly Glu ThrGlu Glu Glu Lys Ile Arg Val Asp Ile Leu Glu Asn Gln Ala Met Asp Val SerAsn Gln Leu Ala Arg Val Cys Tyr Ser Pro Asp Phe Glu Lys Leu Lys Pro GluTyr Leu Glu Glu Leu Pro Thr Met Met Gln His Phe Ser Gln Phe Leu Gly LysArg Pro Trp Phe Val Gly Asp Lys Ile Thr Phe Val Asp Phe Leu Ala Tyr AspVal Leu Asp Leu His Arg Ile Phe Glu Pro Asn Cys Leu Asp Ala Phe Pro AsnLeu Lys Asp Phe Ile Ser Arg Phe Glu Gly Leu Glu Lys Ile Ser Ala Tyr MetLys Ser Ser Arg Phe Leu Pro Lys Pro Leu Tyr Thr Arg Met Ala Val Trp GlyAsn Lys Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala AlaAsn Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Ala Ala Pro Thr GlyAsp Pro Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Thr Pro Pro Arg ProAla Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His LeuArg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro ProThr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg ProGlu Gly Gln Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile AlaPro Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln ValTrp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala ProVal Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg SerThr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His Arg Asp AspHis Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser ArgGly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe HisArg Tyr Gly Thr Thr Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser ValTyr Pro Tyr Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser ProPhe Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala AspArg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala ArgAla Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val AlaTrp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys Trp Gln GluVal Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser AspAla Ile Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg ValAsp Leu Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile PheAla Arg Arg Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr LeuAla Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu AlaGlu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Pro Lys Pro Pro Asn ProThr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys ThrThr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His Ile Gln AsnHis Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln AsnHis Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile AlaSer Ala Thr Val Gly Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met AlaVal Ser Thr Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser MetArg Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe ArgTyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu LeuArg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr PheThr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Ser Ala Tyr Ser His Gln LeuSer Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr MetLeu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile LysAsp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His AspLeu Arg Phe Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：将重组质粒转化大肠杆菌TG1，涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段，含HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约2107bp的基因片段，将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100μg/mL的LB培养基内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5～1.0mmol/L，继续振荡培养诱导4～6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为96kD的HSV病毒gB糖蛋白，表达量约为30％，而对照菌TG1无此蛋白带；表达HSV1病毒gB糖蛋白的纯化：将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，裂解液为50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT，超声破菌10min，离心收集上清，上清溶液加已经平衡的Glutathione Sepharose 4B凝胶3ml，室温结合60min，上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50mmol/LTris-HCL pH8.0+10mmol/LGST，分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段。 3.权利要求1所述的基因片段编码的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区片段的纯化表达方法，其特征在于利用细菌进行重组表达、制备。 4.权利要求2或3所述方法制备的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段在制备HSV1病毒亚单位疫苗中的应用。



技术领域

本发明涉及的是一种化学合成的单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1，HSV1)糖蛋白B(glycoproteinB，gB糖蛋白)胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV1病毒gB糖蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及HSV1病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是危害人类健康的常见病原体，容易导致复发性感染和潜伏感染，对人体危害严重，分为HSV-1及HSV-2两型。1型单纯疱疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性宫颈癌的发生密切相关。近年HSV1的感染显著增多，约占该病的10％～40％。目前药物治疗HSV感染时常出现相应耐药性，所以研制疫苗是切实可行的有效方法，它能使机体在抗HSV感染免疫中，发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。至今已研制了多种HSV疫苗，已有两种HSV糖蛋白疫苗进入III期临床试验，即Chiron公司研制的重组gD2/gB2糖蛋白与MF59佐剂配伍而成的疫苗以及Glaxo SmithKline(GSK)公司开发的重组gD2糖蛋白与另一佐剂(3-de-O-酰化单磷酸类脂A和明矾)配伍而成的疫苗，这两种疫苗均有一定的保护作用，但临床效果有限。国内目前对HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。

HSV包膜糖蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激机体产生免疫应答及疫苗研制中具有重要地位。目前正式命名的HSV包膜糖蛋白有12种，其中gB糖蛋白在感染的细胞中含量最多，是疱疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株间差异较小，且与所有的疱疹类病毒亚群有较大的同源性，同时gB蛋白具有较强的免疫原性，可诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应，因此HSV1gB糖蛋白是构建HSV疫苗理想的目的基因。

HSV1gB糖蛋白基因全长2712bp，编码29个氨基酸序列的信号肽、696氨基酸序列的胞外区、69氨基酸序列的跨膜区、109氨基酸序列的胞内区。去除部分信号肽序列不影响其在原核细胞中的分泌表达。研究表明，为增强编码抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性编码序列，特别在完整抗原蛋白对宿主具有毒性或免疫抑制作用的情况下，对抗原蛋白进行截短表达就尤其重要。而截短后的gB基因构建的疫苗，与用完整gB基因构建的疫苗对HSV-1病毒攻击具有相同的保护作用。目前应用的HSV1病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，其使用的抗原是全病毒抗原，具有生产较危险、成本高、与其它病毒有交叉反应等缺点。目前缺乏HSV1病毒疫苗。灭活疫苗的研究取得了较大进展，但是生产成本高、危险大。

发明内容

本发明目的是针对上述不足之处提供一种化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸-第696个氨基酸，共696个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。

化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下方案实现的：

1.HSV1病毒gB糖蛋白胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV1病毒gB糖蛋白的氨基酸序列，筛选出gB糖蛋白的N端(第1氨基酸-第696氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，在3’端增加了终止密码子(TGA)和EcoRI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI和EcoRI酶切位点内。

筛选的HSV1病毒gB糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第1个aa-第696个aa)：

Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn Gly

Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Ala Ala Pro Thr Gly Asp Pro

Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ala Gly

Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp

Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly

Ala Thr Val Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly

Gln Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr

Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val Trp Phe

Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro Val Pro

Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala

Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu

Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp

His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr

Gly Thr Thr Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro

Tyr Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr

Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp Arg Phe

Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg Ala Thr

Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp

Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp

Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile

Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu

Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg

Arg Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn

Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala Glu Leu

Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Pro Lys Pro Pro Asn Pro Thr Pro

Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser

Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His Ile Gln Asn His Val

Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu

Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala

Thr Val Gly Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser

Thr Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile

Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Tyr Glu

Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Arg Leu

Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe

Gly Gly GlY Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Ser Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg

Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu

Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser

Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg

Phe Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala

化学合成的含HSV1病毒gB糖蛋白胞外区抗原表位基因的DNA序列(2107bp)：

GCGGATCC CCT ACC TCT CCT GGT ACT CCT GGT GTG GCT GCC GCT ACC CAG GCC GCT AAC

GGT GGT CCT GCC ACT CCT GCT CCT CCT CCT CTG GGT GCC GCT CCT ACT GGT GAC CCT

AAG CCT AAG AAG AAC AAG AAG CCT AAG AAC CCT ACT CCT CCT AGG CCT GCT GGT GAC

AAC GCC ACC GTG GCC GCT GGC CAC GCC ACT CTG AGA GAG CAC CTG AGA GAC ATC AAG

GCT GAG AAC ACC GAC GCT AAC TTC TAC GTG TGT CCT CCT CCT ACT GGT GCC ACC GTG

GTG CAG TTC GAG CAG CCT CGC AGG TGC CCT ACC AGG CCT GAA GGT CAG AAC TAC ACC

GAA GGC ATC GCC GTG GTG TTC AAG GAG AAC ATC GCT CCT TAC AAG TTC AAG GCC ACC

ATG TAC TAC AAG GAC GTG ACC GTG AGC CAG GTG TGG TTC GGC CAC CGC TAC TCC CAG

TTC ATG GGC ATC TTC GAG GAC CGC GCT CCT GTG CCT TTC GAG GAG GTG ATC GAC AAG

ATC AAC GCC AAG GGT GTG TGT AGG TCC ACC GCT AAG TAC GTG CGC AAC AAC CTG GAG

ACC ACT GCT TTC CAC AGA GAC GAT CAC GAG ACC GAC ATG GAG CTG AAG CCT GCC AAC

GCC GCT ACT CGC ACC AGC AGA GGC TGG CAC ACC ACT GAC CTG AAG TAC AAC CCT AGC

AGA GTG GAG GCC TTC CAC AGG TAC GGC ACC ACC GTG AAC TGC ATC GTG GAG GAG GTG

GAC GCT CGC AGC GTG TAC CCT TAC GAC GAG TTC GTG CTG GCC ACT GGT GAC TTC GTG

TAC ATG TCT CCT TTC TAC GGC TAC AGA GAA GGT AGC CAC ACC GAG CAC ACT ACC TAC

GCT GCT GAC AGG TTC AAG CAG GTG GAC GGC TTC TAC GCT CGC GAC CTG ACC ACC AAG

GCT AGA GCC ACT GCT CCT ACC ACT AGG AAC CTG CTG ACC ACT CCT AAG TTC ACC GTG

GCT TGG GAC TGG GTG CCT AAG CGC CCT AGC GTG TGC ACC ATG ACC AAG TGG CAG GAG

GTG GAC GAG ATG CTG CGC TCC GAG TAC GGC GGT TCC TTC AGG TTC TCC TCT GAC GCT

ATC TCC ACT ACC TTC ACT ACC AAC CTG ACC GAG TAC CCT CTG TCC AGA GTG GAC CTG

GGT GAC TGC ATC GGT AAG GAC GCT CGC GAC GCC ATG GAC CGC ATC TTC GCT CGC AGG

TAC AAC GCT ACT CAC ATC AAG GTG GGC CAG CCT CAG TAC TAC CAG GCC AAC GGT GGT

TTC CTG ATC GCC TAC CAG CCT CTG CTG AGC AAC ACT CTG GCT GAG CTG TAC GTG AGA

GAG CAC CTG AGA GAG CAG AGC CGC AAG CCT CCT AAC CCT ACG CCT CCT CCT CCC GGT

GCT AGC GCC AAC GCT TCC GTG GAG CGC ATC AAG ACT ACC TCT AGC ATC GAG TTC GCC

AGG CTG CAG TTC ACC TAC AAC CAC ATC CAG CGC CAC GTG AAC GAC ATG CTG GGT CGC

GTG GCT ATC GCT TGG TGC GAG CTG CAG AAC CAC GAG CTG ACT CTG TGG AAC GAG GCT

CGC AAG CTG AAC CCT AAC GCT ATC GCC AGC GTG ACC GTG GGC AGG AGA GTG AGC GCT

AGA ATG CTG GGC GAC GTG ATG GCC GTG TCC ACC TGC GTG CCT GTG GCT GCT GAC AAC

GTG ATC GTG CAG AAC AGC ATG CGC ATC AGC TCC AGA CCT GGT GCC TGC TAC AGC AGA

CCT CTG GTG AGC TTC AGG TAC GAG GAC CAA GGT CCT CTG GTG GAA GGT CAG CTG GGT

GAG AAC AAC GAG CTG AGG CTG ACT CGC GAC GCT ATC GAG CCT TGC ACC GTC GGT CAC

AGA CGC TAC TTC ACC TTC GGT GGC GGT TAC GTG TAC TTC GAG GAG TAC GCT TAC TCT

CAC CAG CTG AGC CGC GCT GAC ATC ACT ACC GTG AGC ACC TTC ATC GAC CTG AAC ATC

ACC ATG CTG GAG GAC CAC GAG TTC GTG CCT CTG GAG GTG TAC ACC CGC CAC GAG ATC

AAG GAC AGC GGC CTG CTG GAC TAC ACC GAG GTG CAG CGC CGC AAC CAG CTG CAC GAC

CTG CGC TTC GCT GAC ATC GAC ACC GTG ATC CAC GCC GAC GCC TAA GAATTCGC

2.表达HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建：

提取质粒pGEX4T-2，用Bam H I和EcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用BamHI和EcoR I双酶切化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。

取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使HSV1病毒gB糖蛋白基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoR I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白。

3.重组质粒的筛选与鉴定：

将重组质粒转化大肠杆菌TG1，涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落和1个对照菌(质粒pGEX4T-2转化菌)，分别提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段，含HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约2107bp的基因片段。将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有合成的HSV1病毒gB糖蛋白基因片段，序列完全正确：

CCT ACC TCT CCT GGT ACT CCT GGT GTG GCT GCC GCT ACC CAG GCC GCT AAC GGT GGT

CCT GCC ACT CCT GCT CCT CCT CCT CTG GGT GCC GCT CCT ACT GGT GAC CCT AAG CCT

AAG AAG AAC AAG AAG CCT AAG AAC CCT ACT CCT CCT AGG CCT GCT GGT GAC AAC GCC

ACC GTG GCC GCT GGC CAC GCC ACT CTG AGA GAG CAC CTG AGA GAC ATC AAG GCT GAG

AAC ACC GAC GCT AAC TTC TAC GTG TGT CCT CCT CCT ACT GGT GCC ACC GTG GTG CAG

TTC GAG CAG CCT CGC AGG TGC CCT ACC AGG CCT GAA GGT CAG AAC TAC ACC GAA GGC

ATC GCC GTG GTG TTC AAG GAG AAC ATC GCT CCT TAC AAG TTC AAG GCC ACC ATG TAC

TAC AAG GAC GTG ACC GTG AGC CAG GTG TGG TTC GGC CAC CGC TAC TCC CAG TTC ATG

GGC ATC TTC GAG GAC CGC GCT CCT GTG CCT TTC GAG GAG GTG ATC GAC AAG ATC AAC

GCC AAG GGT GTG TGT AGG TCC ACC GCT AAG TAC GTG CGC AAC AAC CTG GAG ACC ACT

GCT TTC CAC AGA GAC GAT CAC GAG ACC GAC ATG GAG CTG AAG CCT GCC AAC GCC GCT

ACT CGC ACC AGC AGA GGC TGG CAC ACC ACT GAC CTG AAG TAC AAC CCT AGC AGA GTG

GAG GCC TTC CAC AGG TAC GGC ACC ACC GTG AAC TGC ATC GTG GAG GAG GTG GAC GCT

CGC AGC GTG TAC CCT TAC GAC GAG TTC GTG CTG GCC ACT GGT GAC TTC GTG TAC ATG

TCT CCT TTC TAC GGC TAC AGA GAA GGT AGC CAC ACC GAG CAC ACT ACC TAC GCT GCT

GAC AGG TTC AAG CAG GTG GAC GGC TTC TAC GCT CGC GAC CTG ACC ACC AAG GCT AGA

GCC ACT GCT CCT ACC ACT AGG AAC CTG CTG ACC ACT CCT AAG TTC ACC GTG GCT TGG

GAC TGG GTG CCT AAG CGC CCT AGC GTG TGC ACC ATG ACC AAG TGG CAG GAG GTG GAC

GAG ATG CTG CGC TCC GAG TAC GGC GGT TCC TTC AGG TTC TCC TCT GAC GCT ATC TCC

ACT ACC TTC ACT ACC AAC CTG ACC GAG TAC CCT CTG TCC AGA GTG GAC CTG GGT GAC

TGC ATC GGT AAG GAC GCT CGC GAC GCC ATG GAC CGC ATC TTC GCT CGC AGG TAC AAC

GCT ACT CAC ATC AAG GTG GGC CAG CCT CAG TAC TAC CAG GCC AAC GGT GGT TTC CTG

ATC GCC TAC CAG CCT CTG CTG AGC AAC ACT CTG GCT GAG CTG TAC GTG AGA GAG CAC

CTG AGA GAG CAG AGC CGC AAG CCT CCT AAC CCT ACG CCT CCT CCT CCC GGT GCT AGC

GCC AAC GCT TCC GTG GAG CGC ATC AAG ACT ACC TCT AGC ATC GAG TTC GCC AGG CTG

CAG TTC ACC TAC AAC CAC ATC CAG CGC CAC GTG AAC GAC ATG CTG GGT CGC GTG GCT

ATC GCT TGG TGC GAG CTG CAG AAC CAC GAG CTG ACT CTG TGG AAC GAG GCT CGC AAG

CTG AAC CCT AAC GCT ATC GCC AGC GTG ACC GTG GGC AGG AGA GTG AGC GCT AGA ATG

CTG GGC GAC GTG ATG GCC GTG TCC ACC TGC GTG CCT GTG GCT GCT GAC AAC GTG ATC

GTG CAG AAC AGC ATG CGC ATC AGC TCC AGA CCT GGT GCC TGC TAC AGC AGA CCT CTG

GTG AGC TTC AGG TAC GAG GAC CAA GGT CCT CTG GTG GAA GGT CAG CTG GGT GAG AAC

AAC GAG CTG AGG CTG ACT CGC GAC GCT ATC GAG CCT TGC ACC GTC GGT CAC AGA CGC

TAC TTC ACC TTC GGT GGC GGT TAC GTG TAC TTC GAG GAG TAC GCT TAC TCT CAC CAG

CTG AGC CGC GCT GAC ATC ACT ACC GTG AGC ACC TTC ATC GAC CTG AAC ATC ACC ATG

CTG GAG GAC CAC GAG TTC GTG CCT CTG GAG GTG TAC ACC CGC CAC GAG ATC AAG GAC

AGC GGC CTG CTG GAC TAC ACC GAG GTG CAG CGC CGC AAC CAG CTG CAC GAC CTG CGC

TTC GCT GAC ATC GAC ACC GTG ATC CAC GCC GAC GCC TGA

构建的重组质粒表达HSV1的病毒gB糖蛋白胞外区片段(696个氨基酸)，在其N端融合了载体上的238个氨基酸，全长934个氨基酸，其氨基酸序列如下：

Met Pro Met Ile Leu Gly Tyr Trp Asp Ile Arg Gly Leu Ala His Ala Ile Arg

Leu Leu Leu Glu Tyr Thr Asp Ser Ser Tyr Glu Glu Lys Lys Tyr Thr Met Gly

Gly Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Ser Gln Trp Leu Asn Glu Lys Phe Lys Leu Gly

Leu Asp Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Ile Asp Gly Ala His Lys Ile Thr Gln

Ser Asn Ala Ile Leu Cys Tyr Ile Ala Arg Lys His Asn Leu Cys Gly Glu Thr

Glu Glu Glu Lys Ile Arg Val Asp Ile Leu Glu Asn Gln Ala Met Asp Val Ser

Asn Gln Leu Ala Arg Val Cys Tyr Ser Pro Asp Phe Glu Lys Leu Lys Pro Glu

Tyr Leu Glu Glu Leu Pro Thr Met Met Gln His Phe Ser Gln Phe Leu Gly Lys

Arg Pro Trp Phe Val Gly Asp Lys Ile Thr Phe Val Asp Phe Leu Ala Tyr Asp

Val Leu Asp Leu His Arg Ile Phe Glu Pro Asn Cys Leu Asp Ala Phe Pro Asn

Leu Lys Asp Phe Ile Ser Arg Phe Glu Gly Leu Glu Lys Ile Ser Ala Tyr Met

Lys Ser Ser Arg Phe Leu Pro Lys Pro Leu Tyr Thr Arg Met Ala Val Trp Gly

Asn Lys Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala

Asn Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Ala Ala Pro Thr Gly

Asp Pro Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Thr Pro Pro Arg Pro

Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu

Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro

Thr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro

Glu Gly Gln Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala

Pro Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val

Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro

Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg Ser

Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His Arg Asp Asp

His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg

Gly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His

Arg Tyr Gly Thr Thr Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val

Tyr Pro Tyr Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr GlY Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro

Phe Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp

Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg

Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val Ala

Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu

Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp

Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val

Asp Leu Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe

Ala Arg Arg Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu

Ala Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala

Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Pro Lys Pro Pro Asn Pro

Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys Thr

Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His Ile Gln Asn

His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn

His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala

Ser Ala Thr Val Gly Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala

Val Ser Thr Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met

Arg Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg

Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu

Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val GlY His Arg Arg Tyr Phe

Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Ser Ala Tyr Ser His Gln Leu

Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met

Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys

Asp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp

Leu Arg Phe Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala

4.表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：

将重组质粒转化大肠杆菌TG1，涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段，含HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约2107bp的基因片段，将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100μg/mL的LB培养基内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5～1.0mmol/L，继续振荡培养诱导4～6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为96kD的HSV病毒gB糖蛋白，表达量约为30％，而对照菌TG1无此蛋白带；

5.表达HSV1病毒gB糖蛋白的纯化：

1)表达HSV1病毒GB糖蛋白工程菌的超声裂解

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、20min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液内，裂解液为50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/LEDTA、10mmol/L DTT，冰浴超声破菌10min，离心(8000rpm、20min、4℃)收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的亲和层析纯化。

2)表达HSV1病毒gB糖蛋白的纯化

上清溶液加已经平衡的Glutathione Sepharose 4B凝胶3ml，室温结合60min，上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50mmol/LTris-HCL pH8.0+10mmol/LGST，分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段。

6.纯化的HSV1病毒gB糖蛋白的ELISA检测：

将初步纯化获得的融合蛋白按1∶1000～1∶32000倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度倍比稀释，用Human HSV-1 ELISA试剂盒检测表达蛋白的抗原性(具体操作方法见试剂盒说明书)。结果显示(表1)此融合表达蛋白具有较好的抗原性和特异性。

7.将表达的HSV1病毒gB糖蛋白片段，用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。

8.将合成的HSV1病毒gB糖蛋白基因片段与其它基因片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。

上述方法制备的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段在制备HSV1病毒亚单位疫苗中的应用。

化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段，可利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。

本发明与现有技术相比具有的优点：

本发明表达的HSV1病毒的gB糖蛋白片段，有较多优点：

1.本发明表达的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段用作抗原制备HSV1病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，具有生产较安全、成本低、与其它病毒交叉反应少等优点。

2.HSV1病毒的gB糖蛋白在感染的细胞中含量最多，是疱疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株间差异较小，且与所有的疱疹类病毒亚群有较大的同源性，同时gB蛋白具有较强的免疫原性，可诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应，因此HSV1gB糖蛋白是构建HSV疫苗理想的目的基因。本发明选择了其强抗原表位，利用基因工程技术表达制备，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗安全、成本低。

3.本发明根据筛选出的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区片段氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，该基因适宜在真核和原核细胞内高表达。

4.本发明构建的表达HSV1病毒的gB糖蛋白的工程菌，表达量可达菌体蛋白的30％，易于纯化，可大量纯化制备该蛋白。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明。

图1是本发明表达HSV1病毒的gB糖蛋白的重组质粒构建流程图。

图2是本发明PCR扩增HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片断的电泳图。

图3是本发明用1.0％的Agarose凝胶检测5个重组子的PCR扩增产物。附图3中M：低分子量DNA标准(TaKaRa，500bp)；1～5∶5个转化子均扩增出2107bp的目的基因片段。

图4是本发明表达HSV1病毒的gB糖蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。附图4中M：低分子量蛋白标准(Pharmacia)；7：对照菌E.coli TG1；1～6表示1～6号重组菌，2号、5号2个重组子表达相对分子量约为96000的融合蛋白，1、3、4、6号4个转化子无此蛋白带。

图5是本发明表达HSV1病毒的gB糖蛋白纯化前后的SDS-PAGE分析结果。附图5中M：低分子量蛋白标准(Pharmacia)；1：对照菌TG1；2：表达HSV1病毒的gB糖蛋白的工程菌；3：HSV1病毒的gB糖蛋白的包涵体；4：HSV1病毒的gB糖蛋白的纯化过程中的穿过峰；5：Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化后的的HSV1病毒的gB糖蛋白；6：HSV1病毒的gB糖蛋白的纯化过程中的上清。

具体实施方式

本发明实施方式的详细说明：

HSV1病毒的gB糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及表达

通过计算机分析HSV1病毒的gB糖蛋白的全部氨基酸序列，筛选出HSV1病毒的gB糖蛋白内的强抗原表位，选用细菌偏爱的密码子，化学合成HSV1病毒的gB糖蛋白强抗原表位的全新基因片段。将基因片段克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI/EcoRI位点，与载体上的起始密码子的翻译框架一致，可表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌TG1，筛选获得了高效表达HSV1病毒的gB糖蛋白的工程菌，表达的HSV1病毒的gB糖蛋白约占菌体蛋白总量的30％左右。

材料与方法

1.菌种与质粒：宿主菌TG1及表达载体pGEX4T-2为实验室保存。

2.分子生物学试剂：限制性内切酶BamHI、EcoRI、及T4 DNA连接酶为市售TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为市售TaKaRa公司产品。DTT及IPTG为市售Promega公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。

3.基因片段的合成：由公司按设计合成。

4.基因克隆方法：DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。

5.DNA序列分析：用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。

实施方式

1.HSV1病毒的gB糖蛋白抗原表位筛选及基因片段的合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV1病毒的gB糖蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号：AY278488)，筛选出HSV1病毒的gB糖蛋白内的强抗原表位(图1)，即从第1个氨基酸到第696个氨基酸，其氨基酸序列如下：

Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro GIY Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn Gly

Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Leu GlY Ala Ala Pro Thr GlY Asp Pro

Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ala Gly

Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp

Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly

Ala Thr Val Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly

Gln Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr

Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val Trp Phe

Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro Val Pro

Phe Glu Glu Val Ile Asp LYs Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala

Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu

Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp

His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr

Gly Thr Thr Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro

Tyr Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr

Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp Arg Phe

Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg Ala Thr

Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val Ala Trp Asp

Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu Val Asp

Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile

Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu

Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg

Arg Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn

Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala Glu Leu

Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Pro Lys Pro Pro Asn Pro Thr Pro

Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser

Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His Ile Gln Asn His Val

Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu

Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala

Thr Val Gly Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser

Thr Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile

Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Tyr Glu

Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Arg Leu

Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe

Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Ser Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg

Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu

Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser

Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg

Phe Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala

根据筛选的HSV1病毒gB糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，在3’端增加了终止密码子(TGA)和EcoRI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI和EcoRI酶切位点内。化学合成的含HSV1病毒gB糖蛋白抗原表位基因的DNA序列(2107bp)如下：

GCGGATCC CCT ACC TCT CCT GGT ACT CCT GGT GTG GCT GCC GCT ACC CAG GCC GCT AAC

GGT GGT CCT GCC ACT CCT GCT CCT CCT CCT CTG GGT GCC GCT CCT ACT GGT GAC CCT

AAG CCT AAG AAG AAC AAG AAG CCT AAG AAC CCT ACT CCT CCT AGG CCT GCT GGT GAC

AAC GCC ACC GTG GCC GCT GGC CAC GCC ACT CTG AGA GAG CAC CTG AGA GAC ATC AAG

GCT GAG AAC ACC GAC GCT AAC TTC TAC GTG TGT CCT CCT CCT ACT GGT GCC ACC GTG

GTG CAG TTC GAG CAG CCT CGC AGG TGC CCT ACC AGG CCT GAA GGT CAG AAC TAC ACC

GAA GGC ATC GCC GTG GTG TTC AAG GAG AAC ATC GCT CCT TAC AAG TTC AAG GCC ACC

ATG TAC TAC AAG GAC GTG ACC GTG AGC CAG GTG TGG TTC GGC CAC CGC TAC TCC CAG

TTC ATG GGC ATC TTC GAG GAC CGC GCT CCT GTG CCT TTC GAG GAG GTG ATC GAC AAG

ATC AAC GCC AAG GGT GTG TGT AGG TCC ACC GCT AAG TAC GTG CGC AAC AAC CTG GAG

ACC ACT GCT TTC CAC AGA GAC GAT CAC GAG ACC GAC ATG GAG CTG AAG CCT GCC AAC

GCC GCT ACT CGC ACC AGC AGA GGC TGG CAC ACC ACT GAC CTG AAG TAC AAC CCT AGC

AGA GTG GAG GCC TTC CAC AGG TAC GGC ACC ACC GTG AAC TGC ATC GTG GAG GAG GTG

GAC GCT CGC AGC GTG TAC CCT TAC GAC GAG TTC GTG CTG GCC ACT GGT GAC TTC GTG

TAC ATG TCT CCT TTC TAC GGC TAC AGA GAA GGT AGC CAC ACC GAG CAC ACT ACC TAC

GCT GCT GAC AGG TTC AAG CAG GTG GAC GGC TTC TAC GCT CGC GAC CTG ACC ACC AAG

GCT AGA GCC ACT GCT CCT ACC ACT AGG AAC CTG CTG ACC ACT CCT AAG TTC ACC GTG

GCT TGG GAC TGG GTG CCT AAG CGC CCT AGC GTG TGC ACC ATG ACC AAG TGG CAG GAG

GTG GAC GAG ATG CTG CGC TCC GAG TAC GGC GGT TCC TTC AGG TTC TCC TCT GAC GCT

ATC TCC ACT ACC TTC ACT ACC AAC CTG ACC GAG TAC CCT CTG TCC AGA GTG GAC CTG

GGT GAC TGC ATC GGT AAG GAC GCT CGC GAC GCC ATG GAC CGC ATC TTC GCT CGC AGG

TAC AAC GCT ACT CAC ATC AAG GTG GGC CAG CCT CAG TAC TAC CAG GCC AAC GGT GGT

TTC CTG ATC GCC TAC CAG CCT CTG CTG AGC AAC ACT CTG GCT GAG CTG TAC GTG AGA

GAG CAC CTG AGA GAG CAG AGC CGC AAG CCT CCT AAC CCT ACG CCT CCT CCT CCC GGT

GCT AGC GCC AAC GCT TCC GTG GAG CGC ATC AAG ACT ACC TCT AGC ATC GAG TTC GCC

AGG CTG CAG TTC ACC TAC AAC CAC ATC CAG CGC CAC GTG AAC GAC ATG CTG GGT CGC

GTG GCT ATC GCT TGG TGC GAG CTG CAG AAC CAC GAG CTG ACT CTG TGG AAC GAG GCT

CGC AAG CTG AAC CCT AAC GCT ATC GCC AGC GTG ACC GTG GGC AGG AGA GTG AGC GCT

AGA ATG CTG GGC GAC GTG ATG GCC GTG TCC ACC TGC GTG CCT GTG GCT GCT GAC AAC

GTG ATC GTG CAG AAC AGC ATG CGC ATC AGC TCC AGA CCT GGT GCC TGC TAC AGC AGA

CCT CTG GTG AGC TTC AGG TAC GAG GAC CAA GGT CCT CTG GTG GAA GGT CAG CTG GGT

GAG AAC AAC GAG CTG AGG CTG ACT CGC GAC GCT ATC GAG CCT TGC ACC GTC GGT CAC

AGA CGC TAC TTC ACC TTC GGT GGC GGT TAC GTG TAC TTC GAG GAG TAC GCT TAC TCT

CAC CAG CTG AGC CGC GCT GAC ATC ACT ACC GTG AGC ACC TTC ATC GAC CTG AAC ATC

ACC ATG CTG GAG GAC CAC GAG TTC GTG CCT CTG GAG GTG TAC ACC CGC CAC GAG ATC

AAG GAC AGC GGC CTG CTG GAC TAC ACC GAG GTG CAG CGC CGC AAC CAG CTG CAC GAC

CTG CGC TTC GCT GAC ATC GAC ACC GTG ATC CAC GCC GAC GCC TGA GAATTCGC

2.表达HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建：

提取质粒pGEX4T-2，用Bam H I和EcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用BamH I和EcoR I双酶切化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。

取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoRI位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白(构建流程见图2)。

3.重组质粒的筛选与鉴定：

将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌TGl，将转化产物涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选5个转化子菌落(分别标记为1-5号)和1个对照菌(质粒pGEX4T-2转化菌)，分别接种到含3ml液体LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的试管内，置37℃振荡培养5h，取菌液1ml，离心收菌。分别用50μl去离子水悬浮菌体，沸水煮5min，离心(4℃，12000rpm)5min，取上清(内有质粒)2μl用作PCR模板，PCR扩增插入载体内的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段，PCR反应浓度为：质粒模板2μl、HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段的正链P1(GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTC)和负链引物P2(GCGAATTCTTAGGCGTCGGC)各1μl、10×pyrobest buffer5.0μl、2.5mmol/L dNTP4.0μl、Pyrobest DNA Taq酶0.5μl(2.5U)、去离子水36.5μl，总体积50μl。扩增条件为：94℃30秒、55℃30秒、72℃4分钟，35个循环；最后72℃延伸7分钟。取PCR扩增产物5μl，用1.0％的Agarose凝胶检测，结果，5个转化子均扩增出2107bp的目的基因片段(见图3)，而含质粒pGEX4T-2的对照菌没有扩增出该基因片段。初步证实，这5个转化子均含有HSV1病毒gB糖蛋白基因片段。

提取1号重组子的质粒，测定质粒内的HSV1病毒gB糖蛋白基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有合成的HSV1病毒gB糖蛋白基因片段，序列完全正确：

CCT ACC TCT CCT GGT ACT CCT GGT GTG GCT GCC GCT ACC CAG GCC GCT AAC GGT GGT

CCT GCC ACT CCT GCT CCT CCT CCT CTG GGT GCC GCT CCT ACT GGT GAC CCT AAG CCT

AAG AAG AAC AAG AAG CCT AAG AAC CCT ACT CCT CCT AGG CCT GCT GGT GAC AAC GCC

ACC GTG GCC GCT GGC CAC GCC ACT CTG AGA GAG CAC CTG AGA GAC ATC AAG GCT GAG

AAC ACC GAC GCT AAC TTC TAC GTG TGT CCT CCT CCT ACT GGT GCC ACC GTG GTG CAG

TTC GAG CAG CCT CGC AGG TGC CCT ACC AGG CCT GAA GGT CAG AAC TAC ACC GAA GGC

ATC GCC GTG GTG TTC AAG GAG AAC ATC GCT CCT TAC AAG TTC AAG GCC ACC ATG TAC

TAC AAG GAC GTG ACC GTG AGC CAG GTG TGG TTC GGC CAC CGC TAC TCC CAG TTC ATG

GGC ATC TTC GAG GAC CGC GCT CCT GTG CCT TTC GAG GAG GTG ATC GAC AAG ATC AAC

GCC AAG GGT GTG TGT AGG TCC ACC GCT AAG TAC GTG CGC AAC AAC CTG GAG ACC ACT

GCT TTC CAC AGA GAC GAT CAC GAG ACC GAC ATG GAG CTG AAG CCT GCC AAC GCC GCT

ACT CGC ACC AGC AGA GGC TGG CAC ACC ACT GAC CTG AAG TAC AAC CCT AGC AGA GTG

GAG GCC TTC CAC AGG TAC GGC ACC ACC GTG AAC TGC ATC GTG GAG GAG GTG GAC GCT

CGC AGC GTG TAC CCT TAC GAC GAG TTC GTG CTG GCC ACT GGT GAC TTC GTG TAC ATG

TCT CCT TTC TAC GGC TAC AGA GAA GGT AGC CAC ACC GAG CAC ACT ACC TAC GCT GCT

GAC AGG TTC AAG CAG GTG GAC GGC TTC TAC GCT CGC GAC CTG ACC ACC AAG GCT AGA

GCC ACT GCT CCT ACC ACT AGG AAC CTG CTG ACC ACT CCT AAG TTC ACC GTG GCT TGG

GAC TGG GTG CCT AAG CGC CCT AGC GTG TGC ACC ATG ACC AAG TGG CAG GAG GTG GAC

GAG ATG CTG CGC TCC GAG TAC GGC GGT TCC TTC AGG TTC TCC TCT GAC GCT ATC TCC

ACT ACC TTC ACT ACC AAC CTG ACC GAG TAC CCT CTG TCC AGA GTG GAC CTG GGT GAC

TGC ATC GGT AAG GAC GCT CGC GAC GCC ATG GAC CGC ATC TTC GCT CGC AGG TAC AAC

GCT ACT CAC ATC AAG GTG GGC CAG CCT CAG TAC TAC CAG GCC AAC GGT GGT TTC CTG

ATC GCC TAC CAG CCT CTG CTG AGC AAC ACT CTG GCT GAG CTG TAC GTG AGA GAG CAC

CTG AGA GAG CAG AGC CGC AAG CCT CCT AAC CCT ACG CCT CCT CCT CCC GGT GCT AGC

GCC AAC GCT TCC GTG GAG CGC ATC AAG ACT ACC TCT AGC ATC GAG TTC GCC AGG CTG

CAG TTC ACC TAC AAC CAC ATC CAG CGC CAC GTG AAC GAC ATG CTG GGT CGC GTG GCT

ATC GCT TGG TGC GAG CTG CAG AAC CAC GAG CTG ACT CTG TGG AAC GAG GCT CGC AAG

CTG AAC CCT AAC GCT ATC GCC AGC GTG ACC GTG GGC AGG AGA GTG AGC GCT AGA ATG

CTG GGC GAC GTG ATG GCC GTG TCC ACC TGC GTG CCT GTG GCT GCT GAC AAC GTG ATC

GTG CAG AAC AGC ATG CGC ATC AGC TCC AGA CCT GGT GCC TGC TAC AGC AGA CCT CTG

GTG AGC TTC AGG TAC GAG GAC CAA GGT CCT CTG GTG GAA GGT CAG CTG GGT GAG AAC

AAC GAG CTG AGG CTG ACT CGC GAC GCT ATC GAG CCT TGC ACC GTC GGT CAC AGA CGC

TAC TTC ACC TTC GGT GGC GGT TAC GTG TAC TTC GAG GAG TAC GCT TAC TCT CAC CAG

CTG AGC CGC GCT GAC ATC ACT ACC GTG AGC ACC TTC ATC GAC CTG AAC ATC ACC ATG

CTG GAG GAC CAC GAG TTC GTG CCT CTG GAG GTG TAC ACC CGC CAC GAG ATC AAG GAC

AGC GGC CTG CTG GAC TAC ACC GAG GTG CAG CGC CGC AAC CAG CTG CAC GAC CTG CGC

TTC GCT GAC ATC GAC ACC GTG ATC CAC GCC GAC GCC TGA

构建的重组质粒表达HSV1的病毒gB糖蛋白片段(696个氨基酸)，在其N端融合了载体上的238个氨基酸，全长934个氨基酸，其氨基酸序列如下：

Met Pro Met Ile Leu Gly Tyr Trp Asp Ile Arg Gly Leu Ala His Ala Ile Arg

Leu Leu Leu Glu Tyr Thr Asp Ser Ser Tyr Glu Glu Lys Lys Tyr Thr Met Gly

Gly Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Ser Gln Trp Leu Asn Glu Lys Phe Lys Leu Gly

Leu Asp Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Ile Asp Gly Ala His Lys Ile Thr Gln

Ser Asn Ala Ile Leu Cys Tyr Ile Ala Arg Lys His Asn Leu Cys Gly Glu Thr

Glu Glu Glu Lys Ile Arg Val Asp Ile Leu Glu Asn Gln Ala Met Asp Val Ser

Asn Gln Leu Ala Arg Val Cys Tyr Ser Pro Asp Phe Glu Lys Leu Lys Pro Glu

Tyr Leu Glu Glu Leu Pro Thr Met Met Gln His Phe Ser Gln Phe Leu Gly Lys

Arg Pro Trp Phe Val Gly Asp Lys Ile Thr Phe Val Asp Phe Leu Ala Tyr Asp

Val Leu Asp Leu His Arg Ile Phe Glu Pro Asn Cys Leu Asp Ala Phe Pro Asn

Leu Lys Asp Phe Ile Ser Arg Phe Glu Gly Leu Glu Lys Ile Ser Ala Tyr Met

Lys Ser Ser Arg Phe Leu Pro Lys Pro Leu Tyr Thr Arg Met Ala Val Trp Gly

Asn Lys Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala

Asn Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Ala Ala Pro Thr Gly

Asp Pro Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Thr Pro Pro Arg Pro

Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu

Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro

Thr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro

Glu Gly Gln Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala

Pro Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val

Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro

Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg Ser

Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His Arg Asp Asp

His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg

Gly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His

Arg Tyr Gly Thr Thr Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val

Tyr Pro Tyr Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro

Phe Tyr Gly Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp

Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg

Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val Ala

Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu

Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp

Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val

Asp Leu Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe

Ala Arg Arg Tyr Asn Ala Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu

Ala Asn Gly Gly Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala

Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Pro Lys Pro Pro Asn Pro

Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys Thr

Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His Ile Gln Asn

His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn

His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala

Ser Ala Thr Val Gly Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala

Val Ser Thr Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met

Arg Ile Ser Ser Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg

Tyr Glu Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu

Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr Phe

Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Ser Ala Tyr Ser His Gln Leu

Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr Met

Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys

Asp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp

Leu Arg Phe Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala

4.表达HSV1病毒gB糖蛋白工程菌的筛选鉴定：

将含有重组质粒的5个阳性转化子和1个对照菌(质粒pGEX4T-2转化菌)，接种至含3ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度1.0mmol/L，继续振荡培养诱导5h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为96kD的HSV1病毒gB糖蛋白，表达量约为30％，而对照菌TG1无此蛋白带(图4)。

表达HSV1病毒gB糖蛋白的纯化

根据表达HSV1病毒gB糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。我们所表达的HSV1gB糖蛋白融合有载体上的GST蛋白，GST融合蛋白在表达时同时表达了谷胱甘肽s转酶，可很方便用GST琼脂糖凝胶FF分离，因此我们决定采用亲和层析法，用Glutathione Sepharose 4B凝胶进行纯化。具体步骤如下：

材料和方法

1.主要试剂：

Glutathione Sepharose 4B凝胶为GE Heathcare公司产品，IPTG、DTT为Promega公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。

2.表达HSV1病毒的gB糖蛋白的超声裂解：

将培养的表达HSV1病毒的gB糖蛋白的工程菌离心(8000rpm，20mins，4℃)，弃上清，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/LEDTA、10mmol/L DTT)内，冰浴超声破菌10mins，离心(8000rpm、20mins，4℃)收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的亲和层析纯化。

3.表达HSV1病毒gB糖蛋白的纯化：

上清溶液加已经平衡的Glutathione Sepharose 4B凝胶3ml室温结合60min，上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液(50mmol/LTris-HCL pH8.0+10mmol/LGST)分三次洗脱目的蛋白，即为纯化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段。

结果：

将从Glutathione Sepharose 4B凝胶柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示(见图5)，经诱导明显表达出HSV1gB/GST融合蛋白，表达产物主要存在于上清液中。SDS-PAGE显示表达产物约96kDa。

纯化HSV1病毒的gB糖蛋白的鉴定及应用

将纯化的重组HSV1病毒gB糖蛋白抗原，通过双抗体夹心ELISA试验方法检测，以鉴定表达的HSV1病毒gB糖蛋白的抗原性和特异性。实验结果显示，该重组蛋白有很好的抗原性和特异性。

材料和方法

1.酶联反应试剂盒：Human HSV-1 ELISA试剂盒为美国Uscnlife公司产品。

2.ELISA试验：将初步纯化获得的融合蛋白按1∶1000～1∶32000倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度倍比稀释，用Human HSV-1 ELISA试剂盒检测表达蛋白的抗原性(具体操作方法见试剂盒说明书)。

结果

HSV1gB蛋白的ELISA检测

将初步纯化获得的融合蛋白按1∶1000～1∶32000倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度倍比稀释，用Human HSV-1 ELISA试剂盒检测表达蛋白的抗原性。结果显示(表1)此融合表达蛋白具有较好的抗原性和特异性。

表1表达蛋白的ELISA实验结果

Table1.ELISA results of the expressed protein

蛋白稀释浓度1∶10001∶2000 1∶40001∶8000  1∶16000  1∶32000HSVlgBControl0.8140.0210.5390.019 0.428 0.0250.4000.011  0.396  0.003  0.129  0.007

化学合成的HSV病毒gB蛋白胞外区基因片段序列表

<110>李越希

<120>化学合成的HSV病毒gB蛋白胞外区基因片段及其表达、应用

<160>2

<210>1

<211>696

<212>PRT

<213>HSV病毒gB蛋白胞外区片段

<220>

<223>含强抗原表位的HSV病毒gB蛋白胞外区片段，第1个氨基酸-第696个氨基酸，共696个氨基酸。

<400>1

Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala

1               5                   10                  15

Asn Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Ala Ala Pro

            20                  25                  30

Thr Gly Asp Pro Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Thr

        35                  40                  45

Pro Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala

    50                  55                  60

Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala

65                  70                  75                  80

Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe

                85                  90                  95

Glu Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln Asn Tyr Thr

            100                 105                 110

Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Phe

        115                 120                 125

Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val Trp Phe

    130                 135                 140

Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro

145                 150                 155                 160

Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys

                165                 170                 175

Arg Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe

            180                 185                 190

His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala

        195                 200                 205

Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn

    210                 215                 220

Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr Val Asn Cys

225                 230                 235                 240

Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Glu Phe

                245                 250                 255

Val Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Tyr

            260                 265                 270

Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Ala Ala Asp Arg Phe

        275                 280                 285

Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg

    290                 295                 300

Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr

305                 310                 315                 320

Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr

                325                 330                 335

Lys Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser

            340                 345                 350

Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu

        355                 360                 365

Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys Ile Gly Lys

    370                 375                 380

Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg Tyr Asn Ala

385                 390                 395                 400

Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Gly Gly

                405                 410                 415

Phe Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala Glu Leu

            420                 425                 430

Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Pro Lys Pro Pro Asn Pro

        435                 440                 445

Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile

    450                 455                 460

Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn

465                 470                 475                 480

His Ile Gln Asn His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala

                485                 490                 495

Trp Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg

            500                 505                 510

Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Ala Thr Val Gly Arg Arg Val

        515                 520                 525

Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr Cys Val Pro

    530                 535                 540

Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile Ser Ser

545                 550                 555                 560

Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Tyr Glu

                565                 570                 575

Asp Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu

            580                 585                 590

Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg

        595                 600                 605

Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Ser Ala Tyr

    610                 615                 620

Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile

625                 630                 635                 640

Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu

                645                 650                 655

Val Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr

            660                 665                 670

Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe Ala Asp Ile

        675                 680                 685

Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala

    690                 695

<210>2

<211>2107

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(2104)

<223>人工合成的全新基因片段，编码HSV病毒gB蛋白胞外区片段。

<220>

<221>mis-feature

<222>(2105)...(2107)

<223>合成基因时增加的终止密码子。

<400>2

CCT ACC TCT CCT GGT ACT CCT GGT GTG GCT GCC GCT ACC CAG GCC GCT AAC GGT GGT CCT  60

Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn Gly Gly Pro

1               5                   10                  15                  20

GCC ACT CCT GCT CCT CCT CCT CTG GGT GCC GCT CCT ACT GGT GAC CCT AAG CCT AAG AAG  120

Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Ala Ala Pro Thr Gly Asp Pro Lys Pro Lys Lys

                25                  30                  35                  40

AAC AAG AAG CCT AAG AAC CCT ACT CCT CCT AGG CCT GCT GGT GAC AAC GCC ACC GTG GCC  180

Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala

                45                  50                   55                  60

GCT GGC CAC GCC ACT CTG AGA GAG CAC CTG AGA GAC ATC AAG GCT GAG AAC ACC GAC GCT  240

Ala Gly His Ala Thr Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala

                65                  70                  75                  80

AAC TTC TAC GTG TGT CCT CCT CCT ACT GGT GCC ACC GTG GTG CAG TTC GAG CAG CCT CGC  300

Asn Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe Glu Gln Pro Arg

                85                  90                  95                  100

AGG TGC CCT ACC AGG CCT GAA GGT CAG AAC TAC ACC GAA GGC ATC GCC GTG GTG TTC AAG  360

Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln Asn Tyr Thr Glu Gly Ile Ala Val Val Phe Lys

                105                 110                 115                 120

GAG AAC ATC GCT CCT TAC AAG TTC AAG GCC ACC ATG TAC TAC AAG GAC GTG ACC GTG AGC  420

Glu Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Phe Lys Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser

                125                 130                 135                 140

CAG GTG TGG TTC GGC CAC CGC TAC TCC CAG TTC ATG GGC ATC TTC GAG GAC CGC GCT CCT  480

Gln Val Trp Phe Gly His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro

                145                 150                 155                 160

GTG CCT TTC GAG GAG GTG ATC GAC AAG ATC AAC GCC AAG GGT GTG TGT AGG TCC ACC GCT  540

Val Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg Ser Thr Ala

                165                 170                 175                 180

AAG TAC GTG CGC AAC AAC CTG GAG ACC ACT GCT TTC CAC AGA GAC GAT CAC GAG ACC GAC  600

Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His Arg Asp Asp His Glu Thr Asp

                185                 190                 195                 200

ATG GAG CTG AAG CCT GCC AAC GCC GCT ACT CGC ACC AGC AGA GGC TGG CAC ACC ACT GAC  660

Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp

                205                 210                 215                 220

CTG AAG TAC AAC CCT AGC AGA GTG GAG GCC TTC CAC AGG TAC GGC ACC ACC GTG AAC TGC  720

Leu Lys Tyr Asn Pro Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr Val Asn Cys

                225                 230                 235                 240

ATC GTG GAG GAG GTG GAC GCT CGC AGC GTG TAC CCT TAC GAC GAG TTC GTG CTG GCC ACT  780

Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Glu Phe Val Leu Ala Thr

                245                 250                 255                 260

GGT GAC TTC GTG TAC ATG TCT CCT TTC TAC GGC TAC AGA GAA GGT AGC CAC ACC GAG CAC  840

Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr GlY Tyr Arg Glu Gly Ser His Thr Glu His

                265                 270                 275                 280

ACT ACC TAC GCT GCT GAC AGG TTC AAG CAG GTG GAC GGC TTC TAC GCT CGC GAC CTG ACC  900

Thr Ser Tyr Ala Ala Asp Arg Phe Lys Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr

                285                 290                 295                 300

ACC AAG GCT AGA GCC ACT GCT CCT ACC ACT AGG AAC CTG CTG ACC ACT CCT AAG TTC ACC  960

Thr Lys Ala Arg Ala Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr

                305                 310                 315                 320

GTG GCT TGG GAC TGG GTG CCT AAG CGC CCT AGC GTG TGC ACC ATG ACC AAG TGG CAG GAG  1020

Val Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys Trp Gln Glu

                325                 330                 335                 340

GTG GAC GAG ATG CTG CGC TCC GAG TAC GGC GGT TCC TTC AGG TTC TCC TCT GAC GCT ATC  1080

Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile

                345                 350                 355                 360

TCC ACT ACC TTC ACT ACC AAC CTG ACC GAG TAC CCT CTG TCC AGA GTG GAC CTG GGT GAC  1140

Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp

                365                 370                 375                 380

TGC ATC GGT AAG GAC GCT CGC GAC GCC ATG GAC CGC ATC TTC GCT CGC AGG TAC AAC GCT  1200

Cys Ile Gly Lys Asp Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg Tyr Ash Ala

                385                 390                 395                 400

ACT CAC ATC AAG GTG GGC CAG CCT CAG TAC TAC CAG GCC AAC GGT GGT TTC CTG ATC GCC  1260

Thr His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn GlY Gly Phe Leu Ile Ala

                405                 410                 415                 420

TAC CAG CCT CTG CTG AGC AAC ACT CTG GCT GAG CTG TAC GTG AGA GAG CAC CTG AGA GAG  1320

Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala Glu Leu Tyr Val Arg Glu His Leu Arg Glu

                425                 430                 435                 440

CAG AGC CGC AAG CCT CCT AAC CCT ACG CCT CCT CCT CCC GGT GCT AGC GCC AAC GCT TCC  1380

Gln Ser Pro Lys Pro Pro Asn Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser

                445                 450                 455                 460

GTG GAG CGC ATC AAG ACT ACC TCT AGC ATC GAG TTC GCC AGG CTG CAG TTC ACC TAC AAC  1440

Val Glu Arg Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn

                465                 470                 475                 480

CAC ATC CAG CGC CAC GTG AAC GAC ATG CTG GGT CGC GTG GCT ATC GCT TGG TGC GAG CTG  1500

His Ile Gln Asn His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp Cys Glu Leu

                485                 490                 495                 500

CAG AAC CAC GAG CTG ACT CTG TGG AAC GAG GCT CGC AAG CTG AAC CCT AAC GCT ATC GCC  1560

Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala

                505                 510                 515                 520

AGC GTG ACC GTG GGC AGG AGA GTG AGC GCT AGA ATG CTG GGC GAC GTG ATG GCC GTG TCC  1620

Ser Ala Thr Val Gly Arg Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser

                525                 530                 535                 540

ACC TGC GTG CCT GTG GCT GCT GAC AAC GTG ATC GTG CAG AAC AGC ATG CGC ATC AGC TCC  1680

Thr Cys Val Pro Val Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile Ser Ser

                545                 550                 555                 560

AGA CCT GGT GCC TGC TAC AGC AGA CCT CTG GTG AGC TTC AGG TAC GAG GAC CAA GGT CCT  1740

Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Tyr Glu Asp Gln Gly Pro

                565                 570                 575                 580

CTG GTG GAA GGT CAG CTG GGT GAG AAC AAC GAG CTG AGG CTG ACT CGC GAC GCT ATC GAG  1800

Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Arg Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu

                585                 590                 595                 600

CCT TGC ACC GTC GGT CAC AGA CGC TAC TTC ACC TTC GGT GGC GGT TAC GTG TAC TTC GAG  1860

Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu

                605                 610                 615                 620

GAG TAC GCT TAC TCT CAC CAG CTG AGC CGC GCT GAC ATC ACT ACC GTG AGC ACC TTC ATC  1920

Glu Ser Ala Tyr Ser His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile

                625                 630                 635                 640

GAC CTG AAC ATC ACC ATG CTG GAG GAC CAC GAG TTC GTG CCT CTG GAG GTG TAC ACC CGC  1980

Asp Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg

                645                 650                 655                 660

CAC GAG ATC AAG GAC AGC GGC CTG CTG GAC TAC ACC GAG GTG CAG CGC CGC AAC CAG CTG  2040

His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu

                665                 670                 675                 680

CAC GAC CTG CGC TTC GCT GAC ATC GAC ACC GTG ATC CAC GCC GAC GCC TAA              2100

His Asp Leu Arg Phe Ala Asp Ile Asp Thr Val Ile His Ala Asp Ala

                685                 690                 695