技术领域
本发明涉及用于鉴定和筛选无义突变的新引物，该突变是在染色体22q 11-13的囊泡循环蛋白(synaptogyrin)1基因外显子2的核苷酸序列825位 上，由无意义密码子TAG取代了编码色氨酸的密码子TGG，并基于此在一 组病人中检测易患精神分裂症的体质及其方法。
背景技术
精神分裂症是一种常见的对人伤害很大的疾病，全世界至少有1％的人 受到这种疾病的折磨。该疾病主要的症状有认知和逻辑推理障碍(如幻想和 错觉)，语言、行为和运动功能不正常(语无伦次，古怪行为和紧张症)， 以及在情感能力和内驱力方面有缺陷(情感乏味，快感缺乏和无意志)。
神经传递障碍影响多巴胺、血液中的复合胺(serotonin)、谷氨酸盐和 γ-氨基丁酸，并且已有报道说，在精神分裂症患者中存在缩胆囊素系统(Wolf et al，1993)。这些障碍会影响与神经递质代谢相关的基因，例如儿茶酚-O- 甲基转移酶(COMT)(Lachman et al，1996)和酪氨酸羟化酶(Ref)；还会影响 神经递质受体，例如多巴胺受体(Seeman et al，1993)，N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA)受体(Nudmamud et al，2001)和血液中的复合胺受体(Chiu et al，2001)； 以及神经递质转运子(transporter)例如多巴胺转运子(Persico et al，1997)。
精神分裂症也会严重地引起神经发育障碍，已有报道神经元细胞骨架缺 陷(Arnold et al，1991)，以及神经元细胞结构(Arnold et al，1997)、细胞迁 移、细胞极化和突触修剪(synaptic pruning)(Arnold，1999)等方面的缺陷。
因此，在精神分裂症中，至少有两个过程表现异常：神经传递和神经元 发育，并且主要影响了后续阶段的突触形成。
但是，目前对于精神分裂症还没有客观的实验室试验，诊断还是通过临 床观察获得的。因为现在迫切地需要有对精神分裂症的诊断和新的治疗方 法，许多研究都已经侧重于对这种疾病的基因特点的阐述。
在一种尝试用于诊断精神分裂症的方法中，Meloni等(USPT-6,210,879) 采用位于酪氨酸羟化酶基因第一内显子中的微卫星标记(microsatellite marker)HUMTH01来寻找精神分裂症的相关基因。这个标记包含有重复的 TCAT四聚体结构(motif)。该标记中最常见的等位基因包含有10个重复 结构，并且在第五重复结构位置上缺少一个碱基对，即形成CAT。然而，在 有关精神分裂症重复结构的相关基因分析中，研究人员发现完好的重复(没 有碱基对缺失)非常少，仅存在于精神分裂症患者内。
尽管目前还不知道精神分裂症的病因，但是可以知道该疾病和基因组成 有很大关系。对于精神分裂症的基因研究揭示，该疾病是异源的，并且是一 种复杂的基因疾病，也就是说有很多基因和该疾病的病因相关。
基因学研究已报道了该疾病和下述几个染色体区的重要关联性，包括 1q21-22，6p24-22，7q，8p22-21，10p14-13，13q32，18p和22q11-13(Riley and McGuffin，2000)。
那些研究得最多的基因区域包括染色体22上的几个连锁位点。尽管没 有任何统计学上重要的结论，但是由不同小组进行的精神分裂症的初始全基 因组扫描还是暗示了在染色体22q位标记上可能存在连锁(Schwab et al，1999； Coon et al，1994；Pulver et al，1994)。
对于574个家族D22S278的传递不均衡和连锁分析进一步证实了在染色 体22q上存在易感性连锁的可能性(Schizophrenia Collaborative Linkage group for chromosome 22)。进一步的证据表明，精神分裂症的染色体22来源于一 种称为帆-心脏-脸部症候群(Velo-Cardio-Facial Syndrome，VCFS)的先天畸 形患者中。已知VCFS是由22q11.2-q11.23区域的缺失引起的，该病的患者 表现出高发病率的精神疾病，包括双重失调和精神分裂症(Arnold，2001)。综 合胞质基因和连锁分析研究得到的各自独立的证据，表明染色体22确实存 在对精神分裂症的易感基因连锁。
除了连锁研究，近几年来，另外一个引起很大兴趣的研究方向是针对双 重失调和精神分裂症的三核苷酸重复片段扩展(Vincent et al，2000)。采用 重复扩展检测(RED)技术来研究无名的CAG重复，表明在患者和对照之 间，精神分裂症和双重失调的扩展重复有很多的重叠(O’Donovan et al，1996； Morris et al，1995)。
许多研究都集中在鉴定包含三核苷酸重复片段的连锁位点，其可用作这 些疾病的候选基因。在由三核苷酸重复扩展导致的精神分裂症和双重失调的 疾病中，候选基因方法不能表明存在三核苷酸重复的大扩展(Vincent et al， 2000)。
未能观察到大的扩展暗示了需要在患这些疾病的病人上研究中度的三 核苷酸重复扩展(Petronis et al，1996)。
申请人之前也已提出，在这些多形三核苷酸重复连锁位点上，等位基因 大小或“等位基因跨度”的差异也可能暗示了双重失调和精神分裂症(Saleem et al，1998；Saleem et al，2000)。
由于在双重失调和精神分裂症中多次提到染色体22，在这个染色体上的 易感连锁位点有可能包含涉及这些疾病发病机理的扩展的CAG重复片段。 为了鉴定在染色体22上的这些连锁，已鉴定了包含5个以上重复的CAG重 复片段和染色体22上的精神分裂症易感连锁图谱，并用于研究与疾病的相 关性。已证实在印度人群中，位于染色体22q11-13上的这些CAG重复标记 之一22CH3和精神分裂症相关联(Saleem et al，2001)。这些连锁位点是具有7 和8个CAG重复的双等位基因。当和人种匹配的对照相比时，该连锁位点 的8重复等位基因在精神分裂症患者上呈现过度表达。申请人进一步鉴定了 连锁位点邻近的基因。在这些基因中，因为囊泡循环蛋白1在神经递质的释 放中起到必不可少的作用，所以选择该蛋白的基因作为精神分裂症的候选基 因，由此，可用该基因的突变来解释精神分裂症上观察到的多种缺陷。
两个近期的研究报道了在精神分裂症患者上两个不同基因的突变。其中 一个是在位于染色体1q21-22的KCNN3基因上的移码突变，该突变仅在一 个精神分裂症患者上发现(Bowen et al，2001)。和精神分裂症相关的在 22q11-13的WKL 1基因上发生的错义突变，仅在一个大家族中分离得到 (Meyer et al，2001)。由于精神分裂症是一种多基因失调疾病，因此认为， 这一区域的其它基因发生突变也非常可能会导致精神分裂症。
在配对的精神分裂症患者和对照者的前额皮质微阵列表达模型研究中 发现，在所有的精神分裂症患者中，与突触前功能调节相关的编码蛋白的转 录水平下降了(Mirnics 2000)。
囊泡循环蛋白1和突触体素(synaptophysin)基因的双敲除小鼠进一步 呈现出短期和长期的突触可塑性(Roger et al，1999)。这些研究表明囊泡循 环蛋白1是一种作为精神分裂症易感基因的潜在的候选基因。
申请人接着还在印度人群中进行了囊泡循环蛋白1基因产生精神分裂症 易感性的研究。人SYNGR1基因揭示了三个不同的转录形式(SYNGR1a， SYNGR1b，SYNGR1c)，分别为4.5，1.3和0.9kb。通过原位杂交组织化学方 法鉴定可知，最多的一种转录子SYNGR1a(4.5kb)其对应于产物 RATSYNGR1，在中枢神经系统的神经元中高表达，而在其它组织中表达量 很低。SYNGR1b和SYNGR1c的转录水平很低，并仅限于心脏，骨骼肌， 卵巢和胎儿的肝脏中(Kedra et al，1997)。
精神分裂症是一种多基因紊乱疾病，因此除了已有的基因外，还需要有 更多的候选基因来预测易患精神分裂症的体质，而不仅仅是在症状已经出现 的时候来诊断。这可以用来帮助那些易患该病的个体改变生活方式，采用更 合适的环境来减轻精神分裂症的病状。
本发明涉及一种鉴定囊泡循环蛋白1基因突变的方法，以便能发现易患 精神分裂症的体质。本发明的实用性就在于鉴定导致个体易患精神分裂症的 基因-囊泡循环蛋白1基因的突变。本发明还可用于提供一种精神分裂症的 治疗方法，以及构建表达突变基因的转基因动物。已发现，在印度人群中染 色体2211-13位的CAG重复标记(22CH3)和精神分裂症有关。而邻近区 域的囊泡循环蛋白1基因在神经传递中有着必不可少的作用。本发明尤其涉 及一种鉴定囊泡循环蛋白1基因中的突变的方法。本发明进一步提供了可用 于鉴定囊泡循环蛋白1基因中的突变的特定引物。本发明还涉及到诊断和检 测囊泡循环蛋白1基因突变体的载体的方法。
发明内容
本发明的目的
本发明的主要目的是提供一种针对精神分裂症患者的基因突变位点的 探针和/或引物。
本发明的另一主要目的是提供一种鉴定精神分裂症基因突变的方法。
本发明的另一目的是提供一种筛选患精神分裂症的病人的方法。
本发明的还一个目的是提供一种寡核苷酸引物，用来扩增包含精神分裂 症患者的一段DNA突变体。
本发明的还一个目的是确定精神分裂症患者的突变体性质。
本发明的还一个目的是在人类基因组中确定突变的位置。
本发明的还一个目的是在各种等位基因的精神分裂症患者中鉴定突变 体。
本发明的还一个目的是在易感家族中确定精神分裂症的遗传模式。
本发明的还一个目的是确认人脑组织基因突变的功能含义。
本发明的还一个目的是提供一种鉴定和筛选易患精神分裂症的体质诊 断试剂盒。
本发明的概况
本发明涉及用于鉴定和筛选无义突变的新引物，该突变是在染色体22q 11-13的囊泡循环蛋白(synaptogyrin)1基因外显子2的核苷酸序列825位 上，由无意义密码子TAG取代了编码色氨酸的密码子TGG，并基于此在一 组病人中检测易患精神分裂症的体质及其方法。
本发明的详细描述
本发明涉及一种用于鉴定和筛选无义突变的新引物，该突变是在染色体 22q11-13的囊泡循环蛋白(synaptogyrin)1基因外显子2的核苷酸序列825 位上，由无意义密码子TAG取代了编码色氨酸的密码子TGG，并基于此在 一组病人中检测易患精神分裂症的体质及其方法(参见图4中引物序列SEQ ID Nos.1到9)。
在本发明的一个实施方式中，引物是SEQ ID Nos.1和2。
在本发明的另一个实施方式中，引物是SEQ ID Nos.3。
在本发明的另一个实施方式中，引物和/或探针是SEQ ID Nos.4-7。
在本发明的另一个实施方式中，所述的引物用于扩增囊泡循环蛋白1基 因的外显子2。
在本发明的另一个实施方式中，使用所述的引物来筛选无义突变，该突 变是在染色体22q11-13的囊泡循环蛋白(synaptogyrin)1基因外显子2的 5’端核苷酸序列825位上，由无意义密码子TAG取代了编码色氨酸的密码子 TGG。
在本发明的另一个实施方式中，所述的引物设计直到所述无义突变的倒 数第二位置。
在本发明的另一个实施方式中，所述引物的GC含量在40-60％之间。
在本发明的另一个实施方式中，使用所述的引物和/或探针来筛选无义等 位基因突变，该突变是在染色体22q11-13的囊泡循环蛋白(synaptogyrin) 1基因外显子2的5’端核苷酸序列825位上，由无意义密码子TAG取代了编 码色氨酸的密码子TGG。
在本发明的另一个实施方式中，其中设计的引物和/或探针SEQ ID Nos.4 和5具有突变碱基，并包含引物和/或探针SEQ ID No.5的3’位置。
在本发明的另一个实施方式中，其中设计的引物和/或探针SEQ ID Nos.6 和7具有突变碱基，并包含引物和/或探针SEQ ID No.7的中间位置。
在本发明进一步的实施方式中，提供了一种检测易患精神分裂症的体质 而筛选人群的方法，该方法是通过鉴定在染色体22q11-13的囊泡循环蛋白 (synaptogyrin)1基因外显子2的5’端核苷酸序列825位上，由无意义密码 子TAG取代编码色氨酸的密码子TGG而得到的无义突变。
在本发明的另一个实施方式中，涉及从血液白细胞中分离DNA。
在本发明的另一个实施方式中，采用针对囊泡循环蛋白1基因外显子的 引物，SEQ ID No.1和/或2，通过PCR扩增分离的DNA。
在本发明的另一个实施方式中，将扩增的DNA测序。
在本发明的另一个实施方式中，将测序的DNA和正常的囊泡循环蛋白 1基因进行比较。
在本发明的另一个实施方式中，鉴定所述的突变。
在本发明的另一个实施方式中，设计寡核苷酸引物和/或探针SEQ ID No.3，其中序列的3’端延伸至所述突变的倒数第二位。
在本发明的另一个实施方式中，用引物和/或探针SEQ ID No.3筛选所述 的无义突变。
在本发明的另一个实施方式中，采用选自SEQ ID No.4到7的合适的等 位基因特异性的寡核苷酸探针和/或引物筛选所述无义突变的等位基因变化。
在本发明的另一个实施方式中，使用所述的方法来认识精神分裂症家族 的遗传模式。
在本发明的另一个实施方式中，早期检测可有助于在生理表现出现之前 控制疾病。
在本发明的另一个实施方式中，其中具有所述突变的患病个体是异基因 型组合状态(heterozygous state)。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种检测易患精神分裂症的体质 而筛选人群的诊断试剂盒，该试剂盒包括引物SEQ ID No.1-2以及探针和/或 引物SEQ ID No.3-7，和其它选自下列物质的添加物：如限制性酶、逆转录 酶、聚合酶、连接酶、连接子(Linkers)、作为底物的三磷酸核苷、合适的缓 冲液，标记和/或其它附加物，该试剂盒是通过鉴定在染色体22q11-13的 囊泡循环蛋白1基因外显子2的5’端核苷酸序列825位上，由无意义密码子 TAG取代编码色氨酸的密码子TGG而得到的无义突变。
在本发明的另一个实施方式中，在所述的底物上任意地固定探针。
在本发明的另一个实施方式中，其中限制酶选自HpaII，HaeIII，BamHI， HpaI，EcoRI，HindIII和PvuII。
在本发明的另一个实施方式中，其中连接子选自粘性末端和平末端类 型。
在本发明的另一个实施方式中，其中三磷酸核苷选自三磷酸腺嘌呤，三 磷酸鸟嘌呤，三磷酸胞嘧啶或三磷酸胸腺嘧啶。
在本发明的另一个实施方式中，通过对患者相应基因的外显子直接测 序，发现了一个精神分裂症家族中第二外显子的无义突变。在该家族的患者 中，发现编码色氨酸的密码子TGG突变为一个无义密码子TAG。
在本发明的另一个实施方式中，突变存在于患者的异基因型组合状态 中，使得囊泡循环蛋白1基因产物单倍不足(haploinsufficiency)。
在本发明的另一个实施方式中，由于囊泡循环蛋白1和神经传递有关， 在该基因上的无义突变可能导致易患精神分裂症。进一步的148个精神分裂 症的先证者和143个种族匹配的正常对照的基因型没有显示这种突变。这一 结果也证实了第一个论证，就是在候选基因中的无义突变相关基因导致个体 易患精神分裂症。
在本发明的另一个实施方式中，一组精神分裂症患者在该基因中可能也 携带有这种突变或其它未知的突变，这是由于有许多不同的突变定位于该基 因上，而许多病人患病正是由于该基因功能的丧失。
在本发明的另一个实施方式中，使用外显子2和外显子4的特定引物 SEQ IDs 8和9，扩增脑中包括无义突变区域的cDNA，证实了在脑中存在囊 泡循环蛋白1基因外显子2的表达。
5’GGC ATG CCT CCT TGG TCT CA 3’(如SEQ ID NO：8所列)
5’CGT CCG TCC CTT CGT TCA 3’(如SEQ ID NO：9所列)
在本发明的另一个实施方式中，所列方法中包含无义突变用来扩增囊泡 循环蛋白1基因外显子2的引物选自：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和其互 补序列。
在本发明的另一个实施方式中，用于检测囊泡循环蛋白1基因的无义突 变的方法中的等位基因特异性引物和探针可选自：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7(其中突变的碱基占据探针的中间位置)。
在本发明的另一个实施方式中，寡核苷酸引物和探针的长度在5-100 个碱基的范围内。
在本发明的另一个实施方式中，用于检测无义突变(TGG到TAG)的 诊断试剂盒包含选自序列SEQ ID NO：1-9的合适的引物和探针。
在本发明的另一个实施方式中，申请人用寡核苷酸引物PCR扩增人囊 泡循环蛋白1基因的外显子2；这些引物是由Sanger Center，Hinxton， Cambridgeshire，CB10 1SA and UK根据囊泡循环蛋白1基因序列设计的 (08-DEC-1999)(GenBank序列号AL022326)。
在本发明的另一个实施方式中，纯化的PCR扩增产物的测序揭示了在 一个精神分裂症家族中，囊泡循环蛋白1基因的外显子2存在无义突变。因 此，这很明显说明存在迄今未知的囊泡循环蛋白1基因的等位基因或亚型。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一个序列，该序列与数据库中的 人囊泡循环蛋白1基因序列相比(GenBank序列号AL022326)，是一个包含 无义突变的人囊泡循环蛋白1基因的等位突变体。
表1
变化的位置 碱基变化 氨基酸改变 825 G-A Trp-无义密码子
在本发明的另一个实施方式中，变化的位置和采用囊泡循环蛋白1基因 侧翼外显子2的引物(SEQ ID 1和2)获得的PCR产物序列相对应。
在本发明的另一个实施方式中，突变的位置为G或A。G变为A导致色 氨酸位置为无意义密码子，结果使得人囊泡循环蛋白1基因的等位基因突变 体核苷酸序列包含无义突变。
在本发明的另一个实施方式中，用囊泡循环蛋白1基因侧翼外显子2的 引物(SEQ ID 1和2)获得的PCR产物序列。
在本发明的另一个实施方式中，申请人用寡核苷酸引物来进行人囊泡循 环蛋白1基因外显子2的PCR扩增。这些引物是由Sanger Center，Hinxton， Cambridgeshire，CB10 1SA and UK根据囊泡循环蛋白1基因序列设计的 (08-DEC-1999)(GenBank序列号AL022326)。
突变位置在所述基因序列的核苷酸825位。
在本发明的另一个实施方式中，分析20个起源于南印度的精神分裂症 多发性家族，同时以种族匹配的正常个体为对照，结果显示在其中一个精神 分裂症家族中有这种无义突变。这个家族包括3个精神分裂症患者和2个正 常个体。其中，无义突变存在于所有三个精神分裂症患者的异基因型组合状 态中，并且在其中一个正常个体中也有该突变，在另一个正常个体中没有该 突变。具有突变的正常个体由于她年龄小或者是因为突变的不完全外显率， 在目前可能没有症状。进一步对148个精神分裂症患者和143个种族匹配的 正常对照进行的基因型分析没有显示出这一突变。
本发明的另一个在人脑中证实外显子2(包含无义突变)表达的实施方式 中，申请人设计了外显子2和4的特异性引物，然后从人脑中分离RNA，制 备cDNA并且扩增人脑cDNA中包含无义突变的区域。发现包含无义突变的 外显子2在脑中表达。
在本发明的另一个实施方式中，进一步提供了一种诊断试剂盒，它包含 如SEQ ID 1到9的至少一种或更多的等位基因特异性的寡核苷酸片断。通 常，这种试剂盒包含一对或更多对的等位基因特异性的寡核苷酸，它能和不 同种类的多形性杂交。在一些试剂盒中，将等位基因特异性的寡核苷酸和底 物固定，用于检测囊泡循环蛋白1基因中的突变。试剂盒的任意附加组分包 括例如限制酶，逆转录酶或聚合酶，底物核苷三磷酸，用于标记的方法(如， 当标记物是生物素时，用抗生物素蛋白酶结合、酶底物以及色原体)，以及 合适的逆转录、PCR或杂交反应的缓冲液。这种试剂盒还经常会包含使用方 法的说明、其它SNP检测试剂以及诸如Taqman的方法。
附图说明
图1为囊泡循环蛋白1基因无义突变的示意性说明。上部的线条表示了 囊泡循环蛋白1基因的6个外显子位置，并在第二外显子具有相应的 无义突变位置，另外还有用于RT-PCR的引物。
图2是以外显子2(SEQ ID 8)和外显子4(SEQ ID 9)的特异性引物进行RT -PCR，得到的在脑的不同部位的囊泡循环蛋白1基因外显子2的表 达情况。
图3为发现突变的家族的遗传家谱。圆圈代表女性成员，方框代表男性 成员。填满的圆圈和方框代表患病的家族成员，空白的代表正常的 家族成员。水平线代表婚姻，垂直线代表下一代。筛选的有突变的 家族成员的基因型如下面所示。在遗传家谱下方表示的是囊泡循环 蛋白1基因外显子2中显示突变的电泳图谱。
图4表示SEQ ID Nos.1-9。
以下的实施例是用来说明本发明的，不能理解为对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1
鉴定囊泡循环蛋白1基因中的无义突变
本实施例表述的是，采用本发明的特定的寡核苷酸引物进行PCR， 然后通过测序，鉴定囊泡循环蛋白1基因外显子2中的突变。从人外周 血白细胞中通过盐析提取DNA。DNA的浓度可通过测定260nm波长下 的样品吸光率获得。然后，用寡核苷酸引物1和2(SEQ ID 1和2)进行 聚合酶链式反应，扩增精神分裂症先证者的DNA。样品在Perkin Elmer Gene Amp PCR系统9600中，先在94℃变性5分钟，接着是35个循环 的变性(94℃，30秒)，退火(67℃，30秒)和延伸(72℃，1分钟)， 最后在72℃延伸7分钟。这个反应获得了一个1057bp的DNA片段。用 DNA ISOLATION KIT(Biological Industries，Israel)从琼脂糖中纯化PCR 产物，PCR产物的双链都用末端染色化学方法在ABI Prism 377自动的 DNA测序仪上测序。结果显示，除了前面提到的在一个精神分裂症患者 中的突变外，PCR产物和数据库中的囊泡循环蛋白1基因(编号为 AL022326)外显子2相同。
实施例2
在人群中筛选突变
本实施例描述了用于筛选单核苷酸突变体的引物延伸反应。将来源于 148个患者和143正常个体的DNA样品进行PCR扩增，然后采用实施例1 中的方法纯化PCR产物。采用寡核苷酸引物和SNaPshot ddNTP引物延伸试 剂盒(PE Biosystems)，在纯化的PCR产物上进行引物延伸反应。设计寡核 苷酸引物直到突变体的倒数第二位置，并且引物由一个ddNTP延伸，这和存 在的突变等位基因相对应。在Perkin Elmer Gene Amp PCR系统9600中，进 行25个循环的变性(96℃，10秒)，退火(50℃，5秒)和延伸(60℃， 30秒)。用牛肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)处理引物延伸产物，以 去除未结合的二脱氧核糖核苷酸。产物用ABI Prism 377自动DNA测序仪测 序。通过结合的二脱氧核糖核苷酸上的荧光染色标记颜色，可鉴定出野生型 和突变的囊泡循环蛋白1基因突变等位基因。
实施例3
囊泡循环蛋白1基因的等位突变基因的核苷酸序列
采用和实施例1中相同的方法测得囊泡循环蛋白1基因的等位突变基因 的核苷酸序列。
实施例4
在精神分裂症家族中分离到无义突变和疾病
在一个精神分裂症家族的患病成员中发现了无义突变。该家族有三个精 神分裂症患者和两个正常个体。其中，无义突变存在于所有三个精神分裂症 患者的异基因型组合状态中，并且在其中一个正常个体中也有该突变，在另 一个正常个体中没有该突变。具有突变的正常个体由于她年龄小或者是因为 突变的不完全外显率，在目前可能没有症状。
实施例5
在人脑中研究囊泡循环蛋白1基因外显子2的表达
本实施例设计了外显子2和4的特异性引物，来证实在人脑中外显子 2(包含无义突变)的表达。用EZ RNA Isolation kit(Biological Industries)从 人脑中分离RNA。用随机引物和寡dT引物(Ist strand cDNA synthesis kit for RT-PCR，Boehringer Mannheim)合成cDNA。用外显子2和4的特异性引物 扩增人脑cDNA中包含无义突变的区域。结果发现在脑中存在包含无义突变 的外显子2的表达。
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序列表
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<170>PatentIn Ver.2.1
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<223>人工序列描述：用于鉴定和筛选
囊泡循环蛋白中无义突变的引物
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