S100A4 蛋白的纯化与鉴定 【技术领域】
本发明涉及一种蛋白分子的纯化与鉴定。 具体的说，本发明涉及一种具有高效 表达活性的 S100A4 蛋白分子的纯化与鉴定。背景技术
S100A4 蛋白是以非共价键结合二聚体存在于细胞内，而以共价结合二聚体分泌 到细胞外。 推测 Ca2+ 结合后可导致 S100A4 蛋白构型改变，在表面暴露出新的结合位点， 从而可与一系列靶标结合。 胞外基质中的 S100A4 蛋白是一种单体和二聚体共存的状态， 其比例受 Ca2+ 结合程度的影响 ；胞内 S100A4 蛋白的同源二聚体和异源二聚体形式也是同 时存在。 因此，从 S100A4 蛋白可形成同源二聚体、异源二聚体、寡聚体的多种形式来 看，其结构具有很强的可变性，这可能也是它在体内具有多种生物学功能的结构基础。
S100A4 蛋白与肿瘤的发生、转移及预后密切相关，参与血管生成、细胞外基质 重建等生命过程。 因此，构建 S100A4 蛋白载体、表达并纯化 S100A4 蛋白，可以用于与 P53 等靶分子相互作用的基础研究，以揭示其作用机制。 发明内容
本发明提供了一种纯化与鉴定 S100A4 蛋白的方法。 该方法包括如下步骤 ：
(1)S100A4 蛋白的纯化
①将层析柱连接 AKTA FPLC 蛋白纯化仪，并以约 5 倍体积的 1×binding buffer 平衡至基线。
②平衡以后，将破碎上清以 1×binding buffer 稀释 3-5 倍以 0.45μm 的除菌滤器 过滤除菌后以 3mL/min 的流速上样，收集穿透液。
③以 1×binding buffer 平衡至基线，用 elution buffer( 洗脱缓冲液 ) 进行线性梯度 洗脱，以 3mL/ 管收集蛋白峰，进行 SDS-PAGE 鉴定和纯度鉴定。
(2)S100A4 蛋白的脱盐
为 了 加 快 纯 化 速 度， 防 止 蛋 白 在 纯 化 过 程 中 降 解， 采 用 GE Health HiTrap Desalting 柱进行脱盐处理，程序参照该层析柱说明书，简言之，缓冲液为生理盐水缓冲 液，平衡柱子 3-5 个柱床体积后，用注射器手推上样，上样过程中弃去所有的流出液， 上样完毕后，将层析柱连接 FPLC 系统，监测紫外和电导，收集相应紫外峰，所需蛋白先 洗脱，盐类等小分子后洗脱，收集蛋白峰，进行 SDS-PAGE 分析
(3) 蛋白鉴定
a SDS-PAGE 鉴定
①将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取 25μl，再加入 25μl 的 2×SDS 上样缓 冲液，混合均匀 ；
②取破碎后的沉淀少许，加入 25μl 的 PBS 后，再加入 25μl 的 2×SDS 上样缓 冲液，混合均匀 ；③将上述两者 100℃煮沸 5min，并短暂离心，进行 SDS-PAGE 电泳，鉴定其表 达形式。
b Western-Blot 鉴定
①处理好蛋白样品，进行 SDS-PAGE 电泳，记录加样顺序。
②电泳完毕后，取下凝胶，标记方向，切取所需大小的胶。
③量取一张与胶块大小相同的硝酸纤维素膜 ；6 张滤纸，大小同凝胶。
④将滤纸用转移 buffer 湿润，取 3 张叠放于半干转移仪上，将硝酸纤维素膜叠放 上去后，把大小相同的凝胶叠放上去，再将转移 buffer 湿润的滤纸 3 张叠放上去。
⑤检查气泡，接通半干转移仪，以 1mA/cm2 的电量，开始转移 1h-1.5h。
⑥转移完毕后，取下硝酸纤维素膜，放入平皿，加入 15 ～ 20mL 的 B 液，封闭 过夜 ( 轻摇 )
⑦封闭结束后，用 D 液洗膜 3 次，2min/ 次，加入 15 ～ 20mL 的用 C 液稀释好 的一抗 ( 兔抗 S100A4)，轻摇 1h。
⑧再用 D 液洗膜 3 次，2min/ 次，加入 15-20mL 的用 C 液稀释好的酶标二抗 ( 羊 抗兔 IgG-HRP)，轻摇 1h。 ⑨再用 D 液洗膜 3 次，2min/ 次，加入 A 液配制好的 DAB(0.35g/L)10mL，再 加入 H2O230μL 观察特异性反应，2-3min 后，用 2mol/L 的硫酸终止反应，用蒸馏水冲洗 膜
附图说明
图 1 为 S100A4 的 SDS-PAGE 电泳分析
图 2 为纯化后 S100A4 的 SDS-PAGE 电泳分析
图 3 为 S100A4 的 Western blot 鉴定结果 具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明 ：
(1)S100A4 蛋白的纯化
①将层析柱连接 AKTA FPLC 蛋白纯化仪，并以约 5 倍体积的 1×binding buffer 平衡至基线。
②平衡以后，将破碎上清以 1×binding buffer 稀释 3-5 倍以 0.45μm 的除菌滤器 过滤除菌后以 3mL/min 的流速上样，收集穿透液。
③以 1×binding buffer 平衡至基线，用 elution buffer( 洗脱缓冲液 ) 进行线性梯度 洗脱，以 3mL/ 管收集蛋白峰，进行 SDS-PAGE 鉴定和纯度鉴定。
(2)S100A4 蛋白的脱盐
为 了 加 快 纯 化 速 度， 防 止 蛋 白 在 纯 化 过 程 中 降 解， 采 用 GE Health HiTrap Desalting 柱进行脱盐处理，程序参照该层析柱说明书，简言之，缓冲液为生理盐水缓冲 液，平衡柱子 3-5 个柱床体积后，用注射器手推上样，上样过程中弃去所有的流出液， 上样完毕后，将层析柱连接 FPLC 系统，监测紫外和电导，收集相应紫外峰，所需蛋白先 洗脱，盐类等小分子后洗脱，收集蛋白峰，进行 SDS-PAGE 分析(3) 蛋白鉴定
a SDS-PAGE 鉴定
①将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取 25μl，再加入 25μl 的 2×SDS 上样缓 冲液，混合均匀 ；
②取破碎后的沉淀少许，加入 25μl 的 PBS 后，再加入 25μl 的 2×SDS 上样缓 冲液，混合均匀 ；
③将上述两者 100℃煮沸 5min，并短暂离心，进行 SDS-PAGE 电泳，鉴定其表 达形式。
b Western-Blot 鉴定
①处理好蛋白样品，进行 SDS-PAGE 电泳，记录加样顺序。
②电泳完毕后，取下凝胶，标记方向，切取所需大小的胶。
③量取一张与胶块大小相同的硝酸纤维素膜 ；6 张滤纸，大小同凝胶。
④将滤纸用转移 buffer 湿润，取 3 张叠放于半干转移仪上，将硝酸纤维素膜叠放 上去后，把大小相同的凝胶叠放上去，再将转移 buffer 湿润的滤纸 3 张叠放上去。
⑤检查气泡，接通半干转移仪，以 1mA/cm2 的电量，开始转移 1h-1.5h。
⑥转移完毕后，取下硝酸纤维素膜，放入平皿，加入 15 ～ 20mL 的 B 液，封闭 过夜 ( 轻摇 )
⑦封闭结束后，用 D 液洗膜 3 次，2min/ 次，加入 15 ～ 20mL 的用 C 液稀释好 的一抗 ( 兔抗 S100A4)，轻摇 1h。
⑧再用 D 液洗膜 3 次，2min/ 次，加入 15-20mL 的用 C 液稀释好的酶标二抗 ( 羊 抗兔 IgG-HRP)，轻摇 1h。
⑨再用 D 液洗膜 3 次，2min/ 次，加入 A 液配制好的 DAB(0.35g/L)10mL，再 加入 H2O230μL
观察特异性反应，2-3min 后，用 2mol/L 的硫酸终止反应，用蒸馏水冲洗膜 2. 结 果
2.1 重组蛋白的纯化
菌体经超声破碎后显示， S100A4 以上清形式存在。 融合蛋白 C 端表达 6×His Tag 便于纯化。 6×His Tag 的加入并不影响其可溶性表达 [32-34]。 对将破碎后的菌液上 清用 Amersham 公司生产的全自动快速液相色谱系统 (FPLC) 过 Ni 柱，纯化过程见图，当 洗脱剂咪唑浓度为 10mmol/L 时有很多杂蛋白被洗下，随即采用咪唑的线形洗脱，当咪唑 浓度到达 100mmol/L 时目的蛋白开始被洗下，咪唑浓度达到 100mmol/L 时目的蛋白达到 最大值。
2.2 重组蛋白的脱盐
将纯化后的蛋白通过脱盐柱进行脱盐，每 5mL 层析柱上样 1.5mL，手推上样后 连接 FPLC 系统，流速 3mL/min，紫外值迅速上升，目的蛋白很快洗下，但此时溶液电 导尚未上升，紫外吸收峰快下降至底端时，电导迅速开始上升，此时蛋白收集完毕，同 时，由于金属螯合层析的缓冲液中咪唑的作用，紫外吸收值又开始上升，出现另一个小 的紫外吸收峰，待电导与紫外值都下降至基线后即可进行下一次脱盐
2.3 重组 S100A4 蛋白的 Western-blot 分析以 pBV220 空菌为对照，上样量 15μL，对称上样，进行 SDS-PAGE 电泳，电泳 完毕后去掉积层胶，把分离胶中间切开，一半用考马斯亮蓝染色，一半进行 Westem-blot 分析，以小鼠抗组氨酸标签抗体作为一抗，以 HRP- 羊抗小鼠 IgG 作为二抗， DAB 显 色，可以看到，在 11kD 处， pBV220 空菌为对照未见显色条带，纯化后的 S100A4 制品 与 pBV220-S100A4 诱导表达产物均有特异条带，表明 S100A4 获得了表达并进行了有效 纯化。 在蛋白电泳图上约 44kD 处未见明显条带，但在 Western-blot 图上有明显条带，推 测可能是 S100A4 形成的聚体。 ( 图 3)