本申请是申请号为：200610022507.2，发明名称为：莱鲍迪甙A及其提取方法，申请日 为2006年12月15日的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及莱鲍迪甙A的提取方法，属食品化工领域。
背景技术
甜菊糖甙(Total steviosides)是一种从甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertohi)的叶和茎中提取 出来的高甜度、低热量天然保健甜味剂，它主要含八种不同甜味成分：甜菊甙(Stevioside)； 莱鲍迪甙(Rebaudioside)A、B、C、D、E及杜尔可甙(Dulcoside)A、B。其中甜菊甙约占总甙 量的66％，莱鲍迪甙A约占总甙量的22％，莱鲍迪甙C约占总甙量的9％，杜尔可甙A约占 总甙量的2％，其它成分含量极微。
普通甜菊糖甙存在一些缺陷，其大多甜味成份具有较强的不良余味，这制约了甜菊糖甙 的广泛应用。而莱鲍迪甙A是甜菊糖甙中味质最好的甜味成份，无不良余味，甜度也最高(蔗 糖的300～450倍)，是一种理想的天然保健甜味剂。因此高纯度的莱鲍迪甙A产品(含量≥99％) 是近年来国内外甜菊糖甙生产工业的研究热点。但是由于这些甜味成分的化学结构非常相似， 仅区别于甙键上结合糖的种类、数量和构成型式，因此目前在工业生产上很难纯化得到高纯 度的莱鲍迪甙A。
迄今为止，高纯度的莱鲍迪甙A制备方法有：高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法、 滴液逆流色谱法、毛细管电泳法、超临界萃取法等，但这些方法处理量小、成本高，不适用 于工业生产。
专利CN 1132840C公开了一种通过固液分离精制甜菊糖甙的方法，该方法将甜菊糖甙与 乙醇按1∶1.4～1.7比例进行混合，溶解过程中搅拌混合物，将溶解后的混合物进行固液分离， 将得到的固体和液体分别进行活性碳脱色、干燥后，得到精制甜菊糖甙。该方法所得到的甜 菊糖甙产品中莱鲍迪甙A的含量为88％，含有较多的不良余味杂质。
专利CN 1098860C公开了一种通过真空吸滤、离子交换树脂分离富集甜菊糖甙的工艺， 该工艺选择莱鲍迪甙A与甜菊甙之比在0.5～1.1的甜菊糖甙粗品为原料，以甲醇与水混合液 溶解搅拌甜菊糖甙，并将混合物过滤后，以离子交换树脂脱盐和活性碳脱色，蒸去甲醇与水， 得到产率为35～65％的莱鲍迪甙A与甜菊甙之比大于2.5的甜菊糖甙产品，该产品中甜菊糖甙 含量大于95％(莱鲍迪甙的含量≥78％)。该工艺中莱鲍迪甙的含量和产率都较低。
专利CN 1078217C公开了一种通过吸附树脂分离富集莱鲍迪甙A的方法，该发明合成了 一系列的大孔吸附树脂，并利用大孔吸附树脂的选择性吸附作用分离甜菊糖甙，再通过重结 晶可得到莱鲍迪甙A含量为90％的甜菊糖甙产品。该方法所得到的甜菊糖甙产品中仍含有较 多的不良余味杂质，难以单独作为甜味剂使用。
专利CN 1032651C公开了一种通过萃取精制甜菊糖甙的方法，该方法以脂肪醇或脂肪醇 加稀释剂的混合溶剂对甜菊糖甙粗品溶液进行液-液萃取，再用水进行反萃取，干燥后可得到 甜菊糖总甙含量为90％的产品。该方法试剂消耗多，分离效果差，工业生产有困难。
专利CN 1024348C公开了一种通过普通树脂提取甜菊糖甙的工艺，该工艺通过干叶浸泡、 板框过滤、吸附、脱盐、普通强碱性树脂脱色、浓缩干燥等步骤得到甜菊糖总甙含量为98％ 的产品。该工艺采用普通强碱性树脂脱色，脱色效率低且该树脂在使用过程中极易中毒。
专利JP 07,143,860(1995)公开了一种生产高含量RA的方法。该方法以水或含水溶剂 从植物干茎或叶中提取甜菊糖甙，并从提取液中分离收集，可得到莱鲍迪甙A含量为甜菊甙、 莱鲍迪甙C、杜尔可甙A总量4.8～8.5倍的提取物。再通过以含水10～20％甲醇的结晶、重 结晶方法可得到RA含量为90％的产品。
专利JP 2002,262,822公开了一种由甜叶菊变异品种的干叶中所提取的甜味剂及其提取 方法。该方法以水或水的溶剂对甜叶菊变异品种的干叶进行提取，其中莱鲍迪甙A含量是甜 菊甙的2.56倍。
专利US 20060134292公开了一种从甜叶菊中提取甜味甙的方法，并可分别得到莱鲍迪甙 A及甜菊甙，提取在具有胶质酶的条件下进行，纯化中使用了环状糊精及斑脱土，高纯度莱 鲍迪甙A由结晶及重结晶得到。高纯度甜菊甙则由环状糊精，斑脱土及离子交换树脂处理得 到，酶修饰的莱鲍迪甙A，甜菊甙及纯化提取物由Thermoactinomyces vilgaris和Bacillus halophilus中所提取的酶进行。
专利US 20060083838公开了一种生产高含量莱鲍迪甙A的方法。该方法以配制的乙醇溶 剂与甜叶菊起始材料进行回馏，回馏后过滤收集固体残留物并以乙醇搅拌洗涤，再次过滤， 收集残留物并除去乙醇并干燥可得纯度≥99％莱鲍迪甙A。
由这些方法和工艺(除专利US 20060083838)所得到的甜菊糖甙中的莱鲍迪甙A绝对含量 较低(纯度＜96％)，更不能得到纯度≥99％的莱鲍迪甙A产品，难以单独作为甜味剂使用。
专利US 20060083838声称能够得到莱鲍迪甙A纯度≥99％的产品，但其提供的方法步骤 十分简单常见。发明人经重复实验表明如此简单的处理步骤不能将莱鲍迪甙A同与其结构极 为相似的其它成分分离开，因此实践中通过该专利方法并不能得到其所声称的纯度≥99％的莱 鲍迪甙A。
虽然目前我国每年出口大量甜菊糖甙，但由于其中莱鲍迪甙A含量低(到目前为止国内 还没有莱鲍迪甙A纯度≥96％的甜菊糖甙产品)，往往仅作为一种原料和初级产品出口，技术 含量低，价格便宜。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种从甜叶菊中提取高纯度、高产率莱鲍迪甙A的方 法。本发明提取方法包括如下步骤：
a、按1∶3～1∶9m/v的重量体积比例，将甜叶菊Stevia rebaudiana Bertohi叶和茎与0％～15 ％v/v的水与甲醇混合溶剂在50℃～80℃进行连续逆流提取，水与甲醇混合溶剂对每千克甜叶 菊原料的流速为1～4L/h；
b、将提取溶液浓缩后得莱鲍迪甙A粗品以水分散后进行超滤，得滤液；
c、以极性树脂对超滤后滤液进行吸附洗脱，吸附流速为1～4BV/h，吸附后以30％～60％ v/v的甲醇与水混合溶剂进行洗脱，洗脱流速为0.5～2BV/h；
d、将洗脱液浓缩后，于-20℃冷冻搅拌结晶24小时，再于-20℃冷冻搅拌重结晶24小 时，过滤收集晶体，80℃烘干，得纯度≥99％的莱鲍迪甙A。
其中，步骤a所述的甜叶菊与水与甲醇混合溶剂的重量体积比范围为1∶5～1∶9。进一 步地，步骤a所述的甜叶菊与水与甲醇混合溶剂的重量体积比范围为1∶5～1∶7。
其中，步骤a所述的水与甲醇的体积配比范围为5％～15％。进一步地，步骤a所述的 水与甲醇的体积配比范围为5％～10％。
其中，步骤a所述的连续逆流提取温度为60℃～80℃。进一步地，步骤a所述的连续逆 流提取温度为70℃～80℃。
其中，步骤a所述的水与甲醇混合溶剂对每千克甜叶菊原料的流速为1～3L/h。进一步地， 步骤a所述的水与甲醇混合溶剂对每千克甜叶菊原料的流速为1～2L/h。
其中，步骤b的超滤条件为：超滤膜规格为1K，膜透压为15～30PSI，透过流速为10～40 LMH。
其中，步骤c中所述的极性树脂对超滤后滤液的吸附流速为1～3BV/h。进一步地，步骤c 中所述的极性树脂对超滤后滤液的吸附流速为1～2BV/h。
其中，步骤c中所述的洗脱极性树脂的甲醇与水的体积配比范围为40％～60％。进一步 地，步骤c中所述的洗脱极性树脂的甲醇与水的体积配比范围为50％～60％。
其中，步骤c中所述的甲醇与水混合溶剂对极性树脂的洗脱流速为0.5～1.5BV/h。进一步 地，步骤c中所述的甲醇与水混合溶剂对极性树脂的洗脱流速为0.5～1BV/h。
本发明提供的高纯度的莱鲍迪甙A，通过其工艺可精制得到纯度≥99％的莱鲍迪甙A，莱 鲍迪甙A产率＞85％，其在口感上无任何不良余味，可单独作为甜味剂使用，且处理量大、成 本低，适用于工业生产。
具体实施方式
针对本发明提供从甜叶菊中提取莱鲍迪甙A的方法，通过对本发明具体实施方式的描述 说明但不限制本发明，并通过下述实验证明其有益效果。
实施例1甜叶菊原料与溶剂比例对连续逆流提取的影响
按1∶3、1∶5、1∶7、1∶9(m/v)的重量体积比例，分别将10千克干燥的甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertohi)叶和茎(含莱鲍迪甙A 8％)与5％(v/v)的水与甲醇混合溶剂在70℃进 行连续逆流提取，水与甲醇混合溶剂对每千克甜叶菊原料的流速为2L/h。
测量提取液体积，并定量量取部分提取液蒸干至恒重后称重，并分别取样以HPLC方法 进行纯度鉴定，实验结果见表1。
表1甜叶菊原料与溶剂比例对连续逆流提取的影响
以上实验结果表明，在对甜叶菊原料进行连续逆流提取中，当甜叶菊原料与溶剂比例为 1∶5～1∶7时有最佳提取效果。
本发明不限于实施例中莱鲍迪甙A的特定含量以及甜叶菊原料与溶剂的特定比例。
实施例2水与甲醇混合溶剂比例对连续逆流提取的影响
按1∶6(m/v)的重量体积比例，分别将10千克甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertohi)叶和 茎与0％、5％、10％、15％(v/v)的水与甲醇混合溶剂在70℃进行连续逆流提取，水与甲 醇混合溶剂对每千克甜叶菊原料的流速为2L/h。
测量提取液体积，并定量量取部分提取液蒸干至恒重后称重，并分别取样以HPLC方法 进行纯度鉴定，实验结果见表2。
表2水与甲醇混合溶剂比例对连续逆流提取的影响
以上实验结果表明，在对甜叶菊原料进行连续逆流提取中，当水与甲醇混合溶剂比例为 5％～10％时有最佳提取效果。
本发明不限于实施例中莱鲍迪甙A的特定含量以及水与甲醇混合溶剂的特定比例。
实施例3提取温度对连续逆流提取的影响
按1∶6(m/v)的重量体积比例，分别将10千克甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertohi)叶和 茎与7％(v/v)的水与甲醇混合溶剂在50℃、60℃、70℃、80℃进行连续逆流提取，水与甲 醇混合溶剂对每千克甜叶菊原料的流速为2L/h。
测量提取液体积，并定量量取部分提取液蒸干至恒重后称重，并分别取样以HPLC方法 进行纯度鉴定，实验结果见表3。
表3提取温度对对连续逆流提取的影响
以上实验结果表明，在对甜叶菊原料进行连续逆流提取中，当提取温度为70℃～80℃时 有最佳提取效果。
本发明不限于实施例中莱鲍迪甙A的特定含量以及提取的特定温度。
实施例4提取流速对连续逆流提取的影响
按1∶6(m/v)的重量体积比例，分别将10千克甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertohi)叶和 茎与7％(v/v)的水与甲醇混合溶剂在70℃进行连续逆流提取，水与甲醇混合溶剂对每千克 甜叶菊原料的流速为1、2、3、4L/h。
测量提取液体积，并定量量取部分提取液蒸干至恒重后称重，并分别取样以HPLC方法 进行纯度鉴定，实验结果见表4。
表4提取温度对对连续逆流提取的影响
以上实验结果表明，在对甜叶菊原料进行连续逆流提取中，当对每千克甜叶菊原料的提 取流速为1～2L/h时有最佳提取效果。
本发明不限于实施例中莱鲍迪甙A的特定含量以及水与甲醇混合溶剂对每千克甜叶菊原 料的特定流速。
实施例5吸附流速对极性树脂纯化效果的影响
分别以2kg极性树脂对超滤后滤液3L(莱鲍迪甙A浓度26g/L)进行吸附洗脱，吸附流速 为1、2、3、4BV/h，吸附后以40％(v/v)的甲醇与水混合溶剂进行洗脱，洗脱流速为1BV/h。 将洗脱液浓缩后，于-20℃冷冻搅拌结晶24小时，再于-20℃冷冻搅拌重结晶24小时，过 滤收集晶体，80℃烘干，得莱鲍迪甙A。
表5吸附流速对极性树脂吸附效果的影响
以上实验结果表明，通过本发明可以从甜叶菊原料中提取得到纯度≥99％的莱鲍迪甙A。 并且在以极性树脂进行纯化过程中，当吸附流速为1～2BV/h时有最佳纯化效果。
本发明不限于实施例中莱鲍迪甙A的特定含量以及极性树脂对超滤后滤液的特定吸附流 速。
实施例6洗脱溶剂比例对极性树脂纯化效果的影响
分别以2kg极性树脂对超滤后滤液3L(莱鲍迪甙A浓度26g/L)进行吸附洗脱，吸附流速 为1.5BV/h，吸附后以吸附后以30％、40％、50％、60％(v/v)的甲醇与水混合溶剂进行洗 脱，洗脱流速为1BV/h。将洗脱液浓缩后，于-20℃冷冻搅拌结晶24小时，再于-20℃冷冻 搅拌重结晶24小时，过滤收集晶体，80℃烘干，得莱鲍迪甙A。
表6洗脱溶剂比例对极性树脂纯化效果的影响
以上实验结果表明，通过本发明的精制工艺可以从甜叶菊原料中提取得到纯度≥99％的莱 鲍迪甙A。并且在以极性树脂进行纯化过程中，50％～60％(v/v)的甲醇与水混合溶剂有最佳 洗脱效果。
本发明不限于实施例中莱鲍迪甙A的特定含量以及对极性树脂洗脱的特定溶剂比例。
实施例7洗脱流速对极性树脂纯化效果的影响
分别以2kg极性树脂对超滤后滤液3L(莱鲍迪甙A浓度26g/L)进行吸附洗脱，吸附流速 为1.5BV/h，吸附后以40％(v/v)的甲醇与水混合溶剂进行洗脱，洗脱流速为0.5、1、1.5、 2BV/h。将洗脱液浓缩后，于-20℃冷冻搅拌结晶24小时，再于-20℃冷冻搅拌重结晶24 小时，过滤收集晶体，80℃烘干，得莱鲍迪甙A。
表7吸附流速对极性树脂吸附效果的影响
以上实验结果表明，通过本发明的精制工艺可以从甜叶菊原料中提取得到纯度≥99％的莱 鲍迪甙A。并且在以极性树脂进行纯化过程中，洗脱流速为0.5～1BV/h时有最佳洗脱效果。
本发明不限于实施例中莱鲍迪甙A的特定含量以及极性树脂对超滤后滤液的特定洗脱流 速。
实施例8连续逆流提取与的回流提取比较
按1∶6(m/v)的重量体积比例，将1千克甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertohi)叶和茎与 7％(v/v)的水与甲醇混合溶剂在70℃进行连续逆流提取，水与甲醇混合溶剂对每千克甜叶 菊原料的流速为2L/h，连续逆流提取共进行3小时。
按1∶4(m/v)的重量体积比，将1千克甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertohi)叶和茎与7 ％(v/v)的水与甲醇混合溶剂进行回馏，回馏在相应的装置中以约甲醇沸点的温度进行回馏 约2小时。回馏后收集提取液，并按以上条件继续进行回馏，回馏共进行3次。
分别测量提取液体积，并定量量取部分提取液蒸干至恒重后称重，并分别取样以HPLC 方法进行纯度鉴定，实验结果见表8。
表8连续逆流提取与回流提取之比较
以上实验结果表明，在对甜叶菊原料进行提取中连续逆流提取与回流提取相比，连续逆 流提取具有更高的莱鲍迪甙A含量，提取转化率以及更短的提取时间。
实施例9冷冻搅拌结晶与常温结晶比较
准确称取50.00g 85％莱鲍迪甙A置于500ml的三角瓶中，加入200ml含水8％(v/v)的 乙醇溶剂。60℃加热搅拌2.5小时，-20℃冷冻搅拌结晶24小时，过滤收集晶体，再按以上 条件进行重结晶。结晶于80℃烘干至恒重后称重，并分别取样以HPLC方法进行纯度鉴定， 得99.37％莱鲍迪甙A41.14g，产率为96.2％。
准确称取50.00g 85％莱鲍迪甙A置于500ml的三角瓶中，加入200ml含水15％(v/v) 的甲醇溶剂。60℃加热溶解后，于25℃结晶24小时，过滤收集晶体，再按以上条件进行重 结晶。结晶于80℃烘干至恒重后称重，并分别取样以HPLC方法进行纯度鉴定，得91.52％ 莱鲍迪甙A41.65g，产率为89.7％。
以上实验结果表明，通过本发明的工艺可以从甜叶菊原料中提取得到纯度≥99％的莱鲍迪 甙A。并且冷冻搅拌结晶与常温结晶相比，冷冻搅拌结晶具有更高的莱鲍迪甙A含量和结晶 产率。
实施例8、9是分别与对比文件(专利US 20060083838、专利JP 07,143,860)中的关键 步骤进行对比，该试验证明采用本发明方法从甜叶菊中提取所得提取物中的莱鲍迪甙纯度高， 产率高，并非通过对比文件中的工艺的简单替换，产生的效果对本领域技术人员来说，是非 显而易见的。