描述
本发明涉及用于重组生长因子蛋白的有效原核生物生产和纯化的改进方法。更特别地，本发明涉及导致更好的蛋白产量、更高的产品纯度以及所述方法的改善的工业应用的程序改进。
生长和分化因子(GDF)是促进细胞增殖/分化和组织再生的同型二聚细胞因子。在大范围的医学应用中有用的GDF是生长/分化因子5(GDF-5)。尤其是过去已经成功地应用了GDF-5的成骨特性，即，帮助局部骨折的愈合。具有重叠生物功能和非常高氨基酸同源性的GDF-5的非常近的亲缘物质是GDF-6和GDF-7。GDF-5/-6/-7在哺乳动物中是保守的，但在无脊椎动物中不具有已知的同源基因(Ducy和Karsenty 2000，Kidney Int.57，2207-2214)。
在体内，该蛋白家族的成员最初作为大的前体蛋白合成，其随后在离C-末端大约110-140个氨基酸的碱性残基簇处经历蛋白水解裂解地，因此从N-末端前结构域释放出生物活性C-末端成熟蛋白部分。所有成熟多肽在结构上是相关的并含有保守的生物活性结构域，其含有六个或七个标准半胱氨酸。这些残基之间的二硫桥键有助于该蛋白家族的典型三维“半胱氨酸-结”基序。
在过去已经实现了在原核宿主中表达成熟GDF-5(参见，例如，Biochem.Biophys.Res.Commun.，204，pp.646-652，1994)。然而，这些蛋白不能容易地制得纯化形式。
当在大肠杆菌中大规模表达时，所需的蛋白通常趋于形成具有14kDa大小的单体且无活性的蛋白，其在包含体中累积。为了获得二聚的生物活性生长因子(28kDa)，必需将单体包含体蛋白溶解，纯化并复性成具有典型半胱氨酸-结结构的同型二聚体。通常将该程序称为“重折叠”。
由于在pH值为pH4至pH9之间的水溶液中非常低的溶解性以及其他不常见的蛋白质特征，在原核生物中产生的GDF-5相关蛋白的纯化和重折叠必需涉及几个特别修改的程序步骤。例如，由于重折叠的GDF-5相关蛋白趋于吸收至色谱树脂上，已经清楚的是不能根据标准的纯化实验方案和含水色谱成分来实现大规模生产中所需蛋白的纯化。一旦蛋白得到重折叠，利用有机溶剂的主要纯化方法(如反向色谱)是适用的。
WO 96/33215中公开了最近研发的重组产生的GDF-5相关蛋白的生产和纯化方法。该方法是基于在重折叠程序之前单体蛋白的纯化，并且包括以下主要步骤：
1.细菌培养、细胞破坏和包含体的回收，
2.用变性剂处理来获得溶解的单体，
3.通过离子交换色谱分离，
4.磺化(该磺化步骤是任选的)，
5.通过凝胶过滤色谱分离，
6.重折叠，
7.通过等电点沉淀回收，和
8.通过反向色谱分离。
尽管如上所述的程序基本上是适用的，但该方法在头两个处理步骤中遇到了一些困难，这两个步骤都影响目标蛋白的产量和纯度。可获得的GDF-5相关蛋白产量明显低于理论预期的，主要是由于包含体蛋白溶解过程中与不常见的混浊/粘滞溶液相关的部分降解事件。因此，明显的是应当对所公开的工艺参数和条件进行改进。
本发明的目的是克服上述问题并优化重组GDF-5相关蛋白的产量和纯度。
通过研发下文中公开的用于在大肠杆菌中生产重组GDF-5相关蛋白的改进方法解决了这些目的。
在本发明的详述之前，应当将一些常用的术语进行限定和解释，如下：
如在此所用的术语“半胱氨酸-结结构域”意指公知的且保守的富含半胱氨酸氨基酸的区域，其存在于TGF-β超家族蛋白如即人GDF-5的成熟部分中，并形成称为半胱氨酸-结的三维蛋白结构。在该结构域中，半胱氨酸残基彼此的各自位置是重要的并且只允许略有改变，使得没有失去生物活性。已经证明了单独的半胱氨酸-结结构域对于蛋白的生物功能就足够了(Schreuder等(2005)，Biochem Biophys ResCommun.329，1076-86)。半胱氨酸-结的共有序列是本领域公知的。根据在此限定的定义，蛋白的半胱氨酸-结-结构域开始于参与各自蛋白的半胱氨酸-结的第一个半胱氨酸残基，结束于其前面为参与各自蛋白的半胱氨酸-结的最后一个半胱氨酸的残基。例如，人GDF-5前体蛋白(SEQ ID NO：1)的半胱氨酸-结结构域由氨基酸400-501组成(请参阅图1)。
如在此所用的术语“GDF-5-相关蛋白”意指任何天然产生或人工形成的蛋白，其含有半胱氨酸-结-结构域，与人GDF-5的102aa半胱氨酸-结-结构域(SEQ ID NO：1的氨基酸400-501)具有至少60％的氨基酸同一性。该术语包括来自脊椎动物或哺乳动物物种的属于GDF-5、GDF-6和GDF-7蛋白组的具有相似生物物理特性的蛋白及其重组变体，只要这些蛋白显示出与人GDF-5的半胱氨酸-结结构域具有上述百分比的同一性。60％的极限值非常适于将蛋白GDF-5/-6/-7组的成员及其变体与更多的蛋白如其他GDF和BMP分开。人GDF-5、人GDF-6和人GDF-7的102aa半胱氨酸-结-结构域的比较揭示了这些蛋白之间高级的氨基酸同一性(见图2)。与人GDF-5的半胱氨酸-结-结构域相比，人GDF-6享有87(85％)个相同的残基，而人GDF-7享有83(81％)个相同的残基。与人GDF-5相比较时，迄今为止已经鉴定的来自其他脊椎动物和哺乳动物物种的GDF-5/-6/-7分子各自的结构域也显示出至少75％(79％至99％)的非常高的同一性百分比。相反，不属于GDF-5/-6/-7亚组的GDF和BMP呈现出低于60％的低得多的同一性值(参见图3)。
可以使用公知的比对算法和任选使用这些算法的计算机程序来容易地进行相关氨基酸序列中相应氨基酸位置的确定以及之间同一性百分比的计算。例如，通过比对序列计算出本专利申请中的氨基酸同一性(即，图2)，使用了免费软件程序ClustalX(版本1.81)并使用缺省参数和随后手工计数相同的残基。成对比对(慢-精确)的缺省设定为：间隙开放参数：10.00；间隙延伸参数：0.10；蛋白权矩阵：Gonnet250。ClustalX程序详述于Thompson，J.D.，Gibson，T.J.，Plewniak，F.，Jeanmougin F.和Higgins，D.G.(1997)：The ClustalX windowsinterface：flexible strategies for multiple sequence alignmentaided by quality analysis tools，Nucleic Acids Research24：4876-4882)。
ClustalX是用于ClustalW多个序列比对程序的窗口界面并且是即可从各种来源获得，即，通过来自ftp-igbmc.u-strasbg.fr、ftp.embl-heidelberg.de、ftp.ebi.ac.uk的匿名ftp或通过从以下网页下载：http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/。ClustalW程序和算法还详述于Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)：CLUSTALW：improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice，Nucleic Acids Research 22：4673-4680)。
如在此所用的术语“变体”意指以下多肽中的任何一种：
a)蛋白的生物活性片段
b)生物活性蛋白构建体，其除了蛋白的原始序列还含有其他序列
c)a)和b)的任意组合
术语包含体的“分解缓冲液”或“溶解缓冲液”意指用于溶解包含体并使所述包含体中结合的蛋白质变性的溶液。
术语“生物活性”表示治疗化合物的活性，包括，例如，GDF-5-相关蛋白，如通过常规体外碱性磷酸酶测定(ALP)所测量的，例如，如实施例5或Takuwa等(1989)，Am.J.Physiol.257，E797-E803中所述的。可以用于这样的ALP测试中的合适细胞系是例如ATDC-5或MCHT 1/26细胞。
以下给出了本发明的更详细描述：
重组GDF-5相关蛋白，特别是重组人GDF-5的制造方法包括以下的初始步骤：在大肠杆菌中发酵，收集生物质，细胞破坏，包含体收集/洗涤和变性条件下的包含体分解。随后，将变性的蛋白接受下游纯化步骤和重折叠程序，如例如，WO96/33215中所述的。
使用高压均质机常规地进行所述的细胞破坏步骤。此后，通常通过离心和(任选)重复洗涤来收集包含体(IB)。在随后的纯化步骤之前，通过悬浮于含有高含量变性脲的溶解缓冲液中来实现包含体蛋白的分解(溶解)。
明显地，现在含有单体和变性的包含体蛋白的溶解溶液看上去非常混浊和粘滞，即使在之前的过滤或离心后。同时，发生了单体GDF-5的时间依赖性断裂(参见图5)，这是最终导致相当大部分的GDF-5单体的破坏/大小减小的过程。在少于1.5小时内，溶解溶液中成熟单体蛋白的大小明显地从最初的14kD降至大约10kD。这种不利的和快速降解的事件似乎是序列-/构象-相关的，并且限于包含体溶解的步骤。由于通常作为按比例放大量的结果延长了处理时间，因此时间依赖性降解过程尤其是妨碍大/工业规模的蛋白生产。因此，在整个纯化程序后最终获得的GDF-5相关蛋白的产量和纯度明显降低。
为了克服所公开的问题，发明人进行了充分的调查研究并进行了各种不同的方法，其最终形成了改进的纯化方法。这些尝试包括细胞破坏压力的改变，为了对抗潜在的酶/蛋白水解污染的蛋白酶灭活实验，关键的溶解和/或洗涤缓冲液成分浓度的改善以及将不同的化合物加入溶解缓冲液中。
然而，目标在于证实和灭活引起所观察到的蛋白降解的推定蛋白水解活性的不同努力全部失败(参见实施例3：化学抑制和热灭活)，发明人已经发现了仍然可以通过进行两个重要的方法相关的改进来实现蛋白断裂的减少和较高的蛋白产量/纯度，这两个改进可以是单独的或(优选)结合。这些改进是所公开发明的特定实施方案并涉及1)细胞破坏压力的改进和2)溶解缓冲液组成的优化。下文中更详细地举例说明了：
1)通过高压均质破坏细胞的改进
已经确定了溶解溶液(含有溶解的包含体)异常的高浊度和粘度对于GDF-5相关蛋白的下游纯化过程是有害的并且必须避免。然而，在包含体溶解之前的附加过滤或是离心步骤都未能解决该问题，出乎意料地发现了通过所用细胞破坏压力的特定选择性改进可解决该问题。然而，压力通常在大范围(例如，从100至2000巴)中变化，而对包含体溶解没有剧烈影响，如果将GDF-5相关蛋白进行纯化，将该程序限制在窄范围中是必要的。更确切地，如果使用800-900巴的破坏压力，可检测到GDF-5相关蛋白纯化过程的第一部分的过程中更清澈的溶解的包含体的溶液和产物产量的增加。此外，在较高破坏压力下，比例(rhGDF-5/总蛋白)明显提高。由于更好的过滤性，总的处理时间更短，因此降低了时间依赖性蛋白断裂。相反，超过或低于该范围的破坏压力是不利的并导致明显的产量下降(参见，例如，图6)。
2)溶解缓冲液组成的改进
本发明涵盖了以下的溶解缓冲液成分的改进：
脲/补充L-精氨酸
尽管脲对生长和分化因子(GDF)的一级结构稳定性的不利影响在现有技术中尚未有描述，但发明人已经发现了如果从接触包含体的所有溶液中完全除去脲(例如，从洗涤和溶解缓冲液中)，GDF-5相关蛋白的断裂不再发生。然而，为了维持所需的变性作用，从溶解缓冲液中除去变性剂不是可行的。不幸地，由于胍盐的支持腐蚀的属性(其在一些情况中可能导致导管和储罐降低的经济寿命)，通过盐酸胍(GuHCl)作为替换的变性剂代替脲在工业生产工厂中也不推荐。此外，GuHCl是非常昂贵的并可能增加方法相关的成本。
因此，发明人在寻找可替换的方式来消除上述蛋白酶相关的GDF-5衰变。作为详细实验的结果，发现了如果所述溶液补充了限定浓度的L-精氨酸作为保护添加剂，则消除了含脲溶解缓冲液中所述GDF-5相关蛋白的断裂。
如实施例3/图7和8中所示，将L-精氨酸加入到含脲溶液中以浓度依赖性方式降低或消除了GDF-5的降解。使用含有至少100mM L-精氨酸的缓冲液，降解降低大约50％，并且通过使用含有500mM或更多L-精氨酸的溶解缓冲液可以完全停止降解。即使较小浓度的L-精氨酸(如实施例3的缓冲液A4中的1mM L-精氨酸)也呈现出可检测的断裂抑制作用。
L-精氨酸作为补充成分用于含有GDF-5相关蛋白的包含体的含脲溶解缓冲液具有几个优势。首先，由于L-精氨酸是相当低价的化学产品，尽管添加了该物质，但维持了蛋白纯化过程的成本效率。其次，脲和L-精氨酸的组合比含有盐酸胍的变性溶液腐蚀性要低得多。第三，与需要特殊处理的胍盐相比，L-精氨酸更环保。这种优势使得本发明对于使用富含金属设备的工业工厂尤其有用。此外，可以通过，例如，在包含体溶解后直接应用简单的渗滤步骤从纯化过程中容易地除去L-精氨酸。这尤为重要，因为建议的向溶解缓冲液中添加L-精氨酸干扰了随后GDF-5相关蛋白与离子交换色谱(IEC)柱的结合。(参见实施例4)。如果在包含体溶解后(任选地)使用其他纯化步骤(例如，离心、深度过滤和/或无菌过滤)以便除去高分子量杂质如细胞碎片，，则有利于渗滤和IEC。用于深度过滤可能的孔径参数为例如0.1-0.7μm，用于无菌过滤的为例如0.22μm。
因此，根据本发明的优选实施方案，并且为了防止蛋白断裂/降解，用于处理GDF-5相关蛋白的包含体的溶解缓冲液应当含有L-精氨酸。该添加剂在本发明的溶解缓冲液中的优选浓度为100至1000mM L-精氨酸。最优选的浓度为400至500mM L-精氨酸。然而，也可以使用较高浓度的L-精氨酸(例如，高达2000mM)，这在非常长的培养/处理时间段中是有用的。
本发明的溶解缓冲液进一步的特征在于含有2至10M脲作为变性剂。优选地，脲的浓度为4M至8M。最优选地是含有6M脲的溶解缓冲液。
本发明的其他部分涉及所述对于方法的生产力具有不太剧烈但仍然具有明显影响的溶解缓冲液的更多改进。
pH：
根据WO1996/033215中公开的rhGDF-5纯化方法，描述了pH8.3适于GDF-5相关蛋白的溶解缓冲液。然而，目前已经发现了(请参阅实施例3/图7)使用9.0至11.0之间较高pH值的溶解缓冲液有助于降低降解和改善纯化过程中获得的总蛋白量。可以使用图9中所示的GDF-5的pH-依赖性溶解度特征来解释这种发现。pH 8.3下的溶解度低，但使用较高的pH明显提高。因此，还认为9.0至11.0之间的pH对于本发明的溶解缓冲液是有用的。
螯合剂：
此外，可以调节溶解缓冲液中螯合剂的浓度。使用螯合剂来安全地结合金属物质，如汞、砷或铅。常用的合成螯合剂是EDTA，将其用于本发明的溶解缓冲剂中(例如，以Na2EDTA或Na3EDTA的形式)。根据实施例3中所述的实验，将螯合剂的浓度从最初所述的1mmol/l(参见WO/1996/033215)提高至5-100mmol/l是有益的，优选地提高至5-50mmol/l。
最优选的溶解缓冲液含有以下成分：
20mM Tris-HCl
6M脲
64mM DTT
500mM L-精氨酸
5mM Na3EDTA
根据本发明的主要的方法改进概括于图10中。为预防起见，应当注意到所提出的纯化方案表示了本发明的优选实施方案，而本发明决不受限于这种处理步骤的顺序或编号(尤其是涉及图10的步骤5至9)。单个步骤可以省略、由其他纯化方法取代或补充，只要整个纯化程序包括最初的步骤1.细菌细胞培养(优选的细菌宿主是大肠杆菌，尤其优选的宿主株是W3110和D1210)，2.细胞破坏，3.包含体的回收和4.包含体的溶解。
已经使用重组人GDF-5作为测试物质举例说明了公开的发明。然而，由于特别高的序列同源性(参见图2)，纯化方法也适用于其他GDF-5相关蛋白的纯化。术语“GDF-5相关蛋白”包括属于脊椎动物GDF-5、GDF-6和GDF-7蛋白组的功能相似蛋白及其重组变体。所有GDF-5相关蛋白的共有特征是与人GDF-5的102aa半胱氨酸-结结构域具有至少60％氨基酸同一性的生物活性半胱氨酸-结-结构域的存在，这对于蛋白的生物功能足够了。如从图3中可看到的，60％的优选极限值将GDF-5/-6/-7组的成员与相关性较远的GDF和BMP分开。尤其优选的蛋白呈现出与人GDF-5的102aa半胱氨酸-结结构域具有至少75％、80％或90％的氨基酸同一性。
对于脊椎动物和哺乳动物GDF-5相关蛋白的非限制性实例是人GDF-5的前体和成熟蛋白(如WO95/04819中公开的MP52和等，1994，Biochem.Biophys Res.Commun.204，646-652中公开的人GDF-5)，重组人GDF-5/MP52(WO96/33215)，MP52Arg(WO97/06254)；HMW人MP52s(WO97/04095)，CDMP-1(WO96/14335)，鼠(Mus musculus)GDF-5(US 5,801.014)，兔(家兔)GDF-5(Sanyal等，2000，MolBiotechnol.16，203-210)，鸡(Gallus gallus)GDF-5(NCBI登录号no.NP-989669)，非洲爪蛙(Xenopus laevis)GDF-5(NCBI登录号no.AAT99303)，单体GDF-5(WO01/11041和WO99/61611)，人GDF-6/BMP-13(US5,658,882)，鼠GDF-6(NCBI登录号no.NP-038554)，GDF-6/CDMP-2(WO96/14335)，人GDF-7/BMP-12(US5,658,882)，鼠GDF-7(NCBI登录号no.AAP97721)，GDF-7/CDMP-3(WO96/143335)。本发明还涵盖具有其他突变如取代、添加和删除的GDF-5-相关蛋白，只要这些其他突变没有完全消除生物蛋白活性。一些优选的变体是具有提高的生物活性的GDF-5相关蛋白。例如，正常存在于人GDF-5前体蛋白中的一个或多个残基(参见图1)在这些突变中由其他氨基酸取代：人GDF-5前体位置438的精氨酸由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或天冬酰胺替换；和/或丝氨酸439由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸替代；和/或天冬酰胺445由丝氨酸或苏氨酸替代。在另一个高活性突变体中，甲硫氨酸453和/或甲硫氨酸456由丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸替代。特定目标还有其中亮氨酸441由脯氨酸替代的突变体。
可以使用建立的测试系统容易地测定GDF-5相关蛋白的生物活性。最有用和优选的是称为碱性磷酸酶(ALP)测试的常用体外测试(Takuwa等，1989，Am.J.Physiol.257，E797-E803)，其在实施例5中也有描述。已经证明了GDF-5相关蛋白能提高碱性磷酸酶活性，即，在ROB-C26细胞中(Yamaguchi等，1991，Calcif.Tissue Int.49，221-225)，如WO95/04819中所述的，在胚胎ATDC5细胞中(RikenGene Bank，ROB 0565)，在鼠基质MCHT-1/26细胞中和在HPDL细胞中，如Nakamura等，2003，J.Periodontal Res.38，597-605中所述的。
以下的非限制性实施例连同附图和序列记录一起用来进一步说明本发明。
序列：
SEQ ID NO：1显示了人GDF-5前体的蛋白序列。
SEQ ID NO：2显示了人GDF-5前体的DNA序列。
SEQ ID NO：3显示了成熟的人GDF-5的120aa蛋白序列。如果重组产生，蛋白可以替换地由119aa组成，因此开始于SEQ ID NO：3的第二个aa(脯氨酸)。
SEQ ID NO：4显示了成熟的人单体GDF-5的120aa蛋白序列。该蛋白可替换地由119aa组成，因此开始于SEQ ID NO：4的第二个aa(脯氨酸)。
附图：
图1显示了根据SEQ ID NO：1的人GDF-5前体蛋白的特征：
aa 001-381pre-前结构域(粗体字母)
aa 001-027信号肽(粗体和带下划线的)
aa 382-501成熟蛋白部分
aa 400-501半胱氨酸-结-结构域(带下划线的)
图2显示了人GDF-5的102aa半胱氨酸-结结构域(SEQ ID NO：1)、人GDF-6(来自专利US5,658,882的序列2)和人GDF-7(来自专利US5,658,882的序列26)的比较。将所有三个分子中相同的氨基酸残基高亮显示了。
图3显示了几个已知的BMP和GDF的半胱氨酸-结结构域与人GDF-5的半胱氨酸-结-结构域的序列同一性的表。
图4显示了如实施例1和(更详细地)WO1996/033215中所述的，用于重组人成熟GDF-5表达的质粒图谱。
图5显示了SDS-Page，其呈现了包含体在溶解缓冲液中(8M脲，20mM Tris，10mM DTT，1mM Na2EDTA，pH8.3)的溶解过程中的重组成熟GDF-5的时间依赖性断裂。单体GDF-5从14kDa降至10kDa(片段)。在溶解3小时后，断裂接近完全。
图6显示了SDS-Page，其呈现了根据实施例2的细胞破坏压力的改进对蛋白断裂、产量和纯度的作用。在该实验亚组中，将560巴的破坏压力(上图)与850巴的破坏压力(下图)相比较。860巴的较高压力导致蛋白断裂明显降低和较高的蛋白产量/纯度。
图7和8显示了SDS-Page，其呈现了不同溶解缓冲液对溶解于溶解缓冲液中的单体GDF-5的断裂的作用。缓冲液组成列于实施例3中。
图9显示了成熟GDF-5的pH-依赖性溶解度的特征。
图10显示了根据本发明的GDF-5生产方法的改进。
实施例：
实施例1：rhGDF-5的生产和纯化
(1)表达载体的构建和大肠杆菌的转化
按照WO1996/033215的实施例1中所述的进行用于生产成熟重组人GDF-5(Seq ID NO.3的氨基酸1至119)的质粒载体系统的构建和宿主株大肠杆菌W3110(W3110M)的转化。
(2)大肠杆菌中的培养
将表达本发明蛋白的大肠杆菌在改良SOC培养基(Bacto胰蛋白胨20g/l，Bacto酵母提取物5g/l，NaCl 0.5g/l，MgCl2 6H2O 2.03g/l，葡萄糖3.6g/l)中预培养。将100ml细菌悬浮液用于接种51生产培养基(Bacto胰蛋白胨5g/l，柠檬酸4.3g/l，K2HPO4 4.675g/l，KH2PO4 1.275g/l，NaCl 0.865g/l，FeSO4×7H2O 100mg/l，CuSO4×5H2O 1mg/l，MnSO4×nH2O 0.5mg/l，CaCl2×2H2O 2mg/l，Na2B4O7×10H2O 0.225mg/l，(NH4)6Mo7O24×4H2O 0.1mg/l，ZnSO4×7H2O2.25mg/l，CoCl2×6H2O 6mg/l，MgSO4×7H2O 2.2g/l，盐酸硫胺5.0mg/l，葡萄糖3g/l)，使用通风-搅拌将其在10-升发酵罐中培养，然后在到达对数生长期早期时(OD550＝5.0)，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代-半乳吡喃糖苷并且继续培养，直至达到OD550＝150。在培养过程中，将温度维持在32℃，通过添加氨将pH值维持在7.15。为了防止溶解氧浓度的下降，加速搅拌来保持50％空气饱和的溶解氧浓度。通过加入0.2％水平的50％葡萄糖溶液来进行培养以获得高细胞密度，以溶解氧浓度的突然提高作为指示。
(3)大肠杆菌包含体的制备
将通过上述方法获得的培养液离心，以收集细胞，然后将其悬浮于含有10mM乙二胺四乙酸的25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.3)中。通过高压均质机将细胞破坏并再次离心来收集含有包含体的沉淀。
(4)大肠杆菌包含体的洗涤和溶解
洗涤(例如，使用1％曲通X-100)三次后，将大肠杆菌包含体在3,000×g下4℃离心30分钟，然后通过在溶解缓冲液(20mM Tris-HCl缓冲液，8M脲，10mM DTT和1mM Na2EDTA，pH8.3)中超声波处理来溶解所得到的沉淀物。
由于所观察到的GDF-5包含体蛋白在含脲缓冲液中的部分降解(参见图5)，还对实施例3中所述的各种其他溶解缓冲剂进行了测试。
(5)单体的制备
将溶解缓冲液在20,000g 4℃下离心30分钟，并收集所得到的上清液。将所获得的上清液接受用20mM Tris-HCl缓冲液pH8.3，6M脲和1mM EDTA平衡的SP-Sepharose FF(Pharmacia AB)，并且然后，用相同的溶液洗涤后，用含有0.5M NaCl的相容溶液洗脱。通过加入各自终浓度为111mM和13mM的Na2SO3和Na2S4O6以及在4℃下培养15小时将洗脱液中的蛋白磺化。将磺化的溶液在用20mM Tris-HCl缓冲液，pH8.3，6M脲，0.2M NaCl，和1mM EDTA平衡的SephacrylS-200HR(Pharmacia AB)上进行凝胶过滤，以获得纯化的本发明蛋白的磺化单体。
(6)重折叠
将磺化单体的溶液加入9倍体积的50mM甘氨酸钠缓冲液pH9.8，0.2M NaCl，16mM CHAPS，5mM EDTA，2mM GSH(还原型谷胱甘肽)和1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)中，并搅拌，然后在4℃下培养24小时，以将本发明的蛋白氧化和重折叠。
(7)同型二聚体的制备
用相同体积的纯净水将重折叠溶液稀释，然后通过加入6N NaCl将pH值调节至大约7.4并进行等电点沉淀。将在3,000×g下离心20分钟收集的沉淀物在含有0.1％TFA的30％乙腈溶液中溶解20分钟。用相同体积的纯水将溶液稀释并装载于用含有0.05％TFA的25％乙腈预平衡的反向HPLC的RESOURCE RPC柱上(Pharmacia AB)，然后用含有0.05％TFA的25-45％乙腈线性梯度的进行洗脱。将洗脱液监控280nm的吸光值。收集纯化的同型二聚体蛋白级分并通过SpeedVac浓缩仪(Servant Co.)冻干。任选，将纯化的蛋白接受最终的超滤/渗滤步骤。
实施例2：变化I-细胞破坏压力的改进
为了评价细胞破坏对蛋白产量/降解、纯度和过滤性的作用，进行了使用不同细胞破坏压力的几个实验。
将每次发酵的生物质重悬浮于均质缓冲液中(25mM Tris，10mMNa2EDTA，pH7.3)，均质并使用磁力搅拌器搅拌30至60分钟。随后，将生物质悬浮液在高压均质机中在不同的破坏压力下破坏三次。用洗涤缓冲液(20mM Tris，5mM Na2EDTA pH8.3)洗涤接收的包含体并储存在＜-70℃。在4℃下融化过夜后，将IB溶解于含有6M脲和0.5ML-精氨酸的预冷溶解缓冲液中，并用磁力搅拌器再次搅拌30至60分钟。此后，将IB溶液在10℃，重力10000×g(＝7500rpm)下离心30分钟。将上清液滗出，将IB与不溶性成分分开，并通过深度过滤器(CUNO Zeta Plus BC0030A90ZA08A)过滤。此后，将滤液通过无菌过滤器(Nalgene Bottle Top Filter 0.2μm)再次过滤。将无菌滤液浓缩并在装载于CEX柱之前相对CEX缓冲液A(6M脲，20mMTris，1mM Na2EDTA，50mM NaCl，10mM DTT，pH8.3)进行渗滤。用已知的用于测定大肠杆菌蛋白的分析测试方法如SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色和ELISA技术来分析由不同步骤产生的测试样品。
该研究的结果(参见图6)显示了如果用800至900巴之间的破坏压力进行细胞破坏，可以实现rhGDF-5的主要纯化方法的改进。获得了更高质量的IB，形成较高的rhGDF-5/总蛋白比例(例如，850巴的57％对560巴的35％)和对于终产品降低的大肠杆菌蛋白含量(例如，850巴的≤30μg/mg对560巴的＞50μg/mg)。这些改进对于过滤性也是有益的。在大规模中对于生产规模所需的滤器面积可以降低(例如，从理论的560巴的2.6m2降至850巴的＜1m2)。这使得加工时间缩短，蛋白断裂减少和相应rhGDF-5生产成本的降低。
实施例3：变化II-包含体溶解
为了防止GDF-5和相关蛋白的降解，在不同方面改变了例如实施例1中所述的包含体溶解的标准步骤。尝试包括鉴定/抑制潜在的蛋白水解活性的实验以及改变实施例1中所述溶解缓冲液的组成(例如，pH，脲Na2EDTA和DTT，GuHCl，氨基酸，如L-精氨酸)。
(3.1)蛋白酶抑制实验
(3.1.1)化学抑制
在该组实验中，使用了蛋白酶抑制剂混合物。在亚组中，另外将包含体重悬浮于25％HCl(pH2.7)中20分钟，以灭活结合外层细胞壁的蛋白酶。3次洗涤步骤后，将8g重组人GDF-5(rhGDF-5)包含体溶解于50ml含有8M脲的标准溶解缓冲液中。加入2片含有蛋白酶抑制剂混合物的片剂(Roche Diagnostics Protease InhibitorCocktail Tablets Cat.No.11697498001)，并与包含体溶液彻底混合。在室温下培养1.5小时和3小时后，将样品离心并分析。发现rhGDF-5在所有组中大部分被降解，表明使用HCl或蛋白酶抑制剂来化学抑制蛋白降解是无效的。
(3.1.2)热灭活
3次洗涤步骤后，将15g重组人GDF-5(rhGDF-5)包含体溶解于100ml含有10mM Na2EDTA，25mM Tris(pH7.3)的缓冲液中。通过在65℃下培养不同的时间段(20分钟至2小时)来进行热灭活。此后，使样品接受如实施例1中所公开的标准溶解步骤。结果：尽管蛋白酶的热灭活，所有样品中的rhGDF-5被降解了。
(2)溶解缓冲液组成的改进
通过改变所用溶解缓冲液来最小化GDF-5相关蛋白的断裂的尝试是成功的。以下列出了一些测试的溶解缓冲液：
含有脲的缓冲液：
标准：8M脲，20mM Tris，10mM DTT，1mM Na2EDTA，pH8.3
缓冲液U1：8M脲，20mM Tris，64mM DTT，50mM Na2EDTA，pH8.3
缓冲液U2：6M脲，20mM Tris，64mM DTT，50mM Na2EDTA，pH8.3
缓冲液U3：6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mM Na2EDTA，pH8.3
缓冲液U4：6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mM Na2EDTA，50mM NaCl，pH8.3
缓冲液U5：6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mM Na2EDTA，pH9.5
含有L-精氨酸的缓冲液
缓冲液A1：100mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mM Na2EDTA，pH8.3
缓冲液A2：30mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mMNa2EDTA，pH8.3
缓冲液A3：10mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mMNa2EDTA，pH8.3
缓冲液A4：1mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mMNa2EDTA，pH8.3
缓冲液A5：200mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mM Na2EDTA，pH8.3
缓冲液A6：100mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mM Na2EDTA，pH9.5
缓冲液A7：500mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mM Na2EDTA，pH9.5
缓冲液A8：500mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mMNa2EDTA，pH8.3
缓冲液A9：300mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mMNa2EDTA，pH8.3
缓冲液A10：400mM精氨酸，6M脲，20mM Tris，64mM DTT，5mMNa2EDTA，pH8.3
对于降解测试，将0.1g GDF-5包含体与0.9ml溶解缓冲液混合。在溶解于溶解缓冲液中的包含体培养4-5小时后检查降解。通过SDS-Page并随后用考马斯亮蓝染色来分析结果。
结果：特别是，在降解测试过程中获得了以下结果：
-Na2EDTA：将浓度从1提高至5-50mM使得降解略有降低
-pH：从8.3至较高的值(9.0至11.0)以变化使得降解降低以及总蛋白的量增加。例如，溶解缓冲液中的pH从8.3升至9.5(参见，例如，图7中的缓冲液A7和A8)改善了总蛋白的量和降解的级别。如果将pH提高(参见，例如，图7中的缓冲液A6)，即使溶解于含有少量L-精氨酸的缓冲液中的IB在室温下培养5小时后仍然含有rhGDF-5。
-DTT：改变没有作用
-氨基酸，尤其是L-精氨酸：使用含有0至100mM L-精氨酸的溶解缓冲液(pH8.3)获得了以下的初始结果：
在随后的实验中，使用了较高的L-精氨酸浓度。将培养时间提高至5小时。该实验的范围是测试a)溶解缓冲液中较高的L-精氨酸浓度和b)pH移动至更碱性的条件对rhGDF-5降解的影响。结果为：
所用的缓冲 液 总蛋白 [mg/ml] rhGDF-5 [mg/ml] rhGDF-5比例 [rhGDF-5/总蛋 白] rhGDF-5的 降解
不含Arg的缓冲 液(pH，8.3) 5.92 未发现 rhGDF-51) 未发现rhGDF-51) 接近完全2) 不含Arg的缓冲 液(pH，9.5) 7.79 未发现 rhGDF-51) 未发现rhGDF-51) 接近完全2) 含100mM Arg的 缓冲液A6 (pH8.3) 10.03 3.31 33％ 几乎没有 含200mM Arg的 缓冲液A5 (pH8.3) 7.62 1.64 22％ 约50％2) 含300mM Arg的 缓冲液A9 (pH8.3) 7.59 3.34 44％ 很少降解2) 含400mM Arg的 缓冲液A10 (pH8.3) 7.29 3.57 49％ 几乎没有2) 含500mM Arg的 缓冲液A7 (pH9.5) 11.12 5.17 47％ 几乎没有2) 含500mM Arg的 缓冲液A8 (pH8.3) 7.68 4.76 62％ 几乎没有2)
1)来自校准的值
2)通过SDS-PAGE目测判断的降解级别
根据定量评价，降解的级别随着溶解缓冲液中递增的精氨酸浓度而明显降低(上表以及图7和8)。然而，使用400mM精氨酸(溶解缓冲液)A10仍然存在rhGPF-5的一些降解。通过SDS-PAGE目测判断和通过定量评价，在包含体沉淀物中几乎没有发现(降解的)rhGDF-5。因此，rhGDF-5在含精氨酸的溶解缓冲液中的溶解度是良好的。rhGDF-5比例随着溶解缓冲液中较高的L-精氨酸浓度而提高。使用含精氨酸的溶解缓冲液A8(500mM L-精氨酸)达到最好的62％的rhGDF-5比例。认为包含体溶解缓冲液中至少500mM L-精氨酸的浓度对于rhGDF-5和相关蛋白的生产是最佳的。
实施例4：L-精氨酸对离子交换色谱的影响
该实验的目标是检测含有L-精氨酸的改良包含体溶解缓冲液是否影响了随后通过离子交换色谱的蛋白纯化。
将来自发酵的不同包含体样品溶解后施加于填充了包装在XK16/20柱(CV＝28mL)中的柱介质SP Sepharose FF的阳离子交换(CEX)柱上。测试缓冲液含有(除其他所述成分外)8M脲，无L-精氨酸(标准溶解缓冲液)或6M脲，500mM L-精氨酸(改良溶解缓冲液)。
通过用高压均质机(三个循环，850巴)破坏产生GDF-5的大肠杆菌细胞接着两次洗涤来产生包含体。将10.37g所产生的IB溶解于100mL改良溶解缓冲液中(含有0.5M精氨酸的6M脲缓冲液)。在IB离心、终端过滤和无菌过滤后剩下80mL IB溶液。将40mL滤过的IB溶液未稀释装载于CEX柱上(大约172.4mg总蛋白)。分析了两次CEX运行的流过物(DL)、洗涤物和级分的总蛋白和rhGDF-5含量。
结果：由于改良溶解缓冲液改变的传导率(18mS/cm替代了标准溶解缓冲液的5mS/cm)，与含有改良缓冲液的CEX柱的结合不完全。使用改良的溶解缓冲液，与CEX柱只可能有降低的结合(10％的蛋白产量替代约60％)。因此，在CEX之前需要其他的缓冲液交换步骤(渗滤，例如，通过5kDa纤维素膜)。
实施例5：生物活性的碱性磷酸酶(ALP)测试
可以使用确定的测试系统容易地测定GDF-5相关蛋白及其胶体制剂的生物活性。最有用的且优选的是常用的碱性磷酸酶(ALP)测试(Takuwa等，1989，Am.J.Physiol.257，E797-E803)。在该体外测试系统中，将不同蛋白浓度与成骨/软骨细胞共培养后测量GDF-5相关生长因子的生物活性。具有成骨/软骨潜能的GDF-5和相关蛋白提高了这些细胞中的碱性磷酸酶(ALP)表达，例如，在ATDC-5、ROB-C26或MCHT-1/26细胞中。通过比色测定来测定这些细胞裂解物中的ALP活性。该反应是基于对硝基苯基磷酸酯(PNPP)水解成对硝基苯酚，其在碱性条件下作为黄色对硝基苯酚阴离子变成可见的。目的是通过比较用已知浓度的GDF-5参照标准获得的ALP活性来测量所测试LMP制剂的活性。
在标准化的ALP测试中，将1×104个ATDC-5细胞或MCHT1/26细胞在96孔平板中的细胞培养基(α-MEM，青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺，10％FCS)中，37℃，H2O饱和的5％CO2下培养过夜。第二天，用GDF-5相关蛋白或其制剂将细胞刺激72小时，使用所示的配体浓度。随后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)将细胞洗涤。在室温下在100μl碱性裂解缓冲液1(0.1M甘氨酸，pH9.6，1％NP-40，1mM MgCl2，1mM ZnCl2)中将细胞裂解进行1小时。然后加入100μl碱性裂解缓冲液2(0.1M甘氨酸，pH 9.6，1mM MgCl2，1mM ZnCl2+2mg/ml PNPP)。将平板在37℃，H2O饱和的5％CO2下培养。此后，使用100μl 30g/l NaOH将ALP-反应停止，并最终用自动化微平板阅读器在405纳米下测量光密度，考虑了空白值扣除。
序列表
<110>Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung
von Pharmaka mbH
<120>优化的重组生长因子蛋白纯化方法
<130>41066P WO
<140>PCT/EP2008/005016
<141>2008-06-20
<150>EP 07 014 798.8
<151>2007-07-27
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>501
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(501)
<223>人GDF-5前体的氨基酸序列
<400>1
Met Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp
1 5 10 15
Leu Asp Leu Glu Phe Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly
20 25 30
Gln Arg Pro Gln Gly Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys
35 40 45
Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser
50 55 60
Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr
65 70 75 80
Gly Gln Thr Gly Gly Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys
85 90 95
Leu Pro Pro Arg Pro Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro
100 105 110
Gln Thr Arg Gln Ala Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu
115 120 125
Pro Gly Gly Lys Ala Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe
130 135 140
Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu
145 150 155 160
Pro Phe Arg Pro Pro Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu
165 170 175
Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val
180 185 190
Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys
195 200 205
Gly Gln Asp Asp Arg Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe
210 215 220
Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg
225 230 235 240
Ile Leu Arg Lys Lys Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly
245 250 255
Gly Gly Arg Ala Ala Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg
260 265 270
Gln Pro Ala Ser Leu Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly
275 280 285
Ser Gly Trp Glu Val Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys
290 295 300
Asn Ser Ala Gln Leu Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg
305 310 315 320
Ala Val Asp Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val
325 330 335
His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp
340 345 350
Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr
355 360 365
Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu
370 375 380
Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys
385 390 395 400
Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp
405 410 415
Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu
420 425 430
Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val
435 440 445
Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr
450 455 460
Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp
465 470 475 480
Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu
485 490 495
Ser Cys Gly Cys Arg
500
<210>2
<211>2703
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(640)..(2142)
<223>人GDF-5前体的核苷酸序列
<400>2
ccatggcctc gaaagggcag cggtgatttt tttcacataa atatatcgca cttaaatgag 60
tttagacagc atgacatcag agagtaatta aattggtttg ggttggaatt ccgtttccaa 120
ttcctgagtt caggtttgta aaagattttt ctgagcacct gcaggcctgt gagtgtgtgt 180
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtga agtattttca ctggaaagga ttcaaaacta 240
gggggaaaaa aaaactggag cacacaggca gcattacgcc attcttcctt cttggaaaaa 300
tccctcagcc ttatacaagc ctccttcaag ccctcagtca gttgtgcagg agaaaggggg 360
cggttggctt tctcctttca agaacgagtt attttcagct gctgactgga gacggtgcac 420
gtctggatac gagagcattt ccactatggg actggataca aacacacacc cggcagactt 480
caagagtctc agactgagga gaaagccttt ccttctgctg ctactgctgc tgccgctgct 540
tttgaaagtc cactcctttc atggtttttc ctgccaaacc agaggcacct ttgctgctgc 600
cgctgttctc tttggtgtca ttcagcggct ggccagagg atg aga ctc ccc aaa 654
Met Arg Leu Pro Lys
1 5
ctc ctc act ttc ttg ctt tgg tac ctg gct tgg ctg gac ctg gaa ttc 702
Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Leu Glu Phe
10 15 20
atc tgc act gtg ttg ggt gcc cct gac ttg ggc cag aga ccc cag ggg 750
Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly
25 30 35
acc agg cca gga ttg gcc aaa gca gag gcc aag gag agg ccc ccc ctg 798
Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Leu
40 45 50
gcc cgg aac gtc ttc agg cca ggg ggt cac agc tat ggt ggg ggg gcc 846
Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser Tyr Gly Gly Gly Ala
55 60 65
acc aat gcc aat gcc agg gca aag gga ggc acc ggg cag aca gga ggc 894
Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Gly
70 75 80 85
ctg aca cag ccc aag aag gat gaa ccc aaa aag ctg ccc ccc aga ccg 942
Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Leu Pro Pro Arg Pro
90 95 100
ggc ggc cct gaa ccc aag cca gga cac cct ccc caa aca agg cag gct 990
Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro Gln Thr Arg Gln Ala
105 110 115
aca gcc cgg act gtg acc cca aaa gga cag ctt ccc gga ggc aag gca 1038
Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala
120 125 130
ccc cca aaa gca gga tct gtc ccc agc tcc ttc ctg ctg aag aag gcc 1086
Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys Ala
135 140 145
agg gag ccc ggg ccc cca cga gag ccc aag gag ccg ttt cgc cca ccc 1134
Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro
150 155 160 165
ccc atc aca ccc cac gag tac atg ctc tcg ctg tac agg acg ctg tcc 1182
Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ser
170 175 180
gat gct gac aga aag gga ggc aac agc agc gtg aag ttg gag gct ggc 1230
Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val Lys Leu Glu Ala Gly
185 190 195
ctg gcc aac acc atc acc agc ttt att gac aaa ggg caa gat gac cga 1278
Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys Gly Gln Asp Asp Arg
200 205 210
ggt ccc gtg gtc agg aag cag agg tac gtg ttt gac att agt gcc ctg 1326
Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe Asp Ile Ser Ala Leu
215 220 225
gag aag gat ggg ctg ctg ggg gcc gag ctg cgg atc ttg cgg aag aag 1374
Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg Ile Leu Arg Lys Lys
230 235 240 245
ccc tcg gac acg gcc aag cca gcg gcc ccc gga ggc ggg cgg gct gcc 1422
Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Ala
250 255 260
cag ctg aag ctg tcc agc tgc ccc agc ggc cgg cag ccg gcc tcc ttg 1470
Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gln Pro Ala Ser Leu
265 270 275
ctg gat gtg cgc tcc gtg cca ggc ctg gac gga tct ggc tgg gag gtg 1518
Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Val
280 285 290
ttc gac atc tgg aag ctc ttc cga aac ttt aag aac tcg gcc cag ctg 1566
Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gln Leu
295 300 305
tgc ctg gag ctg gag gcc tgg gaa cgg ggc agg gcc gtg gac ctc cgt 1614
Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg
310 315 320 325
ggc ctg ggc ttc gac cgc gcc gcc cgg cag gtc cac gag aag gcc ctg 1662
Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val His Glu Lys Ala Leu
330 335 340
ttc ctg gtg ttt ggc cgc acc aag aaa cgg gac ctg ttc ttt aat gag 1710
Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phe Phe Asn Glu
345 350 355
att aag gcc cgc tct ggc cag gac gat aag acc gtg tat gag tac ctg 1758
Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu
360 365 370
ttc agc cag cgg cga aaa cgg cgg gcc cca ctg gcc act cgc cag ggc 1806
Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly
375 380 385
aag cga ccc agc aag aac ctt aag gct cgc tgc agt cgg aag gca ctg 1854
Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu
390 395 400 405
cat gtc aac ttc aag gac atg ggc tgg gac gac tgg atc atc gca ccc 1902
His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro
410 415 420
ctt gag tac gag gct ttc cac tgc gag ggg ctg tgc gag ttc cca ttg 1950
Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu
425 430 435
cgc tcc cac ctg gag ccc acg aat cat gca gtc atc cag acc ctg atg 1998
Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met
440 445 450
aac tcc atg gac ccc gag tcc aca cca ccc acc tgc tgt gtg ccc acg 2046
Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr
455 460 465
cgg ctg agt ccc atc agc atc ctc ttc att gac tct gcc aac aac gtg 2094
Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val
470 475 480 485
gtg tat aag cag tat gag gac atg gtc gtg gag tcg tgt ggc tgc agg 2142
Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
490 495 500
tagcagcact ggccctctgt cttcctgggt ggcacatccc aagagcccct tcctgcactc 2202
ctggaatcac agaggggtca ggaagctgtg gcaggagcat ctacacagct tgggtgaaag 2262
gggattccaa taagcttgct cgctctctga gtgtgacttg ggctaaaggc ccccttttat 2322
ccacaagttc ccctggctga ggattgctgc ccgtctgctg atgtgaccag tggcaggcac 2382
aggtccaggg agacagactc tgaatgggac tgagtcccag gaaacagtgc tttccgatga 2442
gactcagccc accatttctc ctcacctggg ccttctcagc ctctggactc tcctaagcac 2502
ctctcaggag agccacaggt gccactgcct cctcaaatca catttgtgcc tggtgacttc 2562
ctgtccctgg gacagttgag aagctgactg ggcaagagtg ggagagaaga ggagagggct 2622
tggatagagt tgaggagtgt gaggctgtta gactgttaga tttaaatgta tattgatgag 2682
ataaaaagca aaactgtgcc t 2703
<210>3
<211>501
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Met Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp
1 5 10 15
Leu Asp Leu Glu Phe Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly
20 25 30
Gln Arg Pro Gln Gly Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys
35 40 45
Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser
50 55 60
Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr
65 70 75 80
Gly Gln Thr Gly Gly Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys
85 90 95
Leu Pro Pro Arg Pro Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro
100 105 110
Gln Thr Arg Gln Ala Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu
115 120 125
Pro Gly Gly Lys Ala Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe
130 135 140
Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu
145 150 155 160
Pro Phe Arg Pro Pro Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu
165 170 175
Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val
180 185 190
Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys
195 200 205
Gly Gln Asp Asp Arg Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe
210 215 220
Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg
225 230 235 240
Ile Leu Arg Lys Lys Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly
245 250 255
Gly Gly Arg Ala Ala Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg
260 265 270
Gln Pro Ala Ser Leu Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly
275 280 285
Ser Gly Trp Glu Val Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys
290 295 300
Asn Ser Ala Gln Leu Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg
305 310 315 320
Ala Val Asp Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val
325 330 335
His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp
340 345 350
Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr
355 360 365
Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu
370 375 380
Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys
385 390 395 400
Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp
405 410 415
Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu
420 425 430
Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val
435 440 445
Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr
450 455 460
Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp
465 470 475 480
Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu
485 490 495
Ser Cys Gly Cys Arg
500
<210>4
<211>120
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(120)
<220>
<221>变体
<222>(2)..(120)
<223>成熟人GDF-5的重组变体的氨基酸序列
<400>4
Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys
1 5 10 15
Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly
20 25 30
Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys
35 40 45
Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn
50 55 60
His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr
65 70 75 80
Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu
85 90 95
Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met
100 105 110
Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
115 120
<210>5
<211>120
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(120)
<220>
<221>变体
<222>(2)..(120)
<223>成熟人单体GDF-5的重组变体的氨基酸序列
<400>5
Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys
1 5 10 15
Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly
20 25 30
Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys
35 40 45
Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn
50 55 60
His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr
65 70 75 80
Pro Pro Thr Ala Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu
85 90 95
Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met
100 105 110
Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
115 120
<210>6
<211>102
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>链
<222>(1)..(102)
<223>人GDF-6的半胱氨酸-结-结构域
<400>6
Cys Ser Lys Lys Pro Leu His Val Asn Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp
1 5 10 15
Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly
20 25 30
Val Cys Asp Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala
35 40 45
Ile Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Gly Ser Thr Pro Pro
50 55 60
Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Thr Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Ala Gly Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val
85 90 95
Glu Ser Cys Gly Cys Arg
100
<210>7
<211>102
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>链
<222>(1)..(102)
<223>人GDF-7的半胱氨酸-结-结构域
<400>7
Cys Ser Arg Lys Pro Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp
1 5 10 15
Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly
20 25 30
Leu Cys Asp Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala
35 40 45
Ile Ile Gln Thr Leu Leu Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ser Cys Cys Val Pro Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val
85 90 95
Glu Ala Cys Gly Cys Arg
100
<210>8
<211>102
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>链
<222>(1)..(102)
<223>人GDF-5的半胱氨酸-结-结构域
<400>8
Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp
1 5 10 15
Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly
20 25 30
Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala
35 40 45
Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro
50 55 60
Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile
65 70 75 80
Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val
85 90 95
Glu Ser Cys Gly Cys Arg
100