技术领域
本发明可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建涉及植物叶 绿体可诱导表达载体及其用途，属于基因工程技术领域。具体涉及植 物核基因组转化的植物核转化表达载体和利用植物叶绿体基因组转 化的植物叶绿体转化表达载体。
技术背景
叶绿体(Chloroplast)是一个独特的可以将光能转化为化学能 的细胞器，起源于大家熟知的原生质体。植物细胞中含有500-10000 个拷贝数的叶绿体环状基因组(120-160kb)，每个基因组中含有一 个大的颠倒重复区，这样，通过遗传工程技术可以使一些具有潜在价 值的目的基因在细胞中的数量达到20000个拷贝数，从而使外源基因 的表达量提高到一个极高的水平。因此，植物叶绿体是一个具有吸引 力的遗传工程靶标。
现在分子生物学和生物化学研究表明叶绿体基因的转录和翻译 机制以及起始信号与原核生物有极高的相似性。此外，叶绿体基因经 常以多顺反子基因簇的形式排列，这一点也与原核生物极为相似。尽 管叶绿体和原核生物的遗传机制具有明显的相似性，但是在控制叶绿 体基因表达方法上与原核生物有着本质的不同。与原核生物典型的转 录调控机制不同，叶绿体基因的表达主要是通过核编码的蛋白在翻译 水平和mRNA的稳定性上进行调控。
目前已实现了植物叶绿体稳定遗传转化，主要依赖于同源重组 将外源基因定向整合到叶绿体的基因组中，从而可获得含有重组DNA 构建的同质化或基本同质化的转基因植物。然而，叶绿体遗传工程表 达外源基因的关键不足是缺乏组织特异性表达和发育调控机制来控 制外源基因的时空表达。这种表达量极高的组成型表达可能对表达宿 主的健康和代谢带来潜在的负面影响，尤其是当表达一种具有毒性或 代谢活性的蛋白时将影响转化阶段的组织的分化，从而进一步影响同 质化，或者导致转化植物不能正常生长而死亡。
因此，控制叶绿体基因表达的调控机制将对改变叶绿体基因表达 途径具有重要的意义。如通过组织特异性表达启动子表达调控元件实 现叶绿体转基因植物的组织特异性表达，和在发育的特殊阶段进行诱 导调控实现外源基因的时序表达，来避开对生长发育的不利影响，从 而获得大量外源基因表达产物，使植物叶绿体遗传工程技术在植物生 物反应器应用中发挥全部的能量。
发明内容
本发明的目的在于创建一种新的叶绿体基因的可调控表达技术， 提供两个叶绿体基因可调控表达的表达载体，通过其可以实现外源基 因在植物叶绿体中时空表达，克服现有叶绿体表达载体的不足，为利 用植物叶绿体遗传工程技术实现外源基因的高效表达提供技术支撑。
本发明是通过以下技术方案实现的：通过一个核转化的诱导元 件，包含叶绿体转运信号肽，Gal4 DNA结合域，VP16转录激活域和 雌性激素受体(ER)的嵌合的顺式转录因子，与叶绿体转化的被调控 元件相互作用，实现外源基因的时序表达。
提取烟草基因组总DNA，以总DNA为模板，采用引物1(SEQ ID NO.1)和引物2(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增获得叶绿体转运信号 肽的编码序列的扩增产物，为372bp.将叶绿体转运信号肽的编码 序列与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得含绿体转运信 号肽的编码序列的大肠杆菌克隆pRUB。以抽提大肠杆菌的质粒pRUB 为底物，用限制性内切酶EcoR V和Spe I酶切，获得372bp的片段 与用限制性内切酶EcoR V和Spe I酶切后的pBSK载体，进行连接， 连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得获得含绿体转运信号肽的编码序 列的大肠杆菌克pBSKRUB。
以含有Gal4 DNA结合域，VP16转录激活域的质粒pIN2为模板， 采用以引物3(核苷酸序列与SEQ ID NO：3相同)和引物4(核苷酸 序列与SEQ ID NO：4相同)进行PCR扩增，获得Gal4 DNA结合域， VP16转录激活域的编码核苷酸序列，为526bp。将叶绿体转运信号肽 的编码序列与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得含Gal4 DNA结合域，VP16转录激活域的编码核苷酸序列的大肠杆菌克隆 pTGV。以抽提的大肠杆菌克隆pTGV为底物，用Spe I和Not I酶切， 获得526bp的片段与采用Spe I和Not I酶切后的pBSKRUB载体进 行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有绿体转运信号肽、 Gal4 DNA结合域和VP16转录激活域的编码核苷酸序列的大肠杆菌克 隆pRGV。
采用限制性内切酶BamH I和Sac I酶切质粒pER8和质粒 pBI121，分别回收950bp片段(核苷酸序列与SEQ ID NO：5相同) 和载体并将两者进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有 雌性激素受体的核苷酸编码序列的大肠杆菌克隆pBIER。
采用限制性内切酶BamH I和EcoR I酶切质粒pBIER和质粒 pET30a，分别回收1.2kb片段和载体并将两者进行连接，连接产物转 化大肠杆菌DH5α，获得含有雌性激素受体和NOS终止子的核苷酸编 码序列的大肠杆菌克隆pERNOS。
采用限制性内切酶EcoR V和BamH I酶切质粒pERNOS和质粒 pRGV，分别回收载体和950bp的片段，并将两者进行连接，连接产物 转化大肠杆菌DH5α，获得含有绿体转运信号肽、Gal4 DNA结合域、 VP16转录激活域、雌性激素受体和NOS终止子的核苷酸编码序列的 大肠杆菌克隆pRGVEN。
采用限制性内切酶EcoR V和EcoR I酶切质粒pRGVER，回收 2.2kb的片段；采用限制性内切酶Sma I和EcoR I酶切质粒pBI121， 回收载体并与2.2kb的片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α， 获得含有35S启动子、叶绿体转运信号肽、Gal4 DNA结合域、VP16 转录激活域、雌性激素受体和NOS终止子的调控元件表达盒，以及抗 性筛选基因NPT-II的表达盒植物双元表达载体的大肠杆菌克隆 pIN-I。见图1用于烟草核转化的植物双元表达载体pIN-I结构示意 图。
利用ovlapping PCR技术，采用引物6(核苷酸序列与SEQ ID NO： 6)相同和引物7(核苷酸序列与SEQ ID NO：7相同)，合成一个含 有4个拷贝重复的Gal4 DNA结合位点和截短的含有主要转录调控元 件的嵌合启动子的核苷酸序列(核苷酸序列与SEQ ID NO：8相同)。 PCR产物采用限制性内切酶用Hind III和BamH I酶切，获得115bp 的片段；采用限制性内切酶Hind III和BamH I酶切质粒pBSK，回 收载体并与115bp的片段连接，连接转化大肠杆菌DH5α，获得含有 嵌合启动子的大肠杆菌克隆pCIND；
提取烟草基因组总DNA，以总DNA为模板，采用引物9(SEQ ID NO.11)和引物10(SEQ ID NO.12)进行PCR扩增获得Ribusco大亚 基的3’-UTR的编码序列的扩增产物(SEQ ID NO.13)，PCR产物采用 限制性内切酶用BamH I和Not I酶切，获得的片段；采用限制性内 切酶BamH I和Not I酶切质粒pCIND，回收载体并与---连接，连接 转化大肠杆菌DH5α，获得含有嵌合启动子和Ribusco大亚基的 3’-UTR的核苷酸编码序列的大肠杆菌克隆pCDUTR；
以含有GUS基因的质粒pBI121为模板，采用引物11(SEQ ID NO.14)和引物12(SEQ ID NO.15)进行PCR扩增，获得GUS的cDNA 序列((SEQ ID NO.16)，大小为1840bp。将PCR产物与pMD18-T载 体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得含GUS的编码序列的大肠杆菌克 隆pTGUS。
采用限制性内切酶用BamH I和Sac I酶切质粒pTGUS和质粒 pCDUTR，回收1.8kb的片段和载体，并将两者连接，连接产物转化大 肠杆菌DH5α，获得含有嵌合启动子、报告基因GUS和Ribusco大亚 基的3’-UTR表达盒的大肠杆菌克隆pCGR。
采用限制性内切酶Eco I和Not I酶切含有壮观霉素的抗性基 因aadA表达盒的质粒pPAP和质粒pCGR，回收载体和2.1kb片段并 将两者连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得含有嵌合启动子、 报告基因GUS和Ribusco大亚基的3’-UTR表达盒和壮观霉素的抗性 基因aadA表达盒的大肠杆菌克隆pPAPCGR。
采用限制性内切酶Xba I和Not I酶切质粒pPAPCGR回收3.8kb的 片段；采用限制性内切酶Spe I和Not I酶切含有叶绿体同源重组 片段质粒pTYAB，回收载体并与3.8kb的片段连接，连接产物转化大 肠杆菌DH5α，获得含有同源重组基因片断、壮观霉素的抗性基因 aadA表达盒和可调控表达的报告基因GUS表达盒的叶绿体转化载体 pIN-II。见图2用于烟草叶绿体转化的植物双元表达载体pIN-II结 构示意图。
通过农杆菌感染法，将含有pIN-I表达载体转化烟草，通过T-DNA 的插入将诱导元件整合到烟草核基因组中，通过抗生素的抗性筛选获 得转化植株，经过鉴定获得转基因植株。然后通过基因枪转化方法， 将pIN-II表达载体转化获得转基因植株通过雌性激素诱导，使诱导 复合体与细胞质中的Hsp90蛋白分离，通过叶绿体信号肽作用转运到 叶绿体中，与Gal4 DNA结合域结合，在VP16的激活下，启动报告 基因的表达；作用机制见图3诱导机制示意图。
附图说明
图1用于烟草核转化的植物双元表达载体pIN-I结构示意图
示意图说明：通过农杆菌感染的方法，经过载体上的T-DNA的插 入，将抗性基因表达盒和诱导元件表达盒整合到烟草的和基因组中， 通过抗生素卡那霉素的筛选获得转基因植株，在启动子35S的启动下 顺式调控元件可以被组成型表达。
图2用于烟草叶绿体转化的植物双元表达载体pIN-II结构示意 图。示意图说明：通过基因枪轰击的方法，经过载体上的与叶绿体基 因组同源的基因片段，通过同源重组将抗性筛选基因表达盒和诱导表 达的报告基因表达盒整合到整合到叶绿体基因组中，在雌二醇存在的 状态下Gal4∷VP16∷ER在叶绿体转运肽的作用下进入叶绿体，通过 Gal4结合到诱导启动子上游的Gal4结合域，在VP16的激活下启动 报告基因GUS的表达。
图3：诱导机制途径示意图。
示意图说明：在核中表达的调控元件Gal4∷VP16∷ER与细胞质 中的热激蛋白Hsp90结合，使转录激活域失活，阻抑了其与诱导启动 子上游结合域的结合，从而不能启动报告基因GUS表达；当加入化学 诱导物质雌二醇时，雌二醇可与调控元件Gal4∷VP16∷ER中的雌性 激素受体ER结合改变诱导元件构象，从而使其与热激蛋白HSP90分 离，在叶绿体转运肽的作用下进入叶绿体，通过Gal4结合到诱导启 动子上游的Gal4结合域，在VP16的激活下启动报告基因GUS的表达。
Estradiol，雌二醇；cytoplasm，细胞质；nucleus，细胞核；Hsp90， 热激蛋白90；chloroplast，叶绿体；GVER，Gal4∷VP16∷ER顺式 调控元件复合体；GBD，Gal4 Binding Domain，Gal4结合域。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施方式作出详细具体的描述：
1.实验材料
1.1烟草
烟草(Nicotiana tabacum cv科星一号)，为公共植物材料。
1.2菌株与质粒
大肠杆菌DH5α购自上海农科院生物中心基因工程实验室提供。
含有烟草叶绿体DNA的同源重组片段的质粒pTYAB和含有壮观霉 素抗性基因aadA表达盒的质粒pPAP由上海农科院生物中心基因工程 实验室提供，大肠杆菌载体pMD18-T购自日本TAKARA公司；pET30a 购自novagen公司，pBSK购自stratagene公司。
1.3引物、酶与试剂
PCR引物由上海博亚生物公司合成，详细序列信息见SEQ ID NO： 1-10；
限制性内切酶、Pfu DNA聚合酶、T4DNA连接酶等购自日本TAKARA 公司；
DNA凝胶回收试剂盒购自杭州V-gene生物技术公司；
山梨醇、甘油、各种氨基酸等生化试剂均为国产分析纯或进口分 装。
2.操作过程
2.1提取烟草总DNA
采用CTAB方法提取总DNA。
2.2PCR扩增
在无菌PCR管中加入：5μl 10×Pfu PCR缓冲液，5μl 2mM 4dNTPs，20μM上游及下游引物各1μl，模板DNA，5U Pfu DNA 聚合酶，加水至50μl总体积，最后加适量矿物油以防止蒸发。反 应条件如下：94℃，5min；94℃ 30sec，56℃ 30Sec，72℃ 2 min(退火温度及延伸时间根据引物及扩增产物长度不同作相应改 变)，30个循环；终延伸72℃ 10min。
反应结束后，在PCR体系中加入1U Taq DNA聚合酶，72℃ 1h。
2.3TBE-琼脂糖凝胶电泳和回收PCR产物
用1％琼脂糖凝胶(含10ng/ml EB)电泳分离PCR产物，电泳结 束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取含PCR产物的胶块，用DNA凝胶 回收试剂盒回收，PCR产物最终溶于20-30μl的洗脱缓冲液中。
2.4DNA连接反应
在无菌Eppendorf管中加入：1μl 10×T4DNA连接酶缓冲液， 8μl回收的PCR产物，0.25μl pMD18-T载体，1μl T4 DNA连 接酶，总体积为10μl。将各组分混匀，4℃中连接16h。当PCR 产物与载体DNA片段通过酶切形成的互补粘端相连时，两者之间的质 量比为5∶1。
2.5制备大肠杆菌感受态细胞
在LB平板上划线接种大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。用接种 环挑取10-12个单菌落(2-3mm直径)，接种于250mL的SOB培养 液中。振荡培养(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置 于冰上10min。离心(4℃，3000rpm，10min)，收集细胞。用80 ml预冷的TB溶液重悬细胞，冰浴10min。离心(4℃，3000rpm， 10min)，收集细胞。用20ml预冷的TB轻轻地重悬细胞，加入二甲 基亚砜(DMSO)至终浓度7％，轻轻混匀，置于冰上。10min后，按每 管500μl分装细胞悬液于无菌的1.5ml离心管中。用液氮快速冷 冻，储存于-70℃。
2.6DNA连接产物转化大肠杆菌
在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受态细胞与10μl 的DNA连接产物，手指轻弹管壁，混匀混合物。冰浴30min。42℃， 温育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC 培养液，37℃，剧烈振荡混合液1h。将混合液涂布在选择性培养 基上，37℃培养过夜。
2.7DNA序列分析
采用ABI377型测序仪(购自美国ABI公司)测定DNA序列，用 PCGENE软件分析序列，由上海博亚生物公司完成。
2.8小量制备质粒DNA
从培养基平板上挑取含目的质粒的单菌落，接种于3ml含相应 抗生素的LB液体培养基中，振荡培养过夜(37℃，200rpm，)。在 1.5ml离心管中，倒入1.5ml菌液，离心(4℃，13000rpm，30sec)， 倒去上清，收集菌体，将离心管倒扣在纸巾上，晾干管壁上的残余液 滴。加入100μl预冷的溶液I，剧烈震荡，悬浮菌体；加入200μl 新鲜的溶液II，将盖关闭，迅速颠倒5次，混匀混合物，注意不要 旋转离心管；加入150μl溶液III，将盖关闭，颠倒数次，使溶液 III均匀分散在粘稠的菌裂解液中，冰浴3-5min。离心(4℃，13000 rpm，5min)，将上清转移到新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇， 混匀，常温放置10min，离心(4℃，13000rpm，5min)，倒去上 清，加入1ml 70％乙醇，将盖关闭，颠倒数次，离心(4℃，13000 rpm，2min)。倒去上清，将离心管倒扣在纸巾上，室温放置数分钟， 待管壁上的残余乙醇液滴完全挥发，用30μl TE(pH8.0，含20 μg/ml无DNA酶污染的RNA酶A)溶解DNA沉淀，37℃保温30min， DNA保存于-20℃备用。
2.9限制性内切酶酶切DNA
酶切反应参照限制性内切酶试剂盒(购自TAKARA公司)说明书 中的具体操作进行。反应结束，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物， 回收操作与PCR产物回收相同。
2.10农杆菌介导的烟草的核转化
通过三亲杂交法将核表达的双元表达载体pIN-I转化入农杆菌 LB4404，方法参照(J Bacteriol 1984，158：1115-1121.)
转基因烟草通过农杆菌介导法转染叶盘，然后在抗生素卡那霉素 的筛选下获得抗性植株，通过PCR检测获得转基因植株。方法参照 (Science(1985)227：1229-1232)
2.11烟草叶绿体转化---基因枪法
核转化的转基因植株通过基因枪法实行叶绿体的转化，方法参照 (Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917) 这样使烟草和基因组中含有35S∷SSUTP∷GVER∷Tnos的同时其叶绿 体基因组中含有6*Gal4BD-miniPrrn∷GUS∷TrbcL.
用包裹有pIN-II质粒DNA的直径为1.0um的金粉，采用基因枪 Bio-Rad PDS 1000/He进行轰击放置在ROMP培养基(MS盐，加上 0.2M/L山梨醇和0.2M/L的甘露醇，30g/L的蔗糖，0.7％琼脂，PH5.8) 上的成熟的pIN-I核转化的转基因植株叶片，轰击压力：1,100psi； 轰击距离：9cm.轰击后的叶片移至到MS培养基上(MS盐，30g/L的 蔗糖，0.7％琼脂，PH5.8)光培养4天后，将叶片剪成5mm见方的小块 放置到上选培养基(MS盐，1.5mg/L 6BA，0.15mg/L IAA，500mg/L壮 观霉素30g/L的蔗糖，0.7％琼脂，PH5.8)上进行分化培养，每2周 更换一次分化培养基；待长出绿色小苗时，移栽至生根培养基(MS盐， 500mg/L壮观霉素30g/L的蔗糖，0.7％琼脂，PH5.8)上进行生根培 养。
序列表
<110>上海市瑞丰农业科技有限公司
张大兵，钱炳俊，贾军伟，武爱波，潘爱虎，王荣谈
<120>一种可调控表达的叶绿体转基因表达载体的构建
<130>技术专利
<160>序列数量：16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>烟草
<400>1
aaagatatca tattggaagt taaaggaaaa g 31
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>烟草
<400>2
aaaactagtg tacttcttct tgttaattgg 30
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>酵母
<400>3
aaaactagtg gaggaatgaa gctactgtct tctatc 36
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>酵母
<400>4
aaagcggccg cttattatgg atccccaccg tactcgtc 38
<210>5
<211>958
<212>DNA
<213>动物
<400>5
ggatccgtct gctggagaca tgagagctgc caacctttgg ccaagcccgc tcatgatcaa 60
acgctctaag aagaacagcc tggccttgtc cctgacggcc gaccagatgg tcagtgcctt 120
gttggatgct gagcccccca tactctattc cgagtatgat cctaccagac ccttcagtga 180
agcttcgatg atgggcttac tgaccaacct ggcagacagg gagctggttc acatgatcaa 240
ctgggcgaag agggtgccag gctttgtgga tttgaccctc catgatcagg tccaccttct 300
agaatgtgcc tggctagaga tcctgatgat tggtctcgtc tggcgctcca tggagcaccc 360
agtgaagcta ctgtttgctc ctaacttgct cttggacagg aaccagggaa aatgtgtaga 420
gggcatggtg gagatcttcg acatgctgct ggctacatca tctcggttcc gcatgatgaa 480
tctgcaggga gaggagtttg tgtgcctcaa atctattatt ttgcttaatt ctggagtgta 540
cacatttctg tccagcaccc tgaagtctct ggaagagaag gaccatatcc accgagtcct 600
ggacaagatc acagacactt tgatccacct gatggccaag gcaggcctga ccctgcagca 660
gcagcaccag cggctggccc agctcctcct catcctctcc cacatcaggc acatgagtaa 720
caaaggcatg gagcatctgt acagcatgaa gtgcaagaac gtggtgcccc tctatgacct 780
gctgctggag atgctggacg cccaccgcct acatgcgccc actagccgtg gaggggcatc 840
cgtggaggag acggaccaaa gccacttggc cactgcgggc tctacttcat cgcattcctt 900
gcaaaagtat tacatcacgg gggaggcaga gggtttccct gccacagtct gagagctc 958
<210>6
<211>93
<212>DNA
<213>人工构建
<400>6
aaaagcttcg gagtactgtc ctccgccgga gtactgtcct ccgtcggagt actgtcctcc 60
gacggagtac tgtcctccgt tgagggggca ggg 93
<210>7
<211>93
<212>DNA
<213>人工构建
<400>7
ttggatcctc cctacaactg tatccaagcg cttcgtattc gcccggagtt cgctcccaga 60
aatatagcca tccctgcccc ctcaacggag gac 93
<210>8
<211>160
<212>DNA
<213>人工构建
<400>8
aagcttcgga gtactgtcct ccgccggagt actgtcctcc gtcggagtac tgtcctccga 60
cggagtactg tcctccgttg agggggcagg gatggctata tttctgggag cgaactccgg 120
gcgaatacga agcgcttgga tacagttgta gggaggatcc 160
<210>9
<211>372
<212>DNA
<213>烟草
<220>
<221>内含子
<222>(243)..(336)
<400>9
gatatcatat tggaagttaa aggaaaagag agaaagagaa atctttctgt ctaagtgtaa 60
ttaacaatgg cttcctcagt tctttcctct gcagcagttg ccacccgcag caatgttgct 120
caagctaaca tggttgcacc tttcactggc cttaagtcag ctgcctcatt ccctgtttca 180
aggaagcaaa accttgacat cacttccatt gccagcaacg gcggaagagt gcaatgcatg 240
caggtaattt atatacaatg acagtgcaaa aaattttgat acaattaatg catcttaaca 300
tgtcatagct aaaaattcta ttttggtgga atataggtgt ggccaccaat taacaagaag 360
aagtacacta gt 372
<210>10
<211>1500
<212>DNA
<213>人工构建
<400>10
actagtggag gaatgaagct actgtcttct atcgaacaag catgcgatat ttgccgactt 60
aaaaagctca agtgctccaa agaaaaaccg aagtgcgcca agtgtctgaa gaacaactgg 120
gagtgtcgct actctcccaa aaccaaaagg tctccgctga ctagggcaca tctgacagaa 180
gtggaatcaa ggctagaaag actggaacag ctatttctac tgatttttcc tcgagaagac 240
cttgacatga ttttgaaaat ggattcttta caggatataa aagcattgtt aacactgcca 300
ggctctagag cccccccgac cgatgtcagc ctgggggacg agctccactt agacggcgag 360
gacgtggcga tggcgcatgc cgacgcgcta gacgatttcg atctggacat gttgggggac 420
ggggattccc cgggtccggg atttaccccc cacgactccg ccccctacgg cgctctggat 480
atggccgact tcgagtttga gcagatgttt accgatgccc ttggaattga cgagtacggt 540
ggggatccgt ctgctggaga catgagagct gccaaccttt ggccaagccc gctcatgatc 600
aaacgctcta agaagaacag cctggccttg tccctgacgg ccgaccagat ggtcagtgcc 660
ttgttggatg ctgagccccc catactctat tccgagtatg atcctaccag acccttcagt 720
gaagcttcga tgatgggctt actgaccaac ctggcagaca gggagctggt tcacatgatc 780
aactgggcga agagggtgcc aggctttgtg gatttgaccc tccatgatca ggtccacctt 840
ctagaatgtg cctggctaga gatcctgatg attggtctcg tctggcgctc catggagcac 900
ccagtgaagc tactgtttgc tcctaacttg ctcttggaca ggaaccaggg aaaatgtgta 960
gagggcatgg tggagatctt cgacatgctg ctggctacat catctcggtt ccgcatgatg 1020
aatctgcagg gagaggagtt tgtgtgcctc aaatctatta ttttgcttaa ttctggagtg 1080
tacacatttc tgtccagcac cctgaagtct ctggaagaga aggaccatat ccaccgagtc 1140
ctggacaaga tcacagacac tttgatccac ctgatggcca aggcaggcct gaccctgcag 1200
cagcagcacc agcggctggc ccagctcctc ctcatcctct cccacatcag gcacatgagt 1260
aacaaaggca tggagcatct gtacagcatg aagtgcaaga acgtggtgcc cctctatgac 1320
ctgctgctgg agatgctgga cgcccaccgc ctacatgcgc ccactagccg tggaggggca 1380
tccgtggagg agacggacca aagccacttg gccactgcgg gctctacttc atcgcattcc 1440
ttgcaaaagt attacatcac gggggaggca gagggtttcc ctgccacagt ctgagagctc 1500
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>烟草
<400>11
aaagagctca aacagtagac attagcagat 30
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>烟草
<400>12
aaagcggccg cgtattcggc tcaatccttt ta 32
<210>13
<211>161
<212>DNA
<213>烟草
<400>13
aaagagctca aacagtagac attagcagat aaattagcag gaaataaaga aggataagga 60
gaaagaactc aagtaattat ccttcgttct cttaattgaa ttgcaattaa actcggccca 120
atcttttact aaaaggattg agccgaatac gcggccgcaa a 161
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>质粒pBI121
<400>14
aaaaggatcc agtcatgtta cgtcctgtag aaac 34
<210>15
<211>34
<212>DNA
<213>质粒pBI121
<400>15
ttttgagctc ttatcattgt ttgcctccct gctg 34
<210>16
<211>1839
<212>DNA
<213>质粒pBI121
<400>16
aaaaggatcc agtcatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc aaaaaactcg 60
acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattgatcag cgttggtggg 120
aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac gatcagttcg 180
ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa gtctttatac 240
cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact cattacggca 300
aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg ccatttgaag 360
ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg tatcaccgtt tgtgtgaaca 420
acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga 480
aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc 540
tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag 600
actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac 660
tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag 720
tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag 780
ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag 840
tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc 900
atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg 960
cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag 1020
agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg 1080
gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca 1140
gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga 1200
tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata 1260
cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg cgtaaactcg 1320
acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca 1380
tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat gtccaaagcg 1440
gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg caggagaaac 1500
tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg ctgcactcaa 1560
tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg 1620
tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc gattttgcga 1680
cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact cgcgaccgca 1740
aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac ttcggtgaaa 1800
aaccgcagca gggaggcaaa caatgataag agctcaaaa 1839