可表达和分泌-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒及其构建方法与应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101033471 B (45)授权公告日 2011.06.08 CN 101033471 B *CN101033471B* (21)申请号 200710048430.0 (22)申请日 2007.02.08 C12N 15/63(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 1/21(2006.01) (73)专利权人 四川大学 地址 610065 四川省成都市一环路南一段 24 号 (72)发明人 汪川 张朝武 刘衡川 余倩 许欣 裴晓方 王国庆 林怡伶 (74)专利代理机构 成都科海专利事务有限责任 公司 51202 代理人 黄幼陵 WO 。

2、0005394 A1,2000.02.03, 全文 . CN 1844376 A,2006.10.11, 全文 . 汪川， 等 . 表达型质粒载体 pMG36e 在 宿主菌中的遗传稳定性研究 . 卫生研究 2 214.2005,2(214),214-216. 登录号 ： M23530.1.Genbank.1-3. Maarten, 等 .distance-dependent translational coupling and interference inlactococcus lactis.Mol Gen Gene 227.1991,(227),65-71. (54) 发明名称 可表达和分。

3、泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆 菌 - 乳酸菌穿梭质粒及其构建方法与应用 (57) 摘要 一种可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆 菌 - 乳酸菌穿梭质粒， 所含基因由编码 - 半乳 糖苷酶的基因及该基因上游含 SD 位点的调控序 列组成。实验证明， 上述重组质粒可转化乳酸乳 球菌， 在大肠杆菌和乳酸乳球菌中高效表达非融 合-半乳糖苷酶， 在-半乳糖苷酶制备和构建 可表达 - 半乳糖苷酶的乳酸菌株中应用。构建 方法包括以下步骤 ： 以德氏乳杆菌保加利亚亚种 基因组 DNA 为模板， 扩增得到含上游调控序列的 -半乳糖苷酶基因 ； 将上述扩增得到的-半乳 糖苷酶基因双酶切后与用同种酶双酶切并去磷酸 。

4、化的载体连接并转化感受态大肠杆菌 ； 筛选阳性 大肠杆菌， 提取阳性大肠杆菌中重组质粒酶切鉴 定并对插入序列进行测序。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘玉玲 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 17 页 附图 6 页 CN 101033471 B1/1 页 2 1. 一种可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒， 其特征在于所含 基因由编码 - 半乳糖苷酶的基因及该基因上游含 SD 位点的调控序列组成， 为序列表中 SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列， 以质粒pMG36e为载体， 序列表中SEQ ID N。

5、O.3所述的核苷 酸序列在载体 pMG36e 上的插入位点是 Pst I、 Xba I。 2.一种权利要求1所述的可表达和分泌-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒 的构建方法， 其特征在于包括以下步骤 ： (1)以德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组DNA为模板， 扩增得到含上游调控序列的-半 乳糖苷酶基因 ； (2) 将上述扩增得到的 - 半乳糖苷酶基因用 Pst I、 Xba I 双酶切后与用同种酶双酶 切并去磷酸化的载体连接并转化感受态大肠杆菌， 所述载体为 pMG36e ； (3) 筛选阳性大肠杆菌， 提取阳性大肠杆菌中重组质粒酶切鉴定并对插入序列进行测 序。 3.权利要求1所述的可表达和分。

6、泌-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒在制 备 - 半乳糖苷酶中的应用。 4.权利要求1所述的可表达和分泌-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒在构 建可表达 - 半乳糖苷酶的乳酸菌株中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101033471 B1/17 页 3 可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质 粒及其构建方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种可表达和分泌-半乳糖苷酶的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒及其 构建方法与应用。 背景技术 0002 - 半乳糖苷酶 ( 乳糖酶 ) 因其能催化乳糖生成半乳糖和葡萄糖而在工业和医药 领域都具有非常重要的用途。纯化的 - 半乳糖苷酶。

7、在工业生产上可用于乳品加工生产低 乳糖牛奶， 在医药领域可用于治疗乳糖不耐受症等。 另一方面， 一些细菌如德氏乳杆菌保加 利亚亚种、 嗜酸乳杆菌等因能产生 - 半乳糖苷酶而使它们具有特定的实用价值。例如乳 酸菌等益生菌因能产生 - 半乳糖苷酶而使其可用于制备缓解乳糖不耐症的益生菌制剂 ； 德氏乳杆菌保加利亚亚种、 嗜酸乳杆菌在发酵制作酸奶的过程中， 将依靠其产生的 - 半 乳糖苷酶分解奶中的乳糖。 0003 一些细菌、 酵母菌和霉菌可产生 - 半乳糖苷酶。与酵母菌和霉菌相比， 细菌的 - 半乳糖苷酶产量虽较低， 但它们具有酵母菌和霉菌无法比拟的一些优点。大肠杆菌很 容易培养和保存， 遗传背景清。

8、楚， 是目前首选的基因工程宿主菌株 ； 乳酸菌具有公认的安全 性， 常用于发酵酸奶， 是人体肠道的正常菌群， 对人体具有许多非常重要的益生作用。 因此， 提高大肠杆菌和乳酸菌等细菌的 - 半乳糖苷酶产量将大大提高这类细菌在工业酶生产 和食品发酵、 医疗保健领域的应用价值。 0004 常用的提高菌种产酶量的方法包括诱变筛选育种和基因工程技术。采用诱变的 方法筛选高产酶菌株具有工作量大、 菌株易变异、 需大量诱导物、 酶活提高率小等缺点， 而 基因工程技术则具有操作简便、 蛋白表达量高、 性能稳定的优点。现在已有研究者采用基 因工程技术构建高产 - 半乳糖苷酶的菌株， 如陈卫等构建的表达嗜热脂肪芽。

9、孢杆菌耐 热 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌表达质粒和大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒， 能在大 肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达耐热 - 半乳糖苷酶， 其酶活性分别为 1.35U/ml 和 0.32U/ mg( 陈卫， 葛佳佳， 张灏， 丁霄霖 . 半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及 IPTG 诱导条 件 . 无锡轻工大学学报， 2002， 21(5) ： 492-495 ； 张灏， 夏雨， 傅晓燕， 陈卫， 丁霄霖 . 耐热 -半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢杆菌中的整合表达.无锡轻工大学学报， 2003， 22(6) ： 1-4， 14)。但这些质粒具有以下一些不足 ： 表达产生的 - 半乳。

10、糖苷酶为融合蛋白， 即表 达的蛋白 N 端融合有来自于载体的一段多肽， 这可能改变蛋白的三维结构， 影响蛋白活性 基团的形成从而使酶活性降低 ； 表达的 - 半乳糖苷酶产量不高， 这将直接影响其应用 ； 表达的 - 半乳糖苷酶不具有分泌性， 不利于工业制备酶产品， 另外， 表达的 - 半乳糖 苷酶不能分泌也会影响活菌直接发挥酶水解作用 ； 不能在乳酸菌中表达。乳酸乳球菌等 乳酸菌在食品发酵工业上已有上千年的应用史， 近年来， 乳酸菌的益生作用也受到了越来 越广泛的重视。由于具有公认安全性， 来源于乳酸菌的 - 半乳糖苷酶可不经过精制而直 接应用。另外， 具有高活性 - 半乳糖苷酶的乳酸菌将具有。

11、更好的发酵酸奶的能力， 如果作 说 明 书 CN 101033471 B2/17 页 4 为益生菌， 则具有更强的缓解乳糖不耐受的能力， 这些都是大肠杆菌和枯草芽孢杆菌不具 备的优点。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种可表达和分泌 - 半乳糖苷酶 的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒， 此种质粒不仅能在大肠杆菌中高效表达非融合 - 半乳糖 苷酶， 而且能在乳酸乳球菌中高效表达和分泌非融合 - 半乳糖苷酶 ； 本发明的再一目的 是提供上述质粒的构建方法 ； 本发明的又一目的是提供上述质粒的应用。 0006 本发明所述可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿。

12、梭质粒， 其 所含基因由编码 - 半乳糖苷酶的基因 ( 见序列表中 SEQ ID NO.2) 及该基因上游含 SD 位点的调控序列 ( 见序列表中 SEQIDNO.1) 组成， 为序列表中 SEQIDNO.3 所述的核 苷酸序列。其载体为 pMG36e(Van de GM， Van der VJM， Kok， J， et al.Construction of a lactococcalexpression vector ： expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp.lactis.Appl Environ M。

13、icrobiol， 1989， 55(1) ： 224 228.) 及其他一些大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭表达质粒。 0007 本发明通过实验证明， 上述重组质粒可转化乳酸乳球菌， 在大肠杆菌中高效表达 非融合-半乳糖苷酶， 在乳酸乳球菌中高效表达和分泌非融合-半乳糖苷酶， 因此可在 - 半乳糖苷酶制备和构建可表达 - 半乳糖苷酶的乳酸菌株中应用。 0008 本发明所述可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒， 其构建 方法包括以下步骤 ： 0009 (1) 以德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组 DNA 为模板， 扩增得到含上游调控序列的 - 半乳糖苷酶基因 ； 0010 (2) 将上。

14、述扩增得到的 - 半乳糖苷酶基因用 PstI、 XbaI 双酶切后与用同种酶双 酶切并去磷酸化的载体连接并转化感受态大肠杆菌 ； 0011 (3) 筛选阳性大肠杆菌， 提取阳性大肠杆菌中重组质粒酶切鉴定并对插入序列进 行测序。 0012 本发明具有以下有益效果 ： 0013 (1) 表达的 - 半乳糖苷酶为非融合蛋白。本发明采用非融合表达技术构建表达 质粒， 在扩增的德氏乳杆菌保加利亚亚种 - 半乳糖苷酶基因阅读框 (SEQ ID NO.2) 上游 加入一段含 SD 位点的调控序列 (SEQ ID NO.1)， 实现了载体小肽和目的蛋白的分离。实施 例 5 表明， 本发明所述重组质粒确能在大肠。

15、杆菌和乳酸乳球菌中表达非融合的 - 半乳糖 苷酶。 0014 (2)可在大肠杆菌和乳酸乳球菌中穿梭表达。 实施例3和实施例4表明， 本发明所 述重组质粒能在大肠杆菌和乳酸乳球菌中表达具有活性的 - 半乳糖苷酶。由于能应用于 乳酸乳球菌等乳酸菌， 因而本发明构建的穿梭质粒具有更直接和广泛的应用价值。 0015 (3)表达的-半乳糖苷酶酶活性高。 实施例6表明， 携带本发明所述质粒的大肠 杆菌和乳酸乳球菌均能表达高活性的 - 半乳糖苷酶， 酶活性与基因初始菌相比均有成倍 增加。携带本发明所述质粒的大肠杆菌 - 半乳糖苷酶活性可达到 4.755U/ml， 为基因初 始菌的 11.86 倍 ； 携带本。

16、发明所述质粒的乳酸乳球菌 - 半乳糖苷酶活性可达到 1.578U/ 说 明 书 CN 101033471 B3/17 页 5 ml， 为基因初始菌株的 3.94 倍 ； 高于陈卫等构建的表达嗜热脂肪芽孢杆菌耐热 - 半乳糖 苷酶的大肠杆菌 T7 表达系统表达的 - 半乳糖苷酶活性 ( 陈卫， 葛佳佳， 张灏， 丁霄霖 . 半 乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及 IPTG 诱导条件 . 无锡轻工大学学报， 2002， 21(5) ： 492-495)。 0016 (4) 在乳酸乳球菌中表达的 - 半乳糖苷酶具有分泌性。细菌产生的 - 半乳 糖苷酶为胞内酶， 不具有分泌性。与胞外酶相比， 工业制备。

17、胞内酶产品难度较大， 细菌胞内 的 - 半乳糖苷酶活性也较难发挥。实施例 7 表明， 本发明所述质粒在乳酸乳球菌中表 达的 - 半乳糖苷酶能部分分泌到胞外， 其分泌率最高可达 27.1， 显著高于基因初始菌 (3 )。这将大大降低酶产品制备的难度， 有利于细菌发挥其 - 半乳糖苷酶活性。 附图说明 0017 图 1 为本发明所述可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒 (pMG36e-lacZ) 的一种结构图谱 ； 0018 图 2 为构建本发明所述可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质 粒 (pMG36e-lacZ) 的技术路线图。 0019 图 3 为提。

18、取的德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳结果， 在 10kb 处有一明显的 DNA 条带， 表明德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组 DNA 提取成功， 图中泳 道 1， 2 为德氏乳杆菌保加利亚亚种基因组 DNA， 泳道 3 为 DNAmarkerVI。 0020 图4为PCR扩增德氏乳杆菌保加利亚亚种-半乳糖苷酶基因片段(SEQ ID NO.3) 的琼脂糖凝胶电泳结果， 在约 3.0kb 处有一条特异条带， 表明扩增成功， 图中泳道 1， 2 为德 氏乳杆菌保加利亚亚种 - 半乳糖苷酶基因片段 PCR 反应液， 泳道 3 为 DNA 500bpladder。 0021 图 5 为。

19、质粒载体 pMG36e 双酶切和去磷酸化的琼脂糖凝胶电泳结果， 在约 3.6kb 处 出现一条条带， 与预期产物大小相符， 图中泳道1为双酶切并去磷酸化的pMG36e质粒， 泳道 2 为 pMG36e 质粒 PstI、 XbaI 双酶切后纯化产物， 泳道 3， 4 为 pMG36e 质粒 PstI、 Xba I 双酶 切反应液， 泳道 5 为 500bp DNAladder。 0022 图 6 为本发明所述可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒 (pMG36e-lacZ) 转化大肠杆菌的平板筛选结果， 阳性大肠杆菌生长为蓝色菌落， 表明本发明 所述质粒转化大肠杆菌成功， 阳。

20、性大肠杆菌具有 - 半乳糖苷酶活性， 图中箭头所指即为 阳性大肠杆菌。 0023 图 7 为本发明所述可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒 (pMG36e-lacZ) 及其 Pst I、 Xba I 双酶切的琼脂糖凝胶电泳结果， 在约 3.0kb 和 3.6kb 处出现两条条带， 与预期产物大小相符， 表明扩增的 - 半乳糖苷酶基因片段已插入载体 pMG36e， 重组质粒构建成功， 图中泳道 1 为 DNA markerVI， 泳道 2 为重组质粒 pMG36e-lacZ， 泳道 3 为 pMG36e-lacZ Pst I、 Xba I 双酶切反应液， 泳道 4 为 50。

21、0bp DNAladder。 0024 图 8 为本发明所述可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒 (pMG36e-lacZ) 的测序图。 0025 图 9 为本发明所述质粒 pMG36e-lacZ 中插入的 - 半乳糖苷酶基因片段序列与 L.delbrueckii bulgaricus beta-galactosidase gene(Genbank序列号 ： GI ： 149546)比对 结果， pMG36e-lacZ 中插入的外源基因序列与 Genbank 中德氏乳杆菌保加利亚亚种 - 半 说 明 书 CN 101033471 B4/17 页 6 乳糖苷酶基因标准序列相。

22、比， 符合率为 99.5 ( 按 1 个反应保真长度为 800bp 计 )， 表明重 组质粒构建成功， 图中第 1 条 DNA 是 pMG36e-lacZ 中插入的 - 半乳糖苷酶基因片段序列， 第 2 条 DNA 是 L.delbrueckii bulgaricus beta-galactosidase gene， () 内数字为第 1 条 DNA 碱基数， 内数字为第 2 条 DNA 碱基数。 0026 图10为从携带重组质粒的大肠杆菌E.coli DH5/pMG36e-lacZ中提取的重组质 粒 pMG36e-lacZ 的琼脂糖凝胶电泳结果， 图中泳道 1 为 500bp DNAladd。

23、er， 泳道 2 为重组质 粒 pMG36e-lacZ。 0027 图 11 为本发明所述可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒 (pMG36e-lacZ) 转化乳酸乳球菌的平板筛选结果， 阳性乳酸乳球菌生长为蓝色菌落， 表明重 组质粒转化乳酸乳球菌成功， 阳性乳酸乳球菌具有 - 半乳糖苷酶活性， 图中箭头所指即 为阳性乳酸乳球菌。 0028 图 12 为 PCR 扩增本发明所述重组质粒 pMG36e-lacZ 中的 - 半乳糖苷酶基 因片段的琼脂糖凝胶电泳结果， 可见扩增得到了长度约为 3.0kb 的特异条带， 与预期相 符， 表明 pMG36e-lacZ 已成功电转化乳。

24、酸乳球菌， 图中泳道 1 为 PCR 扩增结果， 泳道 2 为 DNAmarkerIII。 0029 图 13 为携带本发明所述重组质粒 pMG36e-lacZ 的大肠杆菌 - 半乳糖苷酶活性 测定结果， - 半乳糖苷酶能催化底物 ONPG 水解产生亮黄色的产物ONP， 使反应液颜 色变为亮黄色， 在相同条件下反应液颜色越深表明酶活性越大， 结果表明携带本发明所述 重组质粒的大肠杆菌超声破壁液中含有 - 半乳糖苷酶， E.coliDH5 超声破壁液中不含 -半乳糖苷酶， 图中1， 2为携带重组质粒的大肠杆菌DH5， 3为大肠杆菌DH5， 4为空白 对照。 0030 图 14 为携带本发明所述重。

25、组质粒 pMG36e-lacZ 的乳酸乳球菌 - 半乳糖苷酶活 性测定结果， 结果表明携带本发明所述重组质粒的乳酸乳球菌超声破壁液中含有 - 半乳 糖苷酶， L.lactis 超声破壁液中不含 - 半乳糖苷酶， 图中 1 为携带重组质粒的乳酸乳球 菌， 2 为 L.lactis， 3 为空白对照。 0031 图 15 为表达非融合 - 半乳糖苷酶的本发明所述重组质粒 pMG36e-lacZ 的翻译 偶联调控片段各元件组成， ATG 为载体来源起始密码， ATG 为非融合蛋白来源起始密码， TGA 示载体来源小肽的终止密码 ； 载体来源小肽密码子以阿拉伯数字标出， 非融合蛋白 密码子以带括弧的阿。

26、拉伯数字标出， 加有双底线的序列为 SEQ ID NO.1 中的 SD 序列， 加有 波浪线的序列为 Xba I 酶切位点。 0032 图 16 为携带本发明所述重组质粒 pMG36e-lacZ 的乳酸乳球菌粗酶液和上清液 - 半乳糖苷酶活性测定结果， 结果可见粗酶液和上清液中均有明显的 - 半乳糖苷酶活 性， 图中 1 为粗酶液酶促反应结果， 2 为上清液酶促反应结果， 3 为空白对照。 具体实施方式 0033 本发明下述实施例中 ： 德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株可购买于中国普通微生物菌 种保藏管理中心， 或分离自活菌发酵酸奶， 分离方法见 酸奶中保加利亚乳杆菌分离条件的 优化 ( 汪川， 张。

27、朝武， 余倩 . 中国微生态学杂志， 2001， 13(2) ： 73-74， 80)。大肠杆菌 DH5 购买于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司。乳酸乳球菌菌种可购买于中国普通微生物菌种保 说 明 书 CN 101033471 B5/17 页 7 藏管理中心。所用各种分子生物学工具酶和试剂盒购买于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 和宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司。引物合成和基因测序由 Invitrogen 上海公司完成。 0034 实施例 1 ： 可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的大肠杆菌 - 乳酸菌穿梭质粒的构建 0035 本实施例及后续各实施例中， 将可表达和分泌 - 半乳糖苷酶的。

28、大肠杆菌 - 乳酸 菌穿梭质粒命名为 pMG36e-lacZ。其构建方法的步骤如下 ： 0036 (1) 扩增德氏乳杆菌保加利亚亚种 - 半乳糖苷酶基因片段 (SEQ ID NO.3) 0037 将德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种从 -20冰箱取出， 37水浴融化后划线 MRS 平 板， 于 37培养 48h， 挑菌落转种 5ml MRS 肉汤， 37培养 24h， 用小量细菌基因组 DNA 抽提 试剂盒抽提基因组 DNA 作为模板， 抽提产物经 0.8琼脂糖凝胶电泳检查， 阳性结果在 10kb 处有一明显的条带 ( 见图 3)。设计合成上下游引物， 上游引物 lacZfl ： 5 -GCGTCTA。

29、GA GAAGGGAAGAATTAGAAAATGA-3 ， 下游引物 lacZrl ： 5 -GCGCTGCAGTTATTTTAGTAAAAGGGGCTGA -3 。按表 1 加样， PCR 扩增德氏乳杆菌保加利亚亚种 - 半乳糖苷酶基因片段， PCR 产物经 0.8琼脂糖凝胶电泳后， 在 3.0kb 处可得到一条特异条带 ( 见图 4)。制备 0.8琼脂糖凝 胶， 将 300l PCR 反应液全部上样电泳， 在紫外灯下切下含 - 半乳糖苷酶基因片段的凝 胶， 用 Gel Extraction Kit 回收纯化成 30l。 0038 表 1 PCR 扩增 - 半乳糖苷酶基因片段 0039 00。

30、40 (2)- 半乳糖苷酶基因片段 Pst I、 Xba I 双酶切及酶切产物纯化取无菌 1.5ml EP 管， 按表 2 加样， 对纯化的基因片段进行 Pst I、 Xba I 双酶切。表 2- 半乳糖苷酶基因 片段 Pst I、 Xba I 双酶切体系表 说 明 书 CN 101033471 B6/17 页 8 0041 0042 瞬时离心使各成分集中于管底， 于 37水浴反应 4h。将全部酶切反应液用 Cycle-Pure kit 纯化成 30l。 0043 (3)pMG36e 质粒的提取 0044 E.coli DH5/pMG36e 菌种从 -20冰箱取出， 37水浴融化后划线含红霉素。

31、 300g/ml的LB平板(以下简称LB-Ery平板)， 于37培养24h。 挑单菌落接种5ml含红霉 素 300g/ml 的 LB 肉汤 ( 以下简称 LB-Ery 肉汤 )， 37 220r/min 振荡培养 12 16h。吸 取 1.5ml 肉汤于 1.5ml EP 管中， 12000r/min 离心 1min 收集细菌， 用 Plasmid Miniprepkit 提取 pMG36e 质粒。 0045 (4) 质粒 pMG36e Pst I、 Xba I 双酶切及酶切产物纯化 0046 取无菌 1.5ml EP 管， 按表 3 加样， 对提取的 pMG36e 进行 Pst I、 Xba。

32、 I 双酶切。瞬 时离心使各成分集中于管底， 于 37水浴反应 4h。将全部酶切反应液用 Cycle-Pure kit 纯化成 30l。酶切产物经 0.8琼脂糖凝胶电泳后在约 3.6kb 处出现一条条带， 与预期相 符 ( 见图 5)。 0047 表 3pMG36e Pst I、 Xba I 双酶切体系表 0048 0049 (5) 双酶切后的 pMG36e 去磷酸化 0050 取无菌 1.5ml EP 管， 按表 4 加样， 对双酶切后的 pMG36e 去磷酸化。 0051 表 4 双酶切后的 pMG36e 去磷酸化反应体系表 0052 说 明 书 CN 101033471 B7/17 页 。

33、9 0053 瞬时离心使各成分集中于管底， 于 50水浴反应 30min。将全部反应液用 Cycle-Purekit 纯化成 30l。pMG36e 双酶切后去磷酸化产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图 5。 0054 (6) 感受态大肠杆菌 DH5 的制备 0055 从 -20冰箱取出大肠杆菌 DH5 菌种， 置 37水浴融化后， 吸 50 100l 菌种 液于 5ml LB 肉汤， 37 220r/min 培养 12 16h。吸 1ml 菌液于预热的 100ml LB 肉汤培 养瓶中， 37 220r/min 培养至 A600 0.35 左右， 停止培养。将菌液转移至两支无菌、 预冷 的 50ml 。

34、聚丙烯离心管中 (40ml 菌液 / 管 )， 于冰上放置 10min， 4 4000r/min 离心 7min， 弃 上清。将管倒置 1min 使最后的痕量培养液流尽。离心管中加入预冷的 0.1mol/L CaCl2溶 液 7ml 重悬菌沉淀， 4 4000r/min 离心 7min， 弃上清。将管倒置 1min 使最后的痕量培养 液流尽。离心管中加入预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液 10ml 重悬菌沉淀， 于冰上放置 30min。 44000r/min离心7min， 弃上清， 将管倒置1min使最后的痕量培养液流尽。 离心管中加入 预冷的 CaCl2冻存液 1.6ml 重悬菌沉淀，。

35、 分装预冷 EP 管 (100l/ 管 )， 立即于 -70保存 备用。 0056 (7)- 半乳糖苷酶基因片段与 pMG36e 连接、 转化感受态大肠杆菌 DH5 0057 取无菌 100l PCR 反应管， 按表 5 加样进行连接反应。 0058 表 5- 半乳糖苷酶基因片段与 pMG36e 连接 0059 0060 瞬时离心使各成分集中于管底， 于 16连接 3h， 22连接 1h。 0061 用预冷枪头吸 5l 连接反应液于预冷 100l 感受态大肠杆菌 DH5 中， 用手指 轻弹管底使液体混合均匀， 置冰浴 30min， 42水浴 90s， 冰浴 3min。加入 800l 37预热 。

36、的 SOC 培养基， 于 37 160r/min 培养 1h， 12000r/min 离心数 s， 弃 700l 上清。用枪头轻 轻吹散菌沉淀， 取 150l 菌液于含红霉素 300g/ml， X-gal 40g/ml 的 LB 平板 ( 以下简 称LB-Ery-X-gal平板)中央， 用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板， 于37培养4872h。 阳性菌生长为蓝色菌落 ( 见图 6)。 0062 (8) 阳性克隆的鉴定 0063 提取重组质粒进行酶切鉴定 0064 阳性克隆接种 LB-Ery 肉汤， 37 220r/min 振荡培养 12 16h。使用 Plasmid Miniprepkit， 。

37、按说明书操作说明， 收集2.5ml肉汤中细菌于1.5ml EP管中， 提取重组质粒。 重组质粒用 Pst I、 Xba I 双酶切， 酶切反应体系见表 6。瞬时离心使各成分集中于管底， 于 37水浴反应4h。 0.8琼脂糖凝胶电泳检查酶切片段， 结果在约3.0kb和3.6kb处出现两 条条带 ( 见图 7)， 表明 - 半乳糖苷酶基因片段已插入载体， 重组质粒鉴定合格。表 6 重组 说 明 书 CN 101033471 B8/17 页 10 质粒 Pst I、 Xba I 双酶切体系表 0065 0066 重组质粒测序 0067 阳性克隆交Invitrogen上海公司， 由该公司对重组质粒中插。

38、入的-半乳糖苷酶 基因片段进行测序。以上游引物 lacZf1 为测序引物， 进行 1 个反应， 结果见图 8， 图 9。测 序结果表明， pMG36e-lacZ 中插入的外源基因序列与 genebank 中德氏乳杆菌保加利亚亚种 - 半乳糖苷酶基因标准序列相比， 符合率分别为 99.5 ( 按 1 个反应保真长度为 800bp 计 )。表明 - 半乳糖苷酶基因片段已插入载体， 重组质粒鉴定合格。 0068 (9) 重组质粒的提取和保存 0069 经酶切和测序鉴定合格的重组质粒可保存于 -20环境中 ； 携带有鉴定合格的 重组质粒的大肠杆菌 DH5( 以下简称 E.coli DH5/pMG36e。

39、-lacZ) 菌种可于 -20保存 或 -70长期保存， 必要时可将其复苏培养后再从其中提取重组质粒 ( 见图 10)。 0070 实施例 2 ： 重组质粒 pMG36e-lacZ 电转化乳酸乳球菌 0071 (1) 电转化用乳酸乳球菌细胞的制备 0072 从 -20冰箱取出乳酸乳球菌菌种， 于 37水浴融化后， 划线 MRS 平板 30培养 48h。从平板上挑菌落接种 5ml MRS 肉汤， 30培养 12 16h， 吸取 5ml 菌液至 100ml MRS 肉汤， 30培养至A600为0.50.8(约4h)。 停止培养前1h， 加入氨苄青霉素使其终浓度为 20g/ml。 停止培养后吸取菌液。

40、于洁净、 无菌、 预冷的50ml聚丙烯离心管中， 置冰浴10min。 4离心 4000r/min 7min， 弃上清， 将管倒置， 用无菌滤纸条吸净残留液体。加入 20ml 冰冷 甘油缓冲液重悬菌沉淀， 于4离心4000r/min 7min， 弃上清， 再用20ml冰冷甘油缓冲液洗 1 次。加入 500l 冰冷甘油缓冲液重悬菌沉淀， 分装预冷无菌 EP 管 (100l/ 管 )， 立即 于 -70保存备用。 0073 (2) 电转化乳酸乳球菌 0074 从-70冰箱取出装有100l乳酸乳球菌细菌的EP管放于冰上融化， 用预冷枪头 吸入在冰上预冷的重组质粒 10l， 用手指轻弹管底使液体混合均匀。

41、， 置冰浴 5min。用预冷 枪头将EP管内全部液体吸入放冰浴预冷的转化杯(间距0.1cm)样品槽中， 放冰上5min。 取 出转化杯置于电转化仪内电击 1 次 ( 电击参数为 2KV， 5ms)， 立即取出电转杯放冰浴 5min。 加入 700l 于 37预温的 MRS 蔗糖肉汤于电转杯中， 轻轻用枪头吹出样品槽内菌液并混 匀， 将电转杯内全部液体吸至无菌 EP 管中， 于 37静止培养 3h。取 200l 菌液于含红霉 素 5g/ml， X-gal 40g/ml 的 MRS 平板 ( 以下简称 MRS-Ery-X-gal 平板 ) 中央， 用无菌 L 形玻棒将菌液涂布整个平板， 于 30培。

42、养 48 72h。阳性菌 (L.lactis/pMG36e-lacZ) 生 长为蓝色菌落 ( 见图 11)。 说 明 书 CN 101033471 B9/17 页 11 0075 (3) 阳性克隆的鉴定 0076 从待鉴定的阳性菌中提取重组质粒， 以其为模板 PCR 鉴定其中的 - 半乳糖苷酶 基因片段。 0077 重组质粒的提取 0078 待鉴定的阳性菌划线 MRS-Ery-X-gal 平板， 30培养 48h， 挑取平板上菌落接种 5ml 含红霉素 5g/ml 的 MRS 肉汤 ( 以下简称 MRS-Ery 肉汤 )， 30 220r/min 培养 12 16h。离心 (12000r/mi。

43、n 1min/ 次 ) 收集 5ml 菌液于 1.5ml EP 管中， 弃上清， 加入 230l 溶菌酶溶液 (25mg/ml)、 20l RNase A(4mg/m1) 重悬菌沉淀， 于 37水浴作用 lh。然后用 Plasmid Miniprep kit 提取质粒 ( 按操作说明书， 从第 4 步开始 )。 0079 以重组质粒为模板 PCR 扩增 - 半乳糖苷酶基因片段 0080 按表 7 加样进行 PCR 扩增 - 半乳糖苷酶基因片段。 0081 表 7 PCR 扩增 - 半乳糖苷酶基因片段 0082 0083 PCR 扩增结果见图 12， 可见扩增得到了长度约为 3.0kb 的特异条。

44、带， 与预期相符， 表明 pMG36e-lacZ 已成功电转化乳酸乳球菌。 0084 实施例 3 ： 重组质粒 pMG36e-lacZ 在大肠杆菌 DH5 中的表达 0085 重组质粒 pMG36e-lacZ 转化大肠杆菌 DH5 后获得阳性菌 E.coli DH5/ pMG36e-lacZ， 测定该菌的-半乳糖苷酶活性以研究重组质粒pMG36e-lacZ在大肠杆菌中 的表达情况。 0086 E.coli DH5/ pMG36e-lacZ划线LB-Ery-X-gal平板， 37培养48h， 挑取平板上 蓝色菌接种 15ml LB-Ery 肉汤， 37 220r/min 振荡培养 24h ； E。

45、.coli DH5 划线 LB 平板， 37培养24h， 挑取平板上单菌落接种15ml LB肉汤， 37 220r/min振荡培养24h。 分别取 菌液 10ml 于 50ml 离心管中 (10ml 菌液 / 离心管 )， 4离心 15000r/min 3min， 弃上清， 菌 沉淀用 pH7.0 的磷酸盐缓冲液洗涤两次， 最后加入 10ml 磷酸盐缓冲液重悬。将离心管置于 说 明 书 CN 101033471 B10/17 页 12 冰上， 用超声波破碎仪破壁， 制备粗酶液。超声破壁条件为输出功率 50W， 脉冲持续时间 6S， 间隙 2S， 脉冲 9 次。按表 8 操作测定粗酶液中 - 半。

46、乳糖苷酶活性。1 个酶活性单位 (U) 定义为在 37下每分钟分解出 lgmolONP 所需的酶量。 0087 表 8- 半乳糖苷酶活性测定 0088 0089 于 25静置 15min， 以空白调零， 测定试验管 A420。 0090 按下式计算酶活性 (U/ml) ： 0091 t ： 酶促反应时间 ； v ： 样品体积 0092 用总蛋白测定试剂盒测定粗酶液中总蛋白浓度 (pro mg/ml)， 将结果换算为酶比 活性 (U/mg pro) ： 0093 0094 酶活测定结果见表 9， 图 13。 0095 表 9E.coli DH5 和 E.coli DH5/pMG36e-lacZ 。

47、的 - 半乳糖苷酶活测定 0096 0097 注 ： - ： 无法检出 ； 1#和 2#菌株中插入的 - 半乳糖苷酶基因片段扩增自不同的德 氏乳杆菌保加利亚亚种菌株 ； 表中数据均为 5 次测定的平均值。 0098 酶活测定结果表明， 重组质粒pMG36e-lacZ转化大肠杆菌DH5后， 可在其中表达 产生具有活性的 - 半乳糖苷酶。 0099 实施例 4 ： 重组质粒 pMG36e-lacZ 在乳酸乳球菌中的表达 0100 重组质粒 pMG36e-lacZ 转化乳酸乳球菌后获得阳性菌 L.lactis/pMG36e-lacZ， 测 定该菌的 - 半乳糖苷酶活性以研究重组质粒 pMG36e-l。

48、acZ 在乳酸乳球菌中的表达情况。 0101 L.lactis/pMG36e-lacZ划线MRS-Ery-X-gal平板， 30培养48h， 挑取平板上蓝色 说 明 书 CN 101033471 B11/17 页 13 菌落接种 15ml MRS-Ery 肉汤， 30 220r/min 振荡培养 24h ； L.lactis 划线 MRS 平板， 30 培养 48h， 挑取平板上菌落接种 15ml MRS 肉汤， 30 220r/min 振荡培养 24h。按实施例 3 中方法测定和计算粗酶液中 - 半乳糖苷酶活性， 不同之处仅为制备粗酶液时的超声破壁 条件改为输出功率 50W， 脉冲持续时间 。

49、6S， 间隙 2S， 脉冲 13 次。 0102 酶活测定结果见表 10， 图 14。 0103 表 10L.lactis 和 L.lactis/pMG36e-lacZ 的 - 半乳糖苷酶活测定 0104 0105 注 ： - ： 无法检出 ； 1#和 2#菌株中插入的 - 半乳糖苷酶基因片段扩增自不同的德 氏乳杆菌保加利亚亚种菌株 ； 表中数据均为 5 次测定的平均值。 0106 酶活测定结果表明， 重组质粒 pMG36e-lacZ 转化乳酸乳球菌后， 可在其中表达产 生具有活性的 - 半乳糖苷酶。 0107 实施例 5 ： 重组质粒表达的蛋白非融合性分析 0108 本发明的技术创新为采用非融合表达技术， 在扩增 - 半乳糖苷酶基因片段时， 将其上游的一段长 18bp 的序列 (SEQ ID NO.1) 一起扩增出来， SEQ ID NO.1 含有 SD 序列， 可实现在融合表达载体上进行非融合蛋白表达。采用的上下游引物序列如下 ： 上游引物 lacZfl ： 5 -GCGTCTAGAGAAGGGAAGAATTAGAAAATGA-3 ， 下游引物 lacZrl ： 5 -GCGCTGCAGTTAT TTTAGTAAAAGGGGCTGA-3 。 0109 利用该引物扩增所得的基因插入 pMG36e 后的翻译偶。