技术领域
本发明涉及一种真菌代谢产生的化合物，尤其是一种利用新分离获得的菜豆间座壳菌 HLY2代谢产生的化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯呋喃-5-甲醛 (Mycoisobenzofuran)。
背景技术
菜豆间座壳菌(Diaporthe phaseolorum)分离于福建省漳州市九龙江口浮宫镇草埔头村红 树林生态区红树植物腐叶。文献(裘纬蕃主编，菌物学大全[M]，北京：科学出版社，1998) 报道该属真菌为植物寄生菌。该菌株在半海水配方马铃薯琼脂培养基(PDA)培养基上， 生长良好，菌丝纯白，无明显色素产生，不产孢子，培养10天以后，产生黑色子座。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构新颖，尚未见报道的利用新分离获得的菜豆间座壳菌 HLY2代谢产生的化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯呋喃-5-甲醛及其制备方法。
本发明的另一目的在于将化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯呋喃-5-甲醛作为抗 肿瘤药物或其他生物活性的先导物。
本发明所采用的真菌为本申请发明人从福建省漳州市九龙江口浮宫镇草埔头(地名) 红树林生态区的红树植物腐叶中分离得到的菌株HLY2，经鉴定为菜豆间座壳菌(Diaporthe phaseolorum)。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏编号为CCTCC NO：M 204061，保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为菜豆间座壳菌HLY2 Diaporthe sp.HLY2，保藏日为2004年8月24日。
本发明所说的真菌代谢产生的化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯呋喃-5-甲醛分 子式为C11H10O4，其结构式为：
本发明所说的化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯呋喃-5-甲醛的制备方法，其步 骤为：
1)液体培养及发酵液处理：取斜面上菌种接种于半海水配方马铃薯液体培养基(PDA) 中培养至发酵，发酵液经过滤，除去菌体，收集发酵液，分装后加入乙酸乙酯搅拌萃取， 收集萃取所得的有机相，减压浓缩至膏状；
2)化合物分离：取质量为上样量8～10倍的硅胶，用干法装柱至硅胶的沉降不再变动， 洗脱，洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序的洗脱梯度进行洗脱，收集每个梯度的洗脱液， 浓缩至干，将有羽状晶体析出的收集管中洗涤去晶体表面黄绿色素，自然挥干，重复以上 两个步骤直至晶体表面无色素附着，结晶制得的真菌代谢产物即为4-甲氧基-7-甲基-3-氧 -1，3-二氢异苯呋喃-5-甲醛。
在步骤1)中，取斜面上菌种接种于半海水配方马铃薯液体培养基中培养至发酵，温度 最好为23～26℃，优选25℃，收集发酵液分装后加入含量为发酵液0.8～1.2倍体积的乙酸 乙酯搅拌萃取5～15h。收集萃取所得的有机相，最好在45～55℃减压浓缩至膏状。
在步骤2)中，所取的硅胶为60～100目。洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由环 己烷开始，环己烷与乙酸乙酯不同体积比混合溶剂，乙酸乙酯，乙酸乙酯与甲醇不同体积 混合溶剂，最后至甲醇为洗脱溶剂，总共20级洗脱梯度进行洗脱，每个梯度洗脱溶剂为一 个柱床体积，250mL。将有羽状晶体析出的收集管中用环己烷3mL反复洗涤去晶体表面黄 绿色素，乙酸乙酯5mL溶解晶体后常温自然挥干。
在步骤2)中，所用的20个洗脱梯度分别为：环己烷、环己烷∶乙酸乙酯＝49∶1、环 己烷∶乙酸乙酯＝48∶2、环己烷∶乙酸乙酯＝46∶4、环己烷∶乙酸乙酯＝42∶8、环己烷∶ 乙酸乙酯＝38∶12、环己烷∶乙酸乙酯＝34∶16、环己烷∶乙酸乙酯＝25∶25、环己烷∶ 乙酸乙酯＝16∶34、环己烷∶乙酸乙酯＝10∶40、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶甲醇＝46∶4、乙 酸乙酯∶甲醇＝42∶8、乙酸乙酯∶甲醇＝34∶16、乙酸乙酯∶甲醇＝25∶25、乙酸乙酯∶ 甲醇＝16∶34、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶3、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶4、乙酸乙酯∶甲醇＝1∶9、 甲醇。
在步骤2)中，用干法装柱时所采用的柱的柱高可为8cm，直径为6cm。
对化合物的分析可进行NMR(核磁共振)，MS(质谱)，生物活性等测试。 根据NMR数据和ESI(电喷雾)质谱数据，对化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯 呋喃-5-甲醛进行结构鉴定，可确定化合物结构。根据对化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二 氢异苯呋喃-5-甲醛的生物活性测定，利用细胞毒MTT(噻唑蓝)法(参见文献Mosmann F. Rapid colorinetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assay[J].J.Immunol Methods，1983，65：55-63)测定化合物的抗肿瘤活性，发现 其对人口腔皮样癌KB细胞IC50＝6.25微克/毫升，对人B淋巴瘤Raji细胞IC50＝5.51微 克/毫升，对人骨肉瘤MG63细胞IC50＝113.6微克/毫升。利用乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选 模型3，4测定，化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯呋喃-5-甲醛在浓度为200μg/mL时， 对乙酰胆碱酯酶的抑制率为60％。由此证明，化合物4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯呋 喃-5-甲醛具有抗肿瘤活性和抑制乙酰胆碱酯酶活性，可作为抗肿瘤药物或其他生物活性的 先导物。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
实施例1
取斜面上菌种接种于半海水PDA中培养至发酵，温度为25℃，发酵液经纱布过滤，除 去菌体，收集上清，将收集到的上清分装于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入与上清液同体积的 乙酸乙酯搅拌萃取5h；收集有机相，用旋转蒸发仪50℃减压浓缩至干。取质量为上样量 8倍的硅胶(60目)，用干法装柱，柱内径选为6cm，柱长为8cm，用真空泵抽吸至硅胶 的沉降不再变动；浓缩后的样品经60目硅胶拌样后压实平铺于柱面，然后在样品面覆盖厚 为1cm的海砂。采用真空液相色谱法进行洗脱。洗脱溶剂系统按极性从小到大的顺序，由 环己烷开始，环己烷与乙酸乙酯不同体积比混合溶剂，乙酸乙酯，乙酸乙酯与甲醇不同体 积混合溶剂，最后至甲醇为洗脱溶剂，总共20级洗脱梯度进行洗脱，每个梯度为1倍柱床 体积，洗脱液每250mL收集1管。减压浓缩洗脱液至干，总共得到20个回收组分。氯仿 溶解后(若不溶，可加入适量甲醇至完全溶解)至于小管中常温自然挥发。第7管在溶剂 挥干后，管壁上有大量附着黄绿色素的羽状固体产生，用环己烷3mL反复洗涤去晶体表面 黄绿色素，乙酸乙酯5mL溶解晶体后常温自然挥干，重复以上两个步骤直至晶体表面无色 素附着。对该化合物进行TLC(薄层层析)分析，在展层系统为环己烷∶二氯甲烷＝1∶3 体系中，Rf值为0.28。进行NMR，MS，生物活性等测试，保存。
化合物的结构鉴定可采用以下办法：从化合物的1H NMR数据可以看出，该化合物有5 组单峰，从高场到低场积分面积分别为3∶3∶2∶1∶1。根据化学位移可确定化合物中可能 存在1个和氧原子直接相连的甲基(δ4.28)；1个和氧原子直接相连的亚甲基(δ5.55)；1个醛 氢(δ10.01)；1个苯环上的氢(δ7.91)，共合10个氢原子。结合1H NMR，分析13C NMR和 DEPT(不失真地极化转移增强)谱图可进一步确证化合物分子中含1个五取代苯环，1个 醛碳基，1个酯碳基，1个甲氧基，1个亚甲氧基和1个接在苯环上的甲基。
ESI-MS数据显示该化合物分子量为206，结合NMR数据，可确定化合物的分子式为 C11H10O4，根据不饱和度的推算公式：UN＝Cm+1-Hn/2，其中UN为不饱和度，Cm为化合物 中C原子的数目，Hn为化合物中H原子的数目，得出此化合物的不饱和度为7。扣除1个 苯环(4)和两个羰基(2×1)的不饱和度余1，说明化合物中还有1个环存在。
综合上述分析，初步确定该化合物为一种苯并环内酯化合物。进一步分析1H-1H COSY 和13C NMR，可以确定-CHO，-OCH3，-CH3，-COOCH2-在苯环上的取代位置，并对所有的 C、H进行指认，最后确定化合物为4-甲氧基-7-甲基-3-氧-1，3-二氢异苯呋喃-5-甲醛，化合 物1H和13C NMR数据见表1。
表1化合物H7A的NMR数据(CD3Cl，TMS，ppm) No δC δH(multiplicity，JH/HHZ) 1H-1H COSY 1 70.27(s) 5.55(2H) 1’ 3 167.8(q) 3a 116.6(q) 4 162.1(q) 5 125.1(q) 6 140.6(t) 7.91(1H) 1’ 7 7a 132.1(q) 148.7(q) 1’ 16.02(p) 2.39(3H) 1，6 2’ 63.06(p) 4.28(3H) 3’ 190.3(t) 10.01(1H)
1.化合物溶于氘代氯仿(CD3Cl)试剂中，氢谱由TMS(四甲基硅烷)做内 标，ppm为化学位移单位，百万分之一；
2.字母p，s，t，q分别代表伯，仲，叔，季碳，由DEPT图确定；
3.δC：C化学位移；δH：H化学位移J：耦合常数；COSY：同核移位相 关谱；
4.multiplicity：多重裂峰。
实施例2
与实施例1类似，其区别在于加入为上清液0.8倍体积的萃取液乙酸乙酯，160r/m振荡 萃取10h，收集的有机相用旋转蒸发仪55℃减压浓缩。取质量为上样量10倍的硅胶(100 目)，用干法装柱。
实施例3
与实施例1类似，其区别在于加入为上清液1.2倍的萃取液乙酸乙酯，160r/m振荡萃取 15h，收集的有机相用旋转蒸发仪45℃减压浓缩。取质量为上样量8倍的硅胶(80目)， 用干法装柱。