UDP-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101942424 B (45)授权公告日 2012.02.29 CN 101942424 B *CN101942424B* (21)申请号 201010261966.2 (22)申请日 2010.08.24 C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12P 19/。

2、44(2006.01) (73)专利权人 北京农学院 地址 102206 北京市昌平区回龙观镇北农路 7 号 (72)发明人 马兰青 王有年 师光禄 叶和春 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 CN 1302895 A,2001.07.11, 全文 . 周文灵等 . 植物糖基转移酶及其在代谢工 程中的应用 .生物技术 .2009, 第 19 卷 ( 第 6 期 ),95-98. L Q Ma et al.Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferas。

3、e elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis.Plant cell rep .2007, 第 26 卷摘要、 991 页倒数第 2 段、 993 页右栏倒数第 1 段 . (54) 发明名称 UDP-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种 UDP- 葡萄糖基转移酶突 变体的编码基因及其应用。本发明提供的蛋白 质， 人工合成， 命名为 RsmUGT73B6， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ： 1) 由序列表中的序列 3 的氨基酸 残基序列组成的蛋白质 ； 2) 将序列表中的序列 4 氨基酸。

4、残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和 / 或缺失和 / 或添加且与红景天甙合成相关 由 1) 衍生的蛋白质。本发明的实验证明， 采用定 点突变 (V361T/T373I/G376S) 技术对 UGT73B6 进 行了突变研究， UGT73B6 的三联体突变体命名为 RsmUGT73B6， 结果显示， 突变后的 RsmUGT73B6 红 景天甙合成能力较 UGT73B6 提高了 1.9 倍。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高欣 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 15 页 附图 3 页 CN 1019424。

5、24 B1/1 页 2 1. 一种蛋白质， 是由序列表中的序列 4 的氨基酸残基序列组成的蛋白质。 2. 权利要求 1 所述蛋白质的编码基因。 3. 根据权利要求 2 所述的编码基因， 其特征在于 ： 所述编码基因为如下 1) 或 2) 所述 的 DNA 分子 ： 1) 序列表中序列 3 所示的 DNA 分子 ； 2) 序列表中序列 3 自 5 末端第 1 位到第 1443 位核苷酸所示的 DNA 分子。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述编码基因的重组载体、 重组菌、 转基因细胞系、 表达盒或重 组病毒。 5.根据权利要求4所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述重组载体为将权利要求2或3所。

6、 述编码基因插入载体 pET-30b(+) 的多克隆位点间得到的重组载体。 6. 权利要求 1 所述蛋白质在合成红景天甙中的应用， 或权利要求 2 或 3 所述编码基因 在合成红景天甙中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于 ： 所述合成红景天甙为体外合成红景天甙。 8. 一种制备红景天甙的方法， 其特征在于 ： 所述方法为以酪醇和 UDP- 葡萄糖为底物， 在权利要求 1 所述蛋白质的催化作用下， 得到红景天甙。 权 利 要 求 书 CN 101942424 B1/4 页 3 UDP- 葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种 UDP- 。

7、葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用。 背景技术 0002 高山红景天 (Rhodiola sachalinensis A.Bor) 又名库页红景天， 是景天科 (Crassulaceae) 红景天属 (Rhodiola rosea L.) 植物， 为多年生草本或亚灌木， 常具肉 质匍匐根状茎， 是长白山珍稀药用植物之一。红景天属植物的主要活性成分为红景天甙 (salidroside) 和甙元酪醇 (tyrosol) 等， 现代药理学研究结果表明红景天甙具有明显的 抗缺氧、 抗寒冷、 抗疲劳、 抗辐射、 抗病毒、 延缓机体衰老等功效， 对于航天、 深海、 沙漠、 高 原、 体育等行业是一种极。

8、具开发应用前景的环境适应药物， 同时对高辐射从业人员、 微机使 用频繁人员、 强脑力劳动者、 中老年人群具有积极的滋补保健作用。 发明内容 0003 本发明的一个目的是提供一种 UDP 葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用。 0004 本发明提供的蛋白质， 人工合成， 命名为 RsmUGT73B6， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ： 0005 1) 由序列表中的序列 4 的氨基酸残基序列组成的蛋白质 ； 0006 2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和 / 或添加且具有 UDP- 葡萄糖基转移酶功能和 / 或与红景天甙合成相关的由 1) 衍生 的。

9、蛋白质。 0007 上述序列 4 由 480 个氨基酸残基组成， 上述一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加为不超过 10 个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加。 0008 所述蛋白质的编码基因 RsmUGT73B6 也是本发明保护的范围。 0009 所述编码基因为如下 1)-5) 中任一所述的 DNA 分子 ： 0010 1) 序列表中序列 3 所示的 DNA 分子 ； 0011 2) 序列表中序列 3 自 5 末端第 1 位到第 1443 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0012 3) 序列表中序列 3 自 5 末端第 4 位到第 1443 位核苷酸所示的 D。

10、NA 分子 ； 0013 4) 在严格条件下与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列杂交且编码具有 UDP- 葡萄糖基 转移酶功能和 / 或与红景天甙合成相关的蛋白所示的 DNA 分子 ； 0014 5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70、 至少具有75、 至少具有80、 至少具有 85、 至少具有 90、 至少具有 95、 至少具有 96、 至少具有 97、 至少具有 98或至少具有 99同源性且编码具有 UDP- 葡萄糖基转移酶功能和 / 或与红景天甙合成 相关的蛋白所示的 DNA 分子。 0015 上述序列 3 由 1564 个核苷酸组成， OFR 的序列为序列 3。

11、 的自 5 末端第 1-1443 位 核苷酸序列。 0016 所述严格条件可为在 0.1SSPE( 或 0.1SSC)， 0.1 SDS 的溶液中， 在 65下杂 交， 并用该溶液洗膜。 说 明 书 CN 101942424 B2/4 页 4 0017 含有上述编码基因的重组载体、 重组菌、 转基因细胞系、 表达盒或重组病毒也是本 发明保护的范围。 0018 所述重组载体为将上述编码基因插入载体 pET-30b(+) 的 NdeI 和 SalI 识别位点 间得到的重组载体。 0019 扩增上述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围 ； 所述引物对 如下所示 ： 一条引物序列如序列表。

12、中序列 5 所示， 另一条引物序列如序列表中序列 6 所示。 0020 上述蛋白质在合成红景大甙中的应用， 上述编码基因在合成红景天甙中的应用都 是本发明要保护的范围。所述合成红景天甙为体外合成红景天甙。 0021 本发明的另一个目的是提供一种制备苯亚甲基丙酮的方法。 0022 本发明提供的方法为以酪醇和UDP-葡萄糖为底物， 在权利要求1所述蛋白质的催 化作用下， 得到红景天甙。 0023 本发明的实验证明， 采用定点突变 (V361T/T373I/G376S) 技术对 UGT73B6 进行了 突变研究， UGT73B6的三联体突变体命名为RsmUGT73B6， 结果显示， 突变后的RsmU。

13、GT73B6红 景天甙合成能力较UGT73B6提高了1.9倍。 RsmUGT73B6突变基因及其应用为红景天甙的生 物合成提供了直接有效的技术及应用基础。 附图说明 0024 图 1 为 RsmUGT73B6 原核表达载体的构建 0025 图 2 为原核表达载体的 NdeI 和 BamHI 双酶切鉴定 0026 图 3 为 UGT 纯化 SDS-PAGE 分析 0027 图 4 为 HPLC 检测结果 具体实施方式 0028 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0029 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0030 实施例 1、 U。

14、GT73B6 的定点突变的获得 0031 1.UGT73B6 的定点突变 0032 人工合成 UGT73B6( 序列表中的序列 1)。 0033 UGT73B6 的 定 点 突 变 (V361T/T373I/G376S) 采 用 QuikChange site-directed mutagenesis kit( 购自 Stratagene， Catalog#200518) 试剂盒方法， 具体突变引物如下 ( 突变位点用下划线标出 ) ： UGT73B6 V361T/T373I/G376S(5 -GGACCACCAGTCTACCGGGGGTTT TGTGTCACATTGTGGATGGAACTCA。

15、ATTTTGGAAAGTATCTCAGCAGGG-3 )， 模板为人工合成 UGT73B6， 进行 PCR 得到的 PCR 产物， 将该 PCR 产物送去测序， 结果表明， 该 PCR 产物具有序列表中序 列 2 的序列， 该 PCR 产物的基因命名为 RsmUGT73B6， OFR 为序列表中序列 3 的自 5 末端第 1-1443 位核苷酸， RsmUGT73B6 编码的蛋白命名为 RsmUGT73B6， 该蛋白的氨基酸序列为序列 表中的序列 4。RsmUGT73B6 与 UGT73B6 相比， 突变位点为 ： 第 1081-1083 位由 GTG 突变为 ACC， 第 1117-1119。

16、 位由 ACA 突变为 ATT， 第 1126-1128 位由 GGT 突变为 AGT。RsmUGT73B6 与 UGT73B6( 序列 2) 相比， 突变位点为第 361 位由 Val( 缬氨酸 ) 突变为 Thr( 苏氨酸 )， 第 373 位由 Thr( 苏氨酸 ) 突变为 Ile( 异亮氨酸 )， 第 376 位由甘氨酸 Gly 突变为 Ser( 丝氨酸 )。 说 明 书 CN 101942424 B3/4 页 5 0034 2.RsmUGT73B6 异源表达和蛋白纯化 0035 RsmUGT73B6cDNA 的 ORF 使用含有特定限制性内切酶位点的 N- 末端和 C- 末端引 物进。

17、行 PCR 扩增。正义引物为 ： 5 -GGAATTCCATATGGGTTCTGAAACTCGGCC-3 ( 序列 5)， 下 划线表示 NdeI 酶切位点 ； 反义引物为 ： 5 -CGGGATCCCTAGACTTTCTTTAACTTGAGTTCC-3 ( 序 列 6)， 下划线表示 BamHI 酶切位点。以步骤 1) 获得的 PCR 产物 ( 或人工合成的序列 3) 为模板， 进行 PCR， 得到的 PCR 产物 ( 序列 2 中自 5末端第 4-1443 为核苷酸序列 ) 经 过 NdeI/BamHI 双酶切后， 连接到经过相同酶切的原核表达载体 pET-30b(+)(Novagen， 。

18、Darmstadt， Germany) 上， 获得重组载体 ( 图 1 为载体结构示意图 )， 将重组载体进行酶切 鉴定， 结果如图 2(M， DL15000+2000Marker ； 1-3， 阳性质粒。) 所示， 从图中看出， 得到约 1.5Kb 的 DNA 片段， 将酶切鉴定结果正确的重组阳性质粒测序， 测序正确的重组载体命名为 pET-30b(+)-RsmUGT73B6。经过测序， pET-30b(+)-RsmUGT73B6 为在 pET-30b(+) 的 NdeI 和 BamHI 识别位点间插入序列 2 中自 5 末端第 4-1443 为核苷酸序列得到的， 进一步证明载体 构建正确。。

19、 0036 将 pET-30b(+)-RsmUGT73B6 转 入 大 肠 杆 菌 E.coli BL21-Rosetta(DE3) (TransGen， Beijing， China) 菌株中， 获得重组菌， 将重组菌提取质粒后酶切鉴定， 获得大小 为 1.5Kb 的 DNA 片段的重组菌命名为 BL21/pET-30b(+)-RsmUGT73B6。 0037 采用同样的方法将空载体 pET-30b(+) 导入大肠杆菌 E.coli BL21-Rosetta(DE3) (TransGen， Beijing， China) 菌株中， 获得重组菌 BL21/pET-30b(+)， 再将该重组菌采。

20、用上 述方法发酵、 纯化获得对照组蛋白。 0038 将BL21/pET-30b(+)-RsmUGT73B6接入10ml含有卡那霉素(50g ml-1)和氯霉素 (34gml-1) 的 LB 培养基， 37培养过夜， 次日稀释 100 倍接入 200ml LB 培养基中于 37、 200rpm 继续培养至 OD600为 0.6-0.8 时， 添加终浓度为 1mM 的 IPTG， 降温至 30， 6h 后， 通 过离心收集菌体并重悬于3ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)， 超声波冰上破碎菌体。 冰上破 碎的菌体匀浆于 4 10,000g 下离心 10min， 收集上清。 0039 上 清 。

21、通 过 Ni2+- 琼 脂 糖 柱 (Novagen). 用 含 有 0.5M NaCl and 40mM 咪 唑 (imidazole)的0.1M磷酸钾缓冲液洗涤Ni2+-琼脂糖柱三次后， 用含有400mM imidazole的 0.1M 磷酸钾缓冲液洗涤洗脱， 收集洗涤洗脱液， 为了长期保持重组蛋白活性， 再将洗脱缓冲 液通过 PD-10 柱 (Amersham Pharmacia Biotech， Uppsala， Sweden)， 用含 10 (v/v) 甘油 的 0.1M Tris-HCl(pH7.5) 置换缓冲液重新洗脱， 收集洗脱液， 得到重组蛋白 RsmUGT73B6， 保存于。

22、 -80。 0040 重组蛋白的纯化效率用 SDS-PAGE 检测。 0041 组氨酸六聚体标签构筑在重组蛋白的 N 末端上。将上述纯化得到的重组蛋白进行 SDS-PAGE 电泳检测， 结果如图 3(M， 分子质量标准 ； 1， RsmUGT73B6 纯化结果 ； 2， UGT73B6 纯 化结果 ) 所示， 结果显示纯化的重组蛋白在 50kDa 的位置上形成一个单一条带。对照组蛋 白中未有目的蛋白条带。 0042 实施例 2、 突变体的功能研究 0043 1、 体外酶促反应及产物分析 0044 250l 标准体外酶促反应体系包括 ： 50mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.5)， 5。

23、00M 酪 醇 (Sigma-Aldrich Catalog #79058)， 2mM UDP- 葡萄糖 (Sigma-Aldrich Catalog#U4625) 说 明 书 CN 101942424 B4/4 页 6 和10g由实施例1获得的重组蛋白RsmUGT73B6。 37反应30min， 反应结束后加入250l 甲醇， 12000g 离心 10min， 反应产物用于 HPLC 分析。以实施例 1 获得的重组蛋白 UGT73B6 和对照组蛋白为对照。 0045 1 个酶活力单位 (U) 定义为 1 小时内催化酪醇产生 1nmol 红景天甙的酶量。反应 时间为 60min， 测定温度为 。

24、37。 0046 酶 促 产 物 的 分 析 使 用 配 备 有 Kromosil C18 反 相 柱 (5m， 250mm4.6mm ； Macherey Nagel) 的 Waters Alliance 2695 高效液相色谱系统 (HPLC) 完成。流动相为水 (A) 和甲醇 (B)， 流速为 0.6ml min-1， 使用以下梯度条件 ： 30 B3 分钟、 30-70 B 27 分钟、 70-80 B 2 分钟、 80-95 B 3 分钟以及 95 B 5 分钟。检测波长为 275nm。用红景天甙 标准品 ( 上海同田生物技术有限公司， Catalog E-0069) 进行定量。 0。

25、047 对于高效液相色谱-质谱分析， 液相分离由Shimadzu LC-10ADvp HPLC系统完成。 质谱测定由Shimadzu LCMS-2010A质谱系统完成(Shimadazu， Kyoto， Japan)。 ShimadzuLC/ ESIMS-2010 软件系统完成数据采集和处理。液相色谱条件同前述。最适的质谱条件如下 ： 所有的 m/z 波普范围设定在 120-350 ； 干燥气体流速， 1.5L min-1； CDL 温度， 250； block 温 度， 200 ； probe 电压 +4.5kV。 0048 酶促产物的定性及定量分析结果如图 4(A 为 UGT73B6 催化。

26、结果， B 为 RsmUGT73B6 催化结果 ) 所示， 显示， RsmUGT73B6 催化生成的红景天甙的保留时间为 8.3 分钟， UGT73B6 催化生成的红景天甙的保留时间为 8.3 分钟。 0049 RsmUGT73B6 与酪醇 A 和 UDP- 葡萄糖共同在标准酶促反应体系中孵育且酶促反应 体系 pH 值为 7.5 时， 对于红景天甙的合成， RsmUGT73B6 的酶比活为 4263U mg-1； UGT73B6 的 的酶比活为1470U mg-1。 因此， RsmUGT73B6能够高效地生成红景天甙为主产物， 且活性远高 于 UGT73B6。对照组蛋白没有酶活性。 0050 。

27、质谱检测结果为红景天甙标准品分子量为 300.31， RsmUGT73B6 催化生成红景天 甙的分子量为 300.31， UGT73B6 催化生成红景天甙的分子量为 300.31， 表明， 得到的物质为 红景天甙。 0051 证明 ： RsmUGT73B6 为尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶。 0052 重组蛋白动力学常数的测定是在 UDP- 葡萄糖浓度饱和 ( 浓度为 2mM/l) 的情况 下， 用酪醇 A 介于其 Km的 0.2-6.0 范围内的 5 个浓度值进行计算获得。 0053 实验使用上述标准的250l 0.1M磷酸钾缓冲液反应体系， 每个实验重复3次。 反 应体系的pH值为7.5， 上述。

28、反应体系置于37下30分钟后， 加入终浓度为5的甲醇， 之后 用 250l 的乙酸乙酯抽提并于 10,000g 下离心 10 分钟。取上清真空干燥后， 加入 50l 50 (v/v) 的甲醇水溶液。HPLC 测定条件同上。Km和 Vmax值由 Lineweaver-Burke 曲线的 结果得出。 0054 突变体 RsmUGT73B6 酶活性 (Vmax/Km) 为 8.88， UGT73B6 酶活性 (Vmax/Km) 为 4.6 ； 突 变体 RsmUGT73B6 较 UGT73B6 提高 1.9 倍， RsmUGT73B6 突变基因及其应用为红景天甙的生 物合成提供了直接有效的技术及应用。

29、基础。 说 明 书 CN 101942424 B1/15 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 101942424 B2/15 页 8 0003 序 列 表 CN 101942424 B3/15 页 9 0004 序 列 表 CN 101942424 B4/15 页 10 0005 序 列 表 CN 101942424 B5/15 页 11 0006 序 列 表 CN 101942424 B6/15 页 12 0007 序 列 表 CN 101942424 B7/15 页 13 0008 序 列 表 CN 101942424 B8/15 页 14 0009 序 列 表 CN 10194。

30、2424 B9/15 页 15 0010 序 列 表 CN 101942424 B10/15 页 16 0011 序 列 表 CN 101942424 B11/15 页 17 0012 序 列 表 CN 101942424 B12/15 页 18 0013 序 列 表 CN 101942424 B13/15 页 19 0014 序 列 表 CN 101942424 B14/15 页 20 0015 序 列 表 CN 101942424 B15/15 页 21 序 列 表 CN 101942424 B1/3 页 22 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101942424 B2/3 页 23 图 3 说 明 书 附 图 CN 101942424 B3/3 页 24 图 4 说 明 书 附 图 。