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1、(10)授权公告号 CN 101113470 B (45)授权公告日 2010.12.08 CN 101113470 B *CN101113470B* (21)申请号 200710052455.8 (22)申请日 2007.06.13 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 左波 马志雄 陈朝国 熊远著 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 Liping huang 等.The ZIP7 gene(slc39a7) enc。
2、odes a zinc transporter involvedin zinc homeostasis of the golgi apparatus. the journal of biological chemistry280 15.2005,280(15),15456-15463. 刘桂兰等 .IGF2 基因 PCR-RFLP 多态性 与脂肪沉积相关性的关联分析 . 遗传学报 30 12.2003,30(12),1107-1112. 左波等 . 利用 24 个微卫星进行猪数量性状 座位定位及其遗传效应分析 . 畜牧兽医学报 34 2.2003,34(2),139-146. (54) 发明名。
3、称 SLC39A7 基因作为猪脂肪沉积性状的遗传标 记及应用 (57) 摘要 本发明属于猪遗传育种及分子标记辅助选择 技术领域， 具体涉及一种筛选的猪脂肪沉积性状 SLC39A7 基因的遗传标记， 该遗传标记具有有如 序列表 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ IDNO ： 2 所示的核苷 酸序列。在序列表 SEQ ID NO ： 1 的第 250bp 处 有一个 A250-G250 的错义突变， 导致其编码的氨 基酸由精氨酸 (Arg) 变成甘氨酸 (Gly)， 并导致 HpaII-RFLP 多态性。利用本发明的遗传标记对 来自国外血缘猪和中国地方血缘猪品种进行了脂 肪沉积相关性状的关联。
4、分析。本发明还公开了猪 SLC39A7 基因第 3 外显子的 SNP 分型的检测方法， 为猪的分子标记辅助选择提供了新的遗传标记和 检测方法。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 朱晓乐 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 CN 101113470 B1/1 页 2 1.一种筛选的猪脂肪沉积性状SLC39A 7基因的遗传标记， 其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的遗传标记， 其特征在于， 序列表 SEQ ID NO ： 1 的第 2。
5、50bp 处 有一个 A250-G250 的碱基突变， 导致 HpaII-RFLP 多态性。 3. 根据权利要求 1 所述的遗传标记， 其中克隆 SLC39A7 基因第 3 外显子的特异 DNA 片 段所用引物的 DNA 序列如下所示 ： 正向引物 F ： ATCCTGCTGAGTTTTGCTTCG， 反向引物 R ： TGGGGATGGACACATTGAGAC。 4. 一种筛选适用于猪脂肪沉积性状的遗传标记的方法， 按照以下步骤 ： 从猪血液中提取基因组 DNA， 根据猪 SLC39A7 基因基因组序列设计引物， 得到如权利要 求 3 所示的引物， 用权利要求 3 所示的引物在猪基因的基因组。
6、 DNA 中进行 PCR 扩增， PCR 产 物纯化和克隆测序， 获得如序列表 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列。 5. 权利要求 1 所述的遗传标记在猪脂肪沉积性状辅助选择中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101113470 B1/8 页 3 SLC39A7 基因作为猪脂肪沉积性状的遗传标记及应用 技术领域 0001 本发明涉及猪育种与猪的分子辅助选择技术领域， 具体涉及一种与猪的脂肪沉积 性状相关基因 SLC39A7DNA 片段的克隆以及作为猪脂肪沉积性状的遗传标记的应用， 为猪 的标记辅助选择提供一种新标记和新方法。 背景技术 0002 通。
7、过生产性状的表型值估算出的育种值进行动物选择性育种， 已大大促进了家畜 生产性状的遗传改良。 九十年代以来， 随着分子生物学技术的进步以及在猪领域中的应用， 逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术， 这些技术与常 规育种相结合， 大大加速了猪育种进程。能够应用于分子标记辅助选择的基因或标记必须 对目标性状具有较大的遗传贡献率， 即主效基因或标记， 因此寻找这些主效基因和与之紧 密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的前提和基础， 也是当前和今后一段时间猪分子 生物学领域的研究重点和急需解决的问题。 0003 目前已有多个位于功能基因内部的与生产性状紧密连锁的分子标记被发。
8、现并申 请专利。例如， 在传统的猪育种计划中， 由于消费者对瘦肉的兴趣， 因此选择主要强调降 低脂肪。脂肪降低主要以背膘厚降低来衡量。然而， 背膘厚下降同样导致了肌内脂肪的下 降， 脂肪最后的沉积部位是肌肉， 因此肌内脂肪与味道以及肌肉的接受程度呈正相关。为 防止肌内脂肪进一步的下降， 必须找到影响此性状的分子标记， 因为肌内脂肪是很难在活 体中度量的。Gerbens 等证实了位于猪 6 号染色体上肌肉组织特异候选基因心脏脂肪酸结 合蛋白与猪中肌内脂肪含量和其它生产性状的关系， 该基因已被申请专利， 其专利号为 WO 97/35878 ； 另外， Rothschild 等发现了 leptin 。
9、受体基因内与瘦肉率有关的分子标记， 其专 利号为 U.S.Pat.Nos.5972621。 0004 在整个生命活动过程中， 锌具有多种作用， 它不仅参与了蛋白质、 核酸、 碳水化合 物和脂类代谢， 而且还参与了基因转录控制、 生长、 发育和分化。锌不仅是 300 多种酶的辅 助因子， 而且是多种锌指和环指蛋白的结构成分。 锌离子不能被动的扩散穿过细胞膜， 必须 要有锌转运蛋白转运锌进入细胞液， 因此锌转运蛋白在保持细胞调亡和细胞生长间的平衡 具有至关重要的作用。锌转运蛋白家族 39 成员 7(SLC39A7) 属于锌转运蛋白家族， 该基因 主要定位于细胞的内质网、 高尔基体等亚细胞结构膜上，。
10、 表达该基因重组蛋白的中国仓鼠 卵巢细胞可以提高自由锌离子的含量， 该基因主要从高尔基体细胞器到细胞质中进行锌的 转运。 0005 许多报道表明， 在具有中国地方猪血缘的梅山猪和其它猪种杂交 F2资源群体 中， 7 号染色体存在显著影响猪背膘厚等脂肪沉积性状的 QTL(Bidanel J P 等， .Current status of quantitative trait locus mapping in pigs.Pig News and Information， 2002， 2 ： 39-54 ； Sato S等， Quantitative trait loci analysis for 。
11、growth and carcass traitsin a MeishanDuroc F2 resource population.J Anim Sci， 2003， 81(12) ： 2938-2949 ； Zuo B( 左波 ) 等 (2004)Mapping of quantitative trait loci on porcine 说 明 书 CN 101113470 B2/8 页 4 chromosome 7 using combined data analysis.Asian-AustralianJournal of Animal Science 17， 1350-1354)。有趣。
12、的是， 该 QTL 区域均位于猪主要组织相容性复合体位置区 域， 并且该 QTL 中降低背膘厚的等位基因来源于梅山猪群体， 而不是大白猪群体。因此， 在 该区域很有可能存在同一个来源于梅山猪的隐性有利 QTL。目前有关该区域 BAC 库已经被 构建和测序， SLC39A7 基因就是被定位到该 QTL 区域的一个功能基因， 其基因结构有 8 个外 显子和 7 个内含子组成。 0006 迄今为止， 尚未见关于与猪的脂肪沉积性状相关基因 SLC39A7DNA 遗传标记及其 在多态性分析中应用的报道。 发明内容 0007 本发明的目的在于克隆猪 SLC39A7 基因的特异 DNA 片段， 作为猪脂肪沉。
13、积性状的 遗传标记及其在猪脂肪沉积性状多态性的检测方面的应用， 为猪的标记辅助选择提供一种 新标记和新方法。 0008 本发明提供了欧洲血缘猪品种 “大白猪” 和中国地方血缘猪品种 “梅山猪” 包括猪 SLC39A7 基因第 3 外显子的 402bp 的基因组核苷酸序列， 其 DNA 序列如序列表 SEQ ID NO ： 1( 大白猪 )， SEQ ID NO ： 2( 梅山猪 ) ； 通过 2 个猪种 ( 大白猪和梅山猪 ) 的上述序列进行 Cluster W 比对提供了位于该 402bp 扩增片段内部的 2 处单核苷酸多态性 (SNP)， 其 SNP 位 点如图 1 所示。 0009 制备。
14、该基因片段的步骤如下 ： 选择中国地方猪种梅山猪和外来的欧洲猪大白猪为 试验材料， 从猪血液中提取 DNA， 根据猪 SLC39A7 基因的基因组序列 ( 参照 GeneBank 登录 号 ： CT737383) 设计引物， 序列如下 ： 0010 正向引物 F ： ATCCTGCTGAGTTTTGCTTCG， 0011 反向引物 R ： TGGGGATGGACACATTGAGAC。 0012 利用该引物进行 PCR 扩增， PCR 产物纯化、 克隆测序， 序列比较分析。 0013 本发明提供了鉴定上述序列 250bp 处 A/G 变异的 HpaII-RFLP( 限制性内切酶 酶切片段长度多态。
15、性 ) 基因型分型方法。其步骤包括 ： 根据猪 SLC39A7 基因基因组序列 (GeneBank 登录号 ： CT737383) 设计引物， 其引物序列如上所示， 在猪基因组 DNA 中进行 PCR 扩增， PCR 扩增片段 HpaII 酶切分型及检测。 0014 进一步， 本发明提供了利用 HpaII-RFLP 方法确定的不同基因型个体与脂肪沉积 性状间的相关关系的关联分析的应用。 0015 序列表、 附图说明 ： 0016 序列表 SEQ ID NO ： 1 ： 是欧洲血缘猪品种 “大白猪” 的核苷酸序列 ； 0017 序列表 SEQ ID NO ： 2 ： 是中国地方猪血缘品种 “梅山。
16、猪” 的核苷酸序列 ； 0018 其 中 ： 序 列 表 SEQ ID NO ： 1 ： 是 实 施 猪 SLC39A7 基 因 第 3 外 显 子 A/G 变 异 HpaII-RFLP( 限制性内切酶酶切片段长度多态性 ) 基因型分型方法的特异核苷酸序列 ； 0019 序列表SEQ ID NO ： 2 ： 是实施猪SLC39A7基因第3外显子A/G变异HpaII-RFLP(限 制性内切酶酶切片段长度多态性 ) 基因型分型方法的特异核苷酸序列。 0020 图 1 ： 分别是大白猪和梅山猪 SLC39A7 基因序列比对结果和 SNP 位点。 0021 图 2 ： SLC39A7 基因 HpaII。
17、-RFLP 检测结果 说 明 书 CN 101113470 B3/8 页 5 0022 琼脂糖胶浓度为 1.5 ； 图中 ： 泳道 M 为 DL 2000Markers ； 3、 4 泳道为 AA 基因型， 402bp ； 1 泳道为 AB 基因型， 402bp， 250bp， 152bp ； 2 泳道为 BB 基因型， 250bp， 152bp。 具体实施方式 0023 实施例 1 ： SLC39A7 基因片段的获得及多态性检测方法的建立 0024 选择具有欧洲血缘的 “大白猪” 和具有中国地方猪血缘的 “梅山猪” 两种不同基因 型猪品种为试验材料， 根据猪SLC39A7基因基因组序列(Ge。
18、neBank登录号 ： CT737383)， 设计 以下引物， 引物序列如下 ： 0025 正向引物 F ： ATCCTGCTGAGTTTTGCTTCG 0026 反向引物 R ： TGGGGATGGACACATTGAGAC 0027 用上述引物在大白猪和梅山猪基因组 DNA 中进行 PCR 扩增， PCR 反应体系为 25l， 其中模板DNA为50ng， dNTPs浓度为200mol/L， 每条引物浓度为0.4mol/L， 3U的 Taq DNA 聚合酶 ( 购自 BiostarInternational， Canada)， 加去离子水至总体积 25l ； PCR 反应程序 ： 94预变性 。
19、4min ； 然后 94变性 50s、 64退火 50s、 72延伸 1min， 共 35 个循 环 ； 最后 72延伸 10min。 0028 对上述两种基因型猪种的 PCR 产物经纯化 ( 参见武汉生工公司 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒说明书)、 克隆后， 进行序列测定， 序列测定由上海生工生物技术公司完成。 上 述两种基因型猪种的PCR产物序列经ClusterW软件进行序列比对， 序列间比对结果见图1。 上述扩增片段大小为 402bp， 共存在 2 个碱基变异， 其中位于该片段的 250bp 处的 A/G 变异 导致了相应氨基酸的突变， 并引起了 HpaII 酶切位点 ( 。
20、CCGG) 多态性。 0029 取 8.5l PCR 产物加入 0.5l(10U/l) 限制性内切酶和 1l 10buffer( 含 10BSA)， 37HpaII酶切4h， 取5l酶切产物用琼脂糖或聚丙烯酰胺胶电泳检测， 在紫外 灯下或银染后观察并记录酶切结果。此扩增片段大小为 402bp， HpaII 酶切多态性位点位于 该片段的250bp处， 若250bp处的碱基为A， 则不存在HpaII酶切位点， 用HpaII酶切检测结 果只有一条402bp片段(A等位基因)， 当该位点为G时， 结果导致一个HpaII酶切位点的产 生， 酶切得到两个片段， 长度分别为 250bp 和 152bp(B 。
21、等位基因 )， 结果如图 2 所示。 0030 实施例 2 ： 本发明克隆的遗传标记在不同基因型猪群中的多态性检测的应用 0031 利用本发明的遗传标记检测了来自欧洲血缘的两个外来猪群 ( 大白猪、 长白猪 ) 和6个来自中国地方猪血缘的猪群(皖南花猪、 八眉猪、 监利猪、 阳新猪、 梅山猪、 鄂西黑猪) 中检测猪 SLC39A7 第 3 外显子的 HpaII-RFLP 多态性， 检测结果如表 1 所示。在所检测的几 个猪种中， 欧洲血缘猪种大白猪、 长白猪群占优势的A等位基因的基因频率分别为0.734和 0.679， 中国地方猪血缘猪种皖南花猪、 八眉猪、 监利猪、 阳新猪、 梅山猪、 鄂西。
22、黑猪中优势的 B等位基因的基因频率分别为0.917、 0.667、 0.714、 1、 0.738和0.615， 在上述来自于欧洲和 中国地方猪种间， 它们的等位基因频率表现显著差异。 0032 表 1 SLC39A7 基因 HpaII 酶切多态性在不同猪种中的分布结果 0033 说 明 书 CN 101113470 B4/8 页 6 0034 实施例 3 ： 本发明克隆的遗传标记在猪脂肪沉积性状关联分析中的应用 0035 (1) 单标记分析 0036 为了确定 SLC39A7 基因多态性与猪表型差异是否相关， 选择中国湖北省武汉市华 中农业大学农业部猪遗传育种重点开放实验室组建的 293 头。
23、大白猪 梅山猪 F2代资源群 体为试验材料， 采用实施例2所建立的HpaII-RFLP方法进行多态性检测， 并分析猪SLC39A7 基因HpaII-RFLP不同基因型与猪胴体性状的相关关系。 采用SAS统计软件(SAS Institute Inc， Version 8.0)glm 程序进行单标记方差分析， 模型如下 ： 0037 yijkl +gi+fj+sk+yl+covijkl+eijkl 0038 yijkl为性状表型值， 为平均值， gl为基因型效应 ( 包括基因加性效应和显性效 应 ) ； sk、 yl、 fj为固定效应， 分别为性别、 年度、 家系效应， 为屠宰体重的回归系数 ； 。
24、covijkl 为屠宰体重作为协变量， eijkl为残差效应。 0039 在所检测的 293 头大白猪 梅山猪 F2 代个体中， AA 基因型有 97 个， AB 基因型有 143 个， BB 基因型有 53 个。不同基因型与胴体性状间的统计分析结果总结于表 2。由表 2 可以看出， HpaII-RFLP 基因型不同时， 在板油重、 内脂率、 肩部最厚处背膘厚、 胸腰椎结合处 背膘厚、 臀部平均背膘厚以及平均背膘厚等脂肪沉积性状存在显著或极显著差异， 来源于 梅山猪品种的等位基因降低脂肪沉积， 效应方向与品种间的表型效应并不完全一致。该位 点对眼肌高度、 眼肌面积和瘦肉率无显著效应。 0040。
25、 表 2SLC39A7 基因 HpaII-RFLP 基因型与猪胴体性状的统计分析表 0041 说 明 书 CN 101113470 B5/8 页 7 0042 (2) 连锁分析 0043 利用 Crimap 2.4 软件对该位点和 7 号染色体 7 个微卫星标记进行连锁分析， 该染 色体的遗传图谱为 ： Swr1343-33.7-Sw2155-36.3-Sw1856-13.4-SLC39A7-26.1-Sw352-12.9 -Sw252-33.1-Sw581-26.7-S0212， 采用QTL express软件进行QTL定位分析， 并进行显著性 检验， 所采用模型为 ： 0044 模型 1 。
26、： yijklm u+si+fj+gk+covijkm+cama+cdmd+eijkm 0045 模型 2 ： yijklm u+si+fj+gk+SLl+covijklm+cama+cdmd+eijklm 0046 模型 1 和 2 主要区别是是否考虑 SLC39A7 基因作为固定效应， 其中模型 1 不考虑 SLC39A7 基因作为固定效应， 模型 2 考虑了 SLC39A7 基因作为固定效应 ； 通过 QTL 连锁分析 表明 ： 在不考虑 SLC39A7 基因作为固定效应的前提下 ( 模型 1)， 在该染色体上存在显著影 响板油重、 内脂率、 肩部最厚处背膘厚、 胸腰椎结合处背膘厚、 臀。
27、部平均背膘厚以及平均背 膘厚等脂肪沉积性状的 QTL， 同时存在显著影响眼肌面积和瘦肉率的 QTL。当考虑 SLC39A7 基因作为固定效应的前提下 ( 模型 2)， 影响上述脂肪沉积性状的 QTL 的显著性水平 (F 值 ) 显著下降或为不显著 ( 表 3)， 而对于眼肌面积、 眼肌高以及瘦肉率等肌肉相关性状， F 值变 化不大 ( 表 3)， 说明该基因对肌肉相关性状的影响不大 ； 加性效应为正值表明来源于梅山 猪的等位基因具有降低背膘厚的效应 QTL。 0047 表 3 背膘厚 QTL 定位结果 0048 说 明 书 CN 101113470 B6/8 页 8 0049 以上两种方法的应。
28、用均有力的支持了SLC39A7基因作为猪7号染色体隐性有利背 膘厚 QTL 候选基因的证据。 0050 序列表 0051 华中农业大学 0052 SLC39A7 基因作为猪脂肪沉积性状的遗传标记及应用 0053 0054 2007-06-12 0055 2 0056 PatentIn version 3.1 0057 1 0058 402 0059 DNA 0060 猪 (Sus scrofa) 0061 0062 gene 0063 (1).(402) 0064 说 明 书 CN 101113470 B7/8 页 9 0065 0066 exon 0067 (218).(271) 0068 。
29、0069 0070 mutation 0071 (250).(250) 0072 0073 1 0074 atcctgctga gttttgcttc gggtgggctc ttgggagatg ccttcctgca cctcattcct 60 0075 catgctctgg gtaagtgacc tcaaatctta gagtgtttta ttctttgaat gagagggttc 120 0076 tttcctcttt gtgatccctg accttctagt gtccccccaa tacacacctt ttgtgtggga 180 0077 tattccctta tctaaccttt t。
30、cccccactt cttccag aac ccc att ctc acc acc 235 0078 Asn Pro Ile Leu Thr Thr 0079 1 5 0080 ctc tgg agc agc cca gac acg gac att ccc aca gtg gtaaggaagg 281 0081 Leu Trp Ser Ser Pro Asp Thr Asp Ile Pro Thr Val 0082 10 15 0083 ggaggatgga gataatggtt tggggtgcta gggaaggtct gtccctccct gttctcctct 341 0084 actt。
31、ggggag gaagagtctg gaatctatat ttctcttaat gtctcaatgt gtccatcccc 401 0085 a 402 0086 2 0087 402 0088 DNA 0089 猪 (Sus scrofa) 0090 0091 gene 0092 (1).(402) 0093 0094 0095 mutation 0096 (250).(250) 0097 0098 0099 exon 0100 (218).(271) 0101 0102 2 0103 atcctgctga gttttgcttc gggtgggctc ttgggagatg ccttcctgc。
32、a cctcattcct 60 说 明 书 CN 101113470 B8/8 页 10 0104 catgctctgg gtaagtgacc tcaaatctta gagtgtttta ttctttgaat gagagggttc 120 0105 tttcctcttt gtgatccctg accttctagt gtccccccaa tacacacctt ttgtgtggga 180 0106 tattccctta tctaaccttt tcccccactt cttccag aac ccc att ctc acc acc 235 0107 Asn Pro Ile Leu Thr Thr 01。
33、08 1 5 0109 ctc tgg agc agc ccg gac acg gac att ccc aca gtg gtaaggaaag 281 0110 Leu Trp Ser Ser Pro Asp Thr Asp Ile Pro Thr Val 0111 10 15 0112 ggaggatgga gataatggtt tggggtgcta gggaaggtct gtccctccct gttctcctct 341 0113 acttggggag gaagagtctg gaatctatat ttctcttaat gtctcaatgt gtccatcccc 401 0114 a 402 说 明 书 CN 101113470 B1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 。