从间歇循环活性污泥膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法.pdf

从间歇循环活性污泥－膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法，它涉及一种驯化、分离、筛选聚磷菌的方法。它解决了现在并不清楚ICAS－MBR系统中哪种菌的聚磷性能最好的问题。驯化、分离、筛选高效聚磷菌按以下步骤进行：(一)菌种驯化；(二)菌种分离；(三)菌种富集；(四)高效聚磷菌筛选，选出聚磷效果最为明显的聚磷菌菌株。本发明从间歇循环活性污泥－膜生物反应系统中得到高效聚磷菌，为将来微生物改造，污水水处理，尤其是污水除磷奠定了物质基础。

1、从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法，其特征在于从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌按以下步骤进行：(一)菌种驯化：用回流泵(4)将曝气室(3)中的污泥混合液间歇性地回流到搅拌室(2)中，曝气室(3)水力停留时间为3～4h，搅拌室(2)水力停留时间为3.5～4h，间歇性回流与停止回流时间比为1∶2.5，曝气室(3)中始终进行曝气保持曝气室(3)中溶解氧为2±0.1mg/L，曝气室(3)中pH值保持为7～8，驯化用水为生活污水，菌种在系统内驯化时间≥3个月；(二)菌种分离：接种液按体积比由10％含有驯化菌种的活性污泥混合液、88.9％质量分数为0.9％的NaCl、1％质量分数为0.104％的NaPO和0.1％体积浓度比为2％的Tween80组成，混匀接种液后倍比稀释接种到醋酸盐固体培养基上，在30±0.5℃条件下培养6～10天后挑选单菌落分别划线纯化培养；(三)菌种富集：将纯化培养得到的菌株分别放入醋酸盐液体培养基，在30±0.5℃、200r/min的环境中振荡培养3～5天；(四)高效聚磷菌筛选：在无菌条件下将富集菌液和自配水按3∶2的体积比混匀，并加入占富集菌液和自配水总体积0.2～1.2％不具有除磷能力的活性污泥混合液，在10～30r/min的厌氧环境中振荡培养2.5～3.5h后转入另一容器内加入占富集菌液和自配水总质量1.5～2％的NaHPO·2HO，然后曝气使溶解氧浓度为0.5～5mg/L，检测含磷量，选出聚磷效果最为明显的聚磷菌菌株；其中自配水中COD∶N∶P的质量比为100∶10∶2。 2、根据权利要求1所述的从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法，其特征在于步骤(一)中驯化用生活污水中COD为300～424mg/L、BOD为180～250mg/L、TP为5～7mg/L、TN为30～50mg/L、NH-N为23～43mg/L、pH值为7.2～7.8。 3、根据权利要求1所述的从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法，其特征在于步骤(二)中醋酸盐固体培养基pH值为7.0，1000mL醋酸盐固体培养基由3.68g的CHCOONa，17.2mg的CaC1·2HO、28.73mg的NaHPO·2HO、12g的HEPES、57.27mg的NHCl、15g的琼脂、131.82mg的MgSO·7HO、1000ml蒸馏水和26.74mg的KSO组成。 4、根据权利要求1所述的从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法，其特征在于步骤(二)中采用磁力搅拌2min，冰浴1min，搅拌2min，冰浴1min，搅拌2min，冰浴1min，再磁力搅拌1min的方法混匀接种液。 5、根据权利要求1所述的从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法，其特征在于步骤(二)中划线纯化培养8～12次。 6、根据权利要求1所述的从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法，其特征在于步骤(三)中醋酸盐液体培养基pH值为7.0，1000mL醋酸盐液体培养基由3.68g的CHCOONa，17.2mg的CaC1·2HO、28.73mg的NaHPO·2HO、12g的HEPES、57.27mg的NHCl、131.82mg的MgSO·7HO、1000ml蒸馏水和26.74mg的KSO组成。 7、根据权利要求1所述的从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌的方法，其特征在于1000mL自配水中含有10mg MgCl、0.1mg CuSO、5mg CaCl、0.1mg MnSO和0.1mg ZnCl；自配水中COD值为50mg/L，TN值为5mg/L，TP值为1mg/L，pH值为7.5。



技术领域

本发明涉及一种驯化、分离、筛选聚磷菌的方法。

背景技术

关于间歇循环活性污泥-膜生物反应系统(ICAS-MBR)的研究论文2005 年5月18日公开以后其优越的除磷性能备受关注。ICAS-MBR系统优越的除 磷性能主要来源于ICAS-MBR系统中高效的聚磷菌，而现在研究人员并不清 楚ICAS-MBR系统中哪种菌的聚磷性能最好。

发明内容

本发明的目的是为了解决现在并不清楚ICAS-MBR系统中哪种菌的聚磷 性能最好，而提供的一种从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、 筛选高效聚磷菌的方法。从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、 筛选高效聚磷菌按以下步骤进行：(一)菌种驯化：用回流泵将曝气室中的污 泥混合液间歇性地回流到搅拌室中，曝气室水力停留时间为3～4h，搅拌室水 力停留时间为3.5～4h，间歇性回流与停止回流时间比为1∶2.5，曝气室中始 终进行曝气保持曝气室中溶解氧为2±0.1mg/L，曝气室中pH值保持为7～8， 驯化用水为生活污水，菌种在系统内驯化时间≥3个月；(二)菌种分离：接 种液按体积比由10％含有驯化菌种的活性污泥混合液、88.9％质量分数为0.9％ 的NaCl、1％质量分数为0.104％的Na5P3O10和0.1％体积浓度比为2％的 Tween80组成，混匀接种液后倍比稀释接种到醋酸盐固体培养基上，在30± 0.5℃条件下培养3～10天后挑选单菌落分别划线纯化培养；(三)菌种富集： 将纯化培养得到的菌株分别放入醋酸盐液体培养基，在30±0.5℃、200r/min的 环境中振荡培养3～5天；(四)高效聚磷菌筛选：在无菌条件下将富集菌液和 自配水按3∶2的体积比混匀，并加入占富集菌液和自配水总体积0.2～1.2％不 具有除磷能力的活性污泥混合液，在10～30r/min的厌氧环境中振荡培养 2.5～3.5h后转入另一容器内加入占富集菌液和自配水总质量1.5～2％的 Na2HPO4·2H2O，然后曝气使溶解氧浓度为0.5～5mg/L，检测含磷量，选出聚 磷效果最为明显的聚磷菌菌株；其中自配水中COD∶N∶P的质量比为 100∶10∶2。本发明从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中得到高效聚磷菌，为 将来微生物改造，污水水处理，尤其是污水除磷奠定了物质基础。

附图说明

图1是间歇循环活性污泥-膜生物反应系统装置图，图2是聚磷菌J7的吸 磷曲线图，图3是聚磷菌J16的吸磷曲线图，图4是聚磷菌J17的吸磷曲线图， 图5是聚磷菌J23的吸磷曲线图。

具体实施方式

具体实施方式一：结合图1说明本实施方式，本实施方式从间歇循环活性 污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚磷菌按以下步骤进行：(一) 菌种驯化：用回流泵4将曝气室3中的污泥混合液间歇性地回流到搅拌室2 中，曝气室3水力停留时间为3～4h，搅拌室2水力停留时间为3.5～4h，间歇 性回流与停止回流时间比为1∶2.5，曝气室3中始终进行曝气保持曝气室3 中溶解氧为2±0.1mg/L，曝气室3中pH值保持为7～8，驯化用水为生活污水， 菌种在系统内驯化时间≥3个月；(二)菌种分离：接种液按体积比由10％含 有驯化菌种的活性污泥混合液、88.9％质量分数为0.9％的NaCl、1％质量分数 为0.104％的Na5P3O10和0.1％体积浓度比为2％的Tween80组成，混匀接种液 后倍比稀释接种到醋酸盐固体培养基上，在30±0.5℃条件下培养3～10天后挑 选单菌落分别划线纯化培养；(三)菌种富集：将纯化培养得到的菌株分别放 入醋酸盐液体培养基，在30±0.5℃、200r/min的环境中振荡培养3～5天；(四) 高效聚磷菌筛选：在无菌条件下将富集菌液和自配水按3∶2的体积比混匀， 并加入占富集菌液和自配水总体积0.2～1.2％不具有除磷能力的活性污泥混合 液，在10～30r/min的厌氧环境中振荡培养2.5～3.5h后转入另一容器内加入占 富集菌液和自配水总质量1.5～2％的Na2HPO4·2H2O，然后曝气使溶解氧浓度 为0.5～5mg/L，检测含磷量，选出聚磷效果最为明显的聚磷菌菌株；其中自配 水中COD(化学需氧量)∶N(氮)∶P(磷)的质量比为100∶10∶2。

图1中污水池1、搅拌室2、曝气室3、回流泵4、抽吸泵5、压力表6、 流量计8、曝气泵9和进水泵10通过管线连接，时控器7与回流泵4和抽吸 泵5通过电线连接。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(一) 中驯化用生活污水中COD(化学需氧量)为300～424mg/L、BOD(生化需氧 量)为180～250mg/L、TP(总磷)为5～7mg/L、TN(总氮)为30～50mg/L、 NH4-N(氨态氮)为23～43mg/L、pH值为7.2～7.8。其它步骤与实施方式一相 同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(二) 中醋酸盐固体培养基pH值为7.0，1000mL醋酸盐固体培养基由3.68g的 CH3COONa，17.2mg的CaC12·2H2O、28.73mg的Na2HPO4·2H2O、12g的 HEPES、57.27mg的NH4Cl、15g的琼脂、131.82mg的MgSO4·7H2O、1000ml 蒸馏水和26.74mg的K2SO4组成。其它步骤与实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(二) 中采用磁力搅拌2min，冰浴1min，搅拌2min，冰浴1min，搅拌2min，冰浴 1min，再磁力搅拌1min的方法混匀接种液。其它步骤与实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(二) 中挑选单菌落分别划线纯化培养8～12次。其它步骤与实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(三) 中醋酸盐液体培养基pH值为7.0，1000mL醋酸盐液体培养基由3.68g的 CH3COONa，17.2mg的CaC12·2H2O、28.73mg的Na2HPO4·2H2O、12g的 HEPES、57.27mg的NH4Cl、131.82mg的MgSO4·7H2O、1000ml蒸馏水和 26.74mg的K2SO4组成。其它步骤与实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：1000mL自 配水中含有10mg MgCl2、0.1mg CuSO4、5mg CaCl2、0.1mg MnSO4和0.1mg ZnCl2；自配水中COD值为50mg/L，TN值为5mg/L，TP值为1mg/L，pH值 为7.5。其它与实施方式一相同。

具体实施方式八：结合图1、图2、图3、图4和图5说明本实施方式， 本实施方式从间歇循环活性污泥-膜生物反应系统中驯化、分离、筛选高效聚 磷菌按以下步骤进行：

(一)菌种驯化：用回流泵4将曝气室3中的污泥混合液间歇性地回流到 搅拌室2中，曝气室3水力停留时间为3.5h，搅拌室2水力停留时间为3.5～ 4h，间歇性回流时间为1h，停止回流时间为2.5h，曝气室3中始终进行曝气 保持曝气室3中溶解氧为2mg/L，曝气室3中pH值保持为7～8；驯化用水为 生活污水，生活污水中COD(化学需氧量)为310～414mg/L、BOD(生化需 氧量)为190～240mg/L、TP(总磷)为6mg/L、TN(总氮)为35～45mg/L、 NH4-N(氨态氮)为30～40mg/L、pH值为7～7.6；菌种在ICAS-MBR系统内 驯化1个月，其除磷率大于88％，菌种在ICAS-MBR系统内驯化3个月后对 系统进行PHA(聚羟基链烷酯)、Poly-P(聚磷)颗粒染色检测，检测发现厌 氧条件下活性污泥中细菌中有大量PHA颗粒，好氧条件下活性污泥中细菌中 有大量Poly-P颗粒，符合聚磷菌的典型特征，证明菌种驯化完成；

(二)菌种分离：接种液按体积比由10％含有驯化菌种的活性污泥混合液、 88.9％质量分数为0.9％的NaCl、1％质量分数为0.104％的Na5P3O10和0.1％体 积浓度比为2％的Tween80组成；采用磁力搅拌2min，冰浴1min，搅拌2min， 冰浴1min，搅拌2min，冰浴1min，再磁力搅拌1min的方法混匀接种液后倍 比稀释10000倍接种到醋酸盐固体培养基上，在30℃条件下培养10天后划线 纯化培养10次；其中醋酸盐固体培养基pH值为7.0，1000mL醋酸盐固体培 养基由3.68g的CH3COONa，17.2mg的CaC12·2H2O、28.73mg的 Na2HPO4·2H2O、12g的HEPES、57.27mg的NH4Cl、15g的琼脂、131.82mg的 MgSO4·7H2O、1000ml蒸馏水和26.74mg的K2SO4组成；

(三)菌种富集：将纯化培养得到的菌株分别放入醋酸盐液体培养基，在 30℃、200r/min的环境中振荡培养4天；其中醋酸盐液体培养基pH值为7.0， 1000mL醋酸盐液体培养基由3.68g的CH3COONa，17.2mg的CaC12·2H2O、 28.73mg的Na2HPO4·2H2O、12g的HEPES、57.27mg的NH4Cl、131.82mg的 MgSO4·7H2O、1000ml蒸馏水和26.74mg的K2SO4组成；

(四)高效聚磷菌筛选：在无菌条件下将富集菌液和自配水按3∶2的体 积比混匀，并加入占富集菌液和自配水总体积0.2～1.2％不具有除磷能力的活 性污泥混合液，在05～25r/min的厌氧环境中振荡培养3h后转入另一容器内加 入占富集菌液和自配水总质量1.5～2％的Na2HPO4·2H2O，然后曝气使溶解氧 浓度为1～4mg/L，检测含磷量，聚磷(吸磷)效果较好的4株聚磷菌J7、J16、 J17、J23的吸磷曲线图如图2-5所示，选出聚磷效果最为明显的聚磷菌菌株J7； 其中自配水中COD(化学需氧量)∶N(氮)∶P(磷)的质量比为100∶10∶2；

(五)鉴定聚磷菌J7：将聚磷菌J7送往上海博亚生物技术有限公司进行 测序，测得DNA序列在GenBank中对比，聚磷菌J7与Acinetobacter haemolyticus(溶血不动杆菌)的相似性达到99％，证明聚磷菌J7属于不动杆 菌属。