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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710529942.2 (22)申请日 2017.07.03 (71)申请人 齐鲁制药 （内蒙古） 有限公司 地址 010080 内蒙古自治区呼和浩特市金 川开发区南区纬四路2号 (72)发明人 连剑飞居亚东翟晓云樊乐 李学洋 (74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 代理人 张宏松 (51)Int.Cl. C12P 19/62(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种提高细胞活性的多杀菌素发酵方法 (57)摘要。
2、 本发明涉及一种提高细胞活性的多杀菌素 发酵方法， 该方法包括： 在发酵培养基消毒之前， 向发酵培养基中加入硫酸锌和氯化钴， 与发酵培 养基混合均匀， 充分溶解， 然后进行消毒灭菌； 灭 菌后进行摇瓶种子液生长， 成熟后接入种子罐 中， 由种子罐发酵成熟再转入发酵罐的方法， 发 酵采用二级发酵。 本发明充分利用了硫酸锌和氯 化钴的金属微量元素使得多杀细胞的酶活有了 很大的提升， 通过锌离子和钴离子对刺糖多孢菌 细胞酶活的影响， 从而影响其细胞活性， 使得多 杀的细胞活性有明显的提高， 最后测得发酵效价 有很大的提高。 权利要求书1页 说明书4页 CN 107365813 A 2017.11.2。
3、1 CN 107365813 A 1.一种提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 包括步骤如下： (1)在发酵培养基消毒之前， 向发酵培养基中加入硫酸锌和氯化钴， 与发酵培养基混合 均匀， 充分溶解， 然后进行消毒灭菌； (2)灭菌后进行摇瓶种子液生长， 成熟后接入种子罐中， 由种子罐发酵成熟再转入发酵 罐的方法， 发酵采用二级发酵。 2.根据权利要求1所述的提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 其特征在于， 硫酸锌的添 加量占发酵培养基重量的0.0050.01。 3.根据权利要求1所述的提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 其特征在于， 硫酸锌的添 加量占发酵培养基重量的0.0050.008， 最为优选的。
4、， 硫酸锌的添加量占发酵培养基 重量的0.005。 4.根据权利要求1所述的提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 其特征在于， 氯化钴的添 加量占发酵培养基重量的0.0050.01。 5.根据权利要求1所述的提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 其特征在于， 氯化钴的添 加量占发酵培养基重量的0.0050.008， 最为优选的， 氯化钴的添加量占发酵培养基 重量的0.005。 6.根据权利要求1所述的提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 其特征在于， 发酵培养基 的原料配方以质量百分比计组成如下： 淀粉： 5， 葡萄糖： 2， 玉米粉： 3， 酵母粉： 3， 硫 酸镁： 0.4， 硝酸铵： 0.3， 氯化。
5、钠： 0.6， 碳酸钙： 0.7， 豆油： 1， 水： 84。 7.根据权利要求1所述的提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 其特征在于， 消毒灭菌采 用温度为120-125蒸汽灭菌30-40分钟。 8.根据权利要求1所述的提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 其特征在于， 步骤(2)在 发酵罐中发酵具体如下： 将发酵培养基混合均匀， 充分溶解， 在发酵罐中的培养基灭菌并冷 却到30， 并进行无菌保压， 将种子罐中的种子液转入发酵罐中进行培养， 转种量为30， 发酵罐培养条件为： 温度30， 罐压0.05Mp， 通气量1.5vvm， pH为6-8之间， 搅拌转速为350 转， 溶氧发酵罐维持在60以上。
6、。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107365813 A 2 一种提高细胞活性的多杀菌素发酵方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 属于生物农药制备技术领 域。 背景技术 0002 多杀菌素是由刺糖多包菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的。 多杀菌素 是一种新型的绿色广谱生物杀虫剂， 属于微生物源生物化学农药。 多杀菌素兼有生物农药 的安全性和化学合成农药的快速效果， 喷药后当天起效， 中国和美国的农业部登记的安全 采收期都只有一天， 最适合无公害蔬菜的生产。 多杀菌素因其低毒、 低残留而且对害虫的天 敌无害， 自然分解速度快。
7、而获得美国 “总统绿色化学品挑战奖” 。 在日益注重环保和安全意 识的今天， 多杀菌素作为一种优质的绿色生物农药， 有着巨大的发展和应用前景。 0003 目前多杀菌素的生产主要是生物发酵方法， 目前的刺糖多孢菌株产素能力一般， 传统的调整发酵培养基的氮源和碳源对多杀菌素产量的增长较小， 没有实质性突破。 0004 基于多杀菌素发酵的产量在国内不理想， 对于实现产业化和工业化有很大的挑 战， 急需提供一种有效的方法来提高多杀发酵的产量。 发明内容 0005 针对现有技术的不足， 本发明提供一种提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 本发 明的发酵方法可大大提高多杀发酵细胞的细胞活性， 使得发酵产量有了。
8、明显的提高。 0006 本发明的技术方案如下： 0007 一种提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 包括步骤如下： 0008 (1)在发酵培养基消毒之前， 向发酵培养基中加入硫酸锌和氯化钴， 与发酵培养基 混合均匀， 充分溶解， 然后进行消毒灭菌； 0009 (2)灭菌后进行摇瓶种子液生长， 成熟后接入种子罐中， 由种子罐发酵成熟再转入 发酵罐的方法， 发酵采用二级发酵。 0010 根据本发明优选的， 硫酸锌的添加量占发酵培养基重量的0.0050.01。 0011 进一步优选的， 硫酸锌的添加量占发酵培养基重量的0.0050.008， 最为优 选的， 硫酸锌的添加量占发酵培养基重量的0.005。 。
9、0012 根据本发明优选的， 氯化钴的添加量占发酵培养基重量的0.0050.01。 0013 进一步优选的， 氯化钴的添加量占发酵培养基重量的0.0050.008， 最为优 选的， 氯化钴的添加量占发酵培养基重量的0.005。 0014 根据本发明优选的， 发酵培养基的原料配方以质量百分比计组成如下： 淀粉： 5， 葡萄糖： 2， 玉米粉： 3， 酵母粉： 3， 硫酸镁： 0.4， 硝酸铵： 0.3， 氯化钠： 0.6， 碳酸 钙： 0.7， 豆油： 1， 其余组分为水： 84。 0015 根据本发明优选的， 消毒灭菌采用温度为120-125蒸汽灭菌30-40分钟。 0016 本发明优选的， 。
10、发酵培养基为： 硫酸锌0.005， 氯化钴： 0.005， 淀粉： 5， 葡萄 说明书 1/4 页 3 CN 107365813 A 3 糖： 2， 玉米粉： 3， 酵母粉： 3， 硫酸镁： 0.4， 硝酸铵： 0.3， 氯化钠： 0.6， 碳酸钙： 0.7， 豆油： 1， 水： 83.99。 0017 根据本发明优选的， 步骤(2)在发酵罐中发酵具体如下： 将发酵培养基混合均匀， 充分溶解， 在发酵罐中的培养基灭菌并冷却到30， 并进行无菌保压， 将种子罐中的种子液 转入发酵罐中进行培养， 转种量为30， 发酵罐培养条件为： 温度30， 罐压0.05Mp， 通气量 1.5vvm， pH为6-。
11、8之间， 搅拌转速为350转， 溶氧发酵罐维持在60以上。 0018 采用本发明的发酵方法， 发酵罐发酵60h开始测细胞活性， 在60小时测起步效价， 在 60小时测得细胞活性实验罐比对照罐的细胞活性高出60。 实验罐的起步效价比正常 对照起步效价要高出67。 0019 硫酸锌和氯化钴为金属微量元素。 对照罐不添加这些金属微量元素， 多杀菌素的 产生没有任何提高， 而添加了硫酸锌和氯化钴之后， 实验罐的效价有明显的提高。 通过利用 MTT染色的方法， 添加硫酸锌和氯化钴的发酵罐， 多杀发酵细胞的细胞活性有明显的增加， 且使得发酵产量有了明显的提高。 本发明充分利用了硫酸锌和氯化钴的金属微量元素。
12、使得 多杀细胞的酶活有了很大的提升， 通过锌离子和钴离子对刺糖多孢菌细胞酶活的的影响， 从而影响其细胞活性， 使得多杀的细胞活性有明显的提高， 最后测得发酵效价有很大的提 高。 0020 本发明所用原料及设备均为现有技术。 0021 本发明的优点如下： 0022 1、 在发酵培养基消毒之前， 向发酵培养基中加入硫酸锌和氯化钴， 大大提高多杀 的细胞活性， 使得发酵产量有了明显的提高， 比正常对照起步效价提高67， 且添加金属微 量元素的比例很小， 添加的具体金属盐都非常廉价。 0023 2、 本发明添加微量元素增长多杀菌素的产量， 不需要改变原有的发酵工艺， 对于 生产没有任何负面的影响， 有。
13、明显的经济效益和价值。 具体实施方式 0024 下面通过具体实施例对本发明做进一步说明， 但不限于此。 0025 实施所用设备均为常规现有设备。 0026 实施例中使用的原料， 市售产品。 0027 实施例1 0028 一种提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 包括步骤如下： 0029 (1)生产多杀菌素的菌种经过实验验证后， 甘油管经由种子瓶， 发酵2-3天， 镜检无 杂菌， 菌体形状为放射状， 无断裂， 菌浓达到20以上， pH为6.8， 生长到成熟， 获得种子液； 进行下一步发酵。 0030 (2)在30升种子罐中加入种子培养基， 灭菌后冷却到30， 并进行无菌保压， 然后 再火焰的保护下，。
14、 将种子液接入种子罐中进行种子培养， 接种量为50ml， 种子罐培养条件 为： 温度30， 罐压0.05Mp， 通气量1vvm， pH为7-8之间， 培养2-3天， 搅拌转速为300 转每分 钟， 溶氧一般种子罐维持在80以上， 种子培养基的原料配方以质量百分比计组成如下： 豆 饼粉： 3， 葡萄糖： 3， 糊精： 3， 硫酸镁： 0.3,硫酸铵： 0.3， 碳酸钙： 0.4， 水： 90。 培养基灭菌后pH： 7-8 说明书 2/4 页 4 CN 107365813 A 4 0031 (3)在发酵培养基消毒之前， 向发酵培养基中加入硫酸锌和氯化钴， 硫酸锌的添加 量占发酵培养基重量的0.00。
15、5， 氯化钴的添加量占发酵培养基重量的0.005。 与发酵培 养基混合均匀， 充分溶解， 在100升发酵罐中的培养基灭菌并冷却到30， 并进行无菌保压， 将种子罐中的种子液转入发酵罐中进行培养。 转种量为30。 发酵罐培养条件为： 温度30 ， 罐压0.05Mp， 通气量1.5vvm， pH为6-8之间， 搅拌转速为350转， 溶氧一般发酵罐维持在 60以上， 搅拌转速可根据溶氧往高适当调升。 0032 发酵培养基的原料配方以质量百分比计组成如下： 淀粉： 5， 葡萄糖： 2， 玉米 粉： 3， 酵母粉： 3， 硫酸镁： 0.4， 硝酸铵： 0.3， 氯化钠： 0.6， 碳酸钙： 0.7， 豆。
16、油： 1， 其余组分为水： 84。 培养基灭菌后pH： 6-7 0033 发酵结果： 发酵300小时， 多杀菌素放罐效价为1300ug/ml。 发酵细胞活性由开始60 小时开始测得细胞活性到250小时细胞活性一直在增长， 最高测得吸光值为2.9235 0034 实施例2 0035 一种提高细胞活性的多杀菌素发酵方法， 包括步骤如下： 0036 (1)生产多杀菌素的菌种经过实验验证后,甘油管经由种子瓶， 发酵2-3天， 镜检无 杂菌， 菌体形状为放射状， 无断裂， 菌浓达到20以上， pH为6.8， 生长到成熟， 获得种子液； 进行下一步发酵。 0037 (2)在3000升种子罐中加入种子培养基。
17、， 灭菌后冷却到30， 并进行无菌保压， 然 后再火焰的保护下， 将种子液接入种子罐中进行种子培养， 接种量为3000ml， 种子罐培养条 件为： 温度30， 罐压0.05Mp， 通气量1vvm， pH为7-8之间， 培养2-3天， 前0-10小时搅拌转速 为100转， 之后搅拌转速为250转每分钟， 溶氧一般种子罐维持在80以上。 0038 种子培养基的原料配方以质量百分比计组成如下： 豆饼粉： 3， 葡萄糖： 3， 糊 精： 3， 硫酸镁： 0.3， 硫酸铵： 0.3， 碳酸钙： 0.4， 水： 90。 培养基灭菌后pH： 7-8 0039 (3)在发酵培养基消毒之前， 向发酵培养基中加入。
18、硫酸锌和氯化钴， 硫酸锌的添加 量占发酵培养基重量的0.005， 氯化钴的添加量占发酵培养基重量的0.005。 与发酵培 养基混合均匀， 充分溶解， 在10000升发酵罐中的培养基灭菌并冷却到30， 并进行无菌保 压， 将种子罐中的种子液转入发酵罐中进行培养。 转种量为30。 发酵罐培养条件为： 温度 30， 罐压0.05Mp， 通气量1.2vvm， pH为6-8之间， 前0-80小时搅拌转速为100转， 80小时之后 搅拌转速为180转每分钟， 10吨发酵罐溶氧维持在70以上， 搅拌转速可根据溶氧往高适当 调升。 0040 发酵培养基的原料配方以质量百分比计组成如下： 淀粉： 5， 葡萄糖：。
19、 2， 玉米 粉： 3， 酵母粉： 3， 硫酸镁： 0.4， 硝酸铵： 0.3， 氯化钠： 0.6， 碳酸钙： 0.7， 豆油： 1， 水： 84。 培养基灭菌后pH： 6-7 0041 发酵结果： 发酵300小时， 多杀菌素效价为1700ug/ml。 发酵的细胞活性由开始60小 时开始测得细胞活性到250小时细胞活性一直在增长， 最高测得吸光值为3.1053 0042 实验例 0043 选取十批发酵罐， 采取基础料添加硫酸锌和氯化钴， 在多杀菌素发酵罐发酵期间 选取各个时间段测其细胞活性和效价。 0044 细胞活性测定方法： 利用MTT染色方法， 用酶标仪测吸光度， 来测细胞活性。 0045 效价测试方法： 高效液相色谱法， 按照国标GB29696-2017规定的方法进行。 说明书 3/4 页 5 CN 107365813 A 5 0046 综上所述， 多杀菌素发酵添加金属微量元素硫酸锌和氯化钴能够明显提升细胞活 性， 对于多杀菌素的产量也有明显的提高。 对发酵生产有重要作用。 说明书 4/4 页 6 CN 107365813 A 6 。