技术领域
本发明涉及鉴定抗性播娘蒿的方法及专用引物，具体涉及鉴定抗ALS抑制剂类除 草剂的播娘蒿的方法及专用引物，其中，鉴定方法基于酶切扩增多态性序列(Aleaved AmplifiedPolymorphicSequences,CAPS)和衍生酶切扩增多态性序列(DerivedCleaved AmplifiedPolymorphicSequence,dCAPS)实现，能够快速、准确鉴定抗ALS抑制剂类除草 剂的播娘蒿的靶标基因的突变位点及突变氨基酸类型，属于生物技术领域。
背景技术
播娘蒿是小麦田常见恶性杂草之一，在我国的东北、华北、西北、华东、四川等地区 均有分布。该杂草发生严重的小麦田，会造成小麦大量减产，导致小麦减产最高可达 39.36％。化学除草是防治播娘蒿的有效方法。
苯磺隆是防治播娘蒿的主要除草剂，其应用面积约占小麦田化学防治面积的 70％。苯磺隆通过抑制杂草体内ALS酶的活性，使支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生 物合成受阻，导致杂草体内蛋白质合成受阻，最后使杂草因营养缺乏而死亡。苯磺隆在我国 小麦主产区的连年使用，导致了抗药性杂草种群的出现。抗性播娘蒿种群的出现对有效防 治播娘蒿提出了挑战，快速确定抗性播娘蒿的发生情况，是制定有效防治措施的关键。
目前研究表明，播娘蒿体内ALS酶的197位氨基酸、199位氨基酸、376位氨基酸和 574位氨基酸发生突变是播娘蒿对苯磺隆产生抗性的分子机理。此外，播娘蒿有2个ALS基 因，且在抗性播娘蒿植株中只检测到其中一个ALS基因发生突变。采用基因同源克隆和直接 PCR产物测序是检测抗性播娘蒿突变位点的主要手段。
基因同源克隆需要将目的基因与载体连接，然后转入感受态细胞，活化、培养、检 测，再送测序公司测序，最后进行序列分析，确定基因的突变情况。这种方法费时、费钱、效 率低。
采用PCR产物直接测序，虽然得到测序结果速度快，但是测序图容易出现杂峰和套 峰，实验的准确性受到影响。
酶切扩增多态性序列(AleavedAmplifiedPolymorphicSequences,CAPS)是根 据已知基因序列设计特异引物，需检测的突变位点被包含在某种限制性内切酶的酶切识别 位点之内，然后选择合适限制性内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切图谱来检测突变位点 的一种技术。
衍生酶切扩增多态性序列(DerivedCleavedAmplifiedPolymorphic Sequence,dCAPS)是通过在引物中导入错配碱基使扩增序列产生酶切位点的变相的CAPS技 术。
上述两种技术具有操作简便(用琼脂糖凝胶电泳分析)、DNA用量少、结果准确、检 测效率高、成本低廉等优点，已被广泛应用于白菜、茶树、西瓜等分子标记育种研究中。
但是，将上述两种技术用在抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的检测中尚未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿专用引物，该 专用引物特异性强，可直接用于抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的鉴定。
为了实现第一个目标，本发明采用如下的技术方案：
鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿专用引物，其特征在于，包括6对引物，引物的 序列见表1：
表1引物的序列
本发明的第二个目的在于提供一种利用上述专用引物鉴定抗ALS抑制剂类除草剂 的播娘蒿种群的方法，该鉴定方法能够快速、准确鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的靶 标基因的突变位点及突变氨基酸类型。
为了实现第二个目标，本发明采用如下的技术方案：
一种鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、DNA提取：对待测种群单株叶片提取基因组DNA；
(2)、PCR扩增：以待测材料的基因组DNA为模板，分别用表1中的6对引物进行PCR扩 增；
(3)酶切：用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；
(4)电泳：对酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。
所述的鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，在步骤(2)中， PCR反应体系如下：
其中，引物F和引物R的浓度均为10μM。
所述的鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，在步骤(2)中，采 用的PCR条件为：预变性94℃3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；最 后72℃延伸10min。
所述的鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，在步骤(3)中，不 同引物扩增的PCR产物从表2中选择对应的限制性内切酶进行酶切：
表2不同PCR产物对应的限制性内切酶
所述的鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，其特征在于，在步骤(3)中，
ScaI-HF与SpeI的酶切体系如下：
BsaI与HpyCH4IV酶切体系如下：
NsiI酶切体系如下：
MfeI酶切体系如下：
。
本发明的有益之处在于：
(一)、本发明设计的专用引物，可直接用于抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的鉴 定，相对同源克隆及PCR产物检测基因突变位点的方法，操作简单，成本低廉，重复性好，结 果准确；
(二)、本发明提供的利用专用引物鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，大 大缩短了鉴定抗性播娘蒿材料的时间，只需2.5h就可得到准确的鉴定结果，提高了工作效 率；
(三)、本发明提供的利用专用引物鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿的方法，对 于制定有效防治抗性播娘蒿的措施具有重要理论参考价值和实效性。
附图说明
图1是1号材料的酶切图，M为DL-2000，1为49号3单株混样，2-7为1号6个单株材料；
图2(a)是4号材料的酶切图，M为DL-2000，1为49号3单株混样，2-7为4号6个单株材 料；
图2(b)是129号材料的酶切图，M为DL-2000，1为49号3单株混样，2-6为129号材料5 个单株；
图3是97号材料的酶切图，M为DL-2000，1为49号3单株混样，2-8为97号7个单株材 料；
图4是98号材料的酶切图，M为DL-2000，1为49号3单株混样，2-12为98号11个单株 材料；
图5是118-1号材料的酶切图，M为DL-2000，1为49号3单株混样，2-12为118-1号的 11个单株材料；
图6(a)是118-2号材料的酶切图，M为DL-2000，1为49号3单株混样，2-6为118-2号 的5个单株材料；
图6(b)是143号材料的酶切图，M为DL-2000，1为49号3单株混样，2-5为143号的4个 单株材料。
具体实施方式
若未特别指出，以下列举的实施例所采用的技术手段均为分子生物学领域常规方 法。
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
第一部分：开发专用引物
一、实验材料
供试播娘蒿种群均采自河北省小麦田或荒地，其中，
(1)华店乡种群(49号)采自荒地，作为敏感种群；
(2)抗性种群为铜冶镇种群(1号)、宋曹镇种群(4号)、白神首种群(97号)、东汪镇 种群(98号)、屯庄营种群(118-1号)、屯庄营种群(118-2号)、蒲阳镇种群(129号)和定兴镇 种群(143号)。
上述种群均采自施用过苯磺隆的小麦田。
采用盆栽法测定抗性种群对苯磺隆的抗性水平。测定结果表明，上述抗性种群对 苯磺隆均表现出高抗水平。
本发明涉及的ALS抑制剂类除草剂包括：磺酰脲类除草剂、咪唑啉酮类除草剂、嘧 啶硫代苯甲酸酯类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂和黄酰胺羰基三唑啉酮类除草剂。
二、提取基因组DNA
随机选择49号种群3棵单株混样，1号种群6棵单株，4号种群6棵单株，97号种群7棵 单株，98号种群11棵单株，118-1号种群10棵单株，118-2号种群5棵单株，129号种群5棵单 株，143号种群4棵单株，采用全式金DNA提取试剂盒对上述9个播娘蒿种群的单株叶片提取 基因组DNA。
提取基因组DNA的具体过程如下：
(1)取新鲜播娘蒿叶片0.1g，研钵内加入液氮充分研磨至粉末，然后转入1.5mL灭 菌离心管；
(2)加入250μL溶液RB1，振荡均匀；
(3)加入30μL10％SDS、15μLRNaseA到步骤(2)中离心管内，充分混匀；
(4)55℃水浴15min；
(5)12000rpm离心5min，轻轻吸取上清于另一干净的离心管内；
(6)加入100μL溶液PB1，充分混匀，冰浴5min，12000rpm离心5min；
(7)轻轻吸取上清液于另一干净离心管中，加入375μL溶液BB1，充分混匀；
(8)将混合液移入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃流出液；
(9)加入500μLCB1，12000rpm离心30s，弃流出液；
(10)加入500μLWB1，12000rpm离心30s，弃流出液；
(11)重复步骤(10)1次；
(12)将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱中央加入50μL60℃预热的EB，室温静 置1min，然后12000rpm离心1min，洗脱DNA。
三、设计引物
根据抗性播娘蒿ALS基因中与抗性产生有关的不同突变位点及突变氨基酸类型， 设计一对引物进行PCR扩增，使扩增产物产生不同的酶切位点。
该设计得到的引物的基因序列如下：
F:5’-CGCTCCTCTCCTGAAGCTCACCA-3’；
R:5’-CAAACAAACAGCAGTAGCGTCTGAAG-3’。
四、测序
扩增ALS基因编码区全长，胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选、测序。
五、比对基因序列
将所得播娘蒿ALS编码区序列与拟南芥ALS基因序列进行比对。序列分析发现：
(1)、抗性播娘蒿1号材料ALS基因的第376位氨基酸由天冬氨酸(D)突变成了谷氨 酸(E)；
(2)、抗性播娘蒿4号材料和129号材料ALS基因的第574位氨基酸由色氨酸(W)突变 成了亮氨酸(L)；
(3)、抗性播娘蒿118-1号材料ALS基因的第197位氨基酸由脯氨酸(P)突变成了亮 氨酸(L)；
(4)、抗性播娘蒿118-2号材料与143号材料ALS基因的第197位氨基酸由脯氨酸(P) 突变成了苏氨酸(T)；
(5)、抗性播娘蒿97号材料ALS基因的第197位氨基酸由脯氨酸(P)突变成了丝氨酸 (S)；
(6)、抗性播娘蒿98号材料ALS基因的第197位氨基酸由脯氨酸(P)突变成了组氨酸 (H)，第199位氨基酸由精氨酸(R)突变成了亮氨酸(L)。
六、设计专用引物
(1)、在1号材料ALS基因的第376位氨基酸及4号材料和129号材料ALS基因的第574 位氨基酸两端采用Primer5.0设计CAPS引物；
(2)、根据97号材料、98号材料、118-1号材料、118-2号材料和143号材料ALS基因的 第197位或第199位氨基酸突变情况，以敏感材料49号相应位置的氨基酸序列为对照，采用 在线软件dCAPSfinder2.0设计dCAPS引物。
最终设计得到的专用引物共有6对，它们的序列见表1：
表1引物的序列
第二部分：鉴定抗ALS抑制剂类除草剂的播娘蒿
一、DNA提取
对敏感材料和抗性材料的单株叶片提取基因组DNA。
供试播娘蒿种群均采自河北省小麦田或荒地，其中，
(1)华店乡种群(49号)采自荒地，作为敏感种群；
(2)抗性种群为铜冶镇种群(1号)、宋曹镇种群(4号)、白神首种群(97号)、东汪镇 种群(98号)、屯庄营种群(118-1号)、屯庄营种群(118-2号)、蒲阳镇种群(129号)和定兴镇 种群(143号)。
二、PCR扩增
分别用表1中所列6对引物扩增播娘蒿抗性材料及49号敏感材料的目的DNA片段， PCR反应体系如下：
采用的PCR条件为：预变性94℃3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34 个循环；最后72℃延伸10min。
三、酶切
用限制性内切酶对PCR产物进行酶切。不同引物扩增的PCR产物从表2中选择对应 的限制性内切酶进行酶切：
表2不同PCR产物对应的限制性内切酶
ScaI-HF与SpeI的酶切体系如下：
BsaI与HpyCH4IV酶切体系如下：
NsiI酶切体系如下：
MfeI酶切体系如下：
四、电泳
对酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，140V电泳80min。
实施例1
以FALS197L和RALS197L为引物，以第118-1号材料的目的DNA片段为模板，进行PCR 扩增，然后用ScaI-HF限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，最后对酶切产物进行2％琼脂 糖凝胶电泳检测。
参照图5，酶切图谱显示出了233bp和208bp长度的两条条带(实际上还产生了一条 25bp长度的条带，但是该长度的条带电泳时跑到胶外，故不可见)。
说明播娘蒿ALS197位氨基酸由脯氨酸(P)突变为了亮氨酸(L)。
我们用同样的方法对剩下的材料做了同样的检测，这些材料的酶切图谱均只有一 条233bp长度的条带，说明这些材料的ALS197位氨基酸没有由P突变为L。
验证：
我们对第118-1号材料的PCR产物进行了基因测序，其序列见SEQ.ALS197L。
我们对第49号材料的PCR产物也进行了基因测序，其序列与前者存在一个碱基的 差异，第49号材料的PCR产物的第28位碱基为C，而第118-1号材料的PCR产物的第28位碱基 为T。
因此，在第118-1号材料的PCR产物序列中存在唯一一个ScaI-HF限制性内切酶的 酶切位点，即AGT^ACT，而在第49号材料的PCR产物序列中没有。
结论：本发明的方法能够准确、快速鉴定出播娘蒿是否具有抗性。
实施例2
以FALS197S和RALS197S为引物，以第97号材料的目的DNA片段为模板，进行PCR扩 增，然后用BsaI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，最后对酶切产物进行2％琼脂糖凝 胶电泳检测。
参照图3，酶切图谱显示出了233bp和204bp长度的两条条带(实际上还产生了一条 29bp长度的条带，但是该长度的条带电泳时跑到胶外，故不可见)。
说明播娘蒿ALS197位氨基酸由脯氨酸(P)突变为了丝氨酸(S)。
我们用同样的方法对剩下的材料做了同样的检测，这些材料的酶切图谱都只有一 条233bp长度的条带，说明这些材料的ALS197位氨基酸没有由P突变为了S。
验证：
我们对第97号材料的PCR产物进行了基因测序，其序列见SEQ.ALS197S。
我们对第49号材料的PCR产物也进行了基因测序，其序列与前者存在一个碱基的 差异，第49号材料的PCR产物的第27位碱基为C，而第97号材料的PCR产物的第27位碱基为T。
因此，在第97号材料的PCR产物序列中存在唯一一个BsaI限制性内切酶的酶切位 点，即GGTCTC(N)1^，而在第49号材料的PCR产物序列中没有。
结论：本发明的方法能够准确、快速鉴定出播娘蒿是否具有抗性。
实施例3
以FALS197T和RALS197T为引物，以第118-2号材料的目的DNA片段为模板，进行PCR 扩增，然后用SpeI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，最后对酶切产物进行2％琼脂糖 凝胶电泳检测。
参照图6(a)，酶切图谱显示出了191bp和158bp长度的两条条带(实际上还产生了 一条33bp长度的条带，但是该长度的条带电泳时跑到胶外，故不可见)。
说明播娘蒿ALS197位氨基酸由脯氨酸(P)突变为了苏氨酸(T)。
我们用同样的方法对剩下的材料做了同样的检测，其中，第143号材料的酶切图谱 (参照图6(b))显示出了191bp和158bp长度的两条条带，说明播娘蒿ALS197位氨基酸由P突 变为了T；而其他材料的酶切图谱均只产生一条191bp长度的条带，说明这些材料的ALS197 位氨基酸没有由P突变为T。
验证：
我们对第118-2号材料和第143号材料的PCR产物均进行了基因测序，二者的序列 相同，序列见SEQ.ALS197T。
我们对第49号材料的PCR产物也进行了基因测序，其序列与前者存在一个碱基的 差异，第49号材料的PCR产物的第158位碱基为C，而第118-2号材料和第143号材料的PCR产 物的第158位碱基为A。
因此，在第118-2号材料和第143号材料的PCR产物序列中存在唯一一个SpeI限制 性内切酶的酶切位点，即A^CTAGT，而在第49号材料的PCR产物序列中没有。
结论：本发明的方法能够准确、快速鉴定出播娘蒿是否具有抗性。
实施例4
以FALS197H199L和RALS197H199L为引物，以第98号材料的目的DNA片段为模板，进 行PCR扩增，然后用NsiI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，最后对酶切产物进行2％琼 脂糖凝胶电泳检测。
参照图4，酶切图谱显示出了233bp和205bp长度的两条条带(实际上还产生了一条 28bp长度的条带，但是该长度的条带电泳时跑到胶外，故不可见)。
说明播娘蒿ALS197位氨基酸由脯氨酸(P)突变为组氨酸(H)，同时，第199位氨基酸 由精氨酸(R)突变为亮氨酸(L)。
我们用同样的方法对剩下的材料做了同样的检测，这些材料的酶切图谱均只产生 一条233p长度的条带，说明这些材料的ALS197位氨基酸和ALS199位氨基酸没有同时发生突 变。
验证：
我们对第98号材料的PCR产物进行了基因测序，其序列见SEQ.197H199L。
我们对第49号材料的PCR产物也进行了基因测序，其序列与前者存在两个碱基的 差异，第49号材料的PCR产物的第24位碱基为G、第26位碱基为C，而第98号材料的PCR产物的 第24位碱基为A、第26位碱基为G。
因此，在第98号材料的PCR产物序列中存在唯一一个NsiI限制性内切酶的酶切位 点，即ATGCA^T，而在第49号材料的PCR产物序列中没有。
结论：本发明的方法能够准确、快速鉴定出播娘蒿是否具有抗性。
实施例5
以FALS376E和RALS376E为引物，以第1号材料的目的DNA片段为模板，进行PCR扩 增，然后用HpyCH4IV限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，最后对酶切产物进行2％琼脂 糖凝胶电泳检测。
参照图1，酶切图谱显示出了80bp左右和158bp长度的两条条带(实际上产生了 77bp、81bp和158bp长度的三条条带，由于77bp和81bp长度的条带在琼脂糖凝胶电泳时分离 不开，所以酶切图谱上显示一条粗的条带，即80bp左右长度的条带)。
说明播娘蒿ALS376位氨基酸由天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)。
我们用同样的方法对剩下的材料做了同样的检测，这些材料的酶切图谱均只产生 一条158bp长度的条带，说明这些材料的ALS376位氨基酸没有发生突变。
验证：
我们对第1号材料的PCR产物进行了基因测序，其序列见SEQ.ALS376E。
我们对第49号材料的PCR产物也进行了基因测序，其序列与前者存在一个碱基的 差异，第49号材料的PCR产物的第77位碱基为T，而第1号材料的PCR产物的第77位碱基为A。
因此，在第1号材料的PCR产物序列中存在唯一一个HpyCH4IV限制性内切酶的酶切 位点，即A^CGT，而在第49号材料的PCR产物序列中没有。
结论：本发明的方法能够准确、快速鉴定出播娘蒿是否具有抗性。
实施例6
以FALS574L和RALS574L为引物，以第4号材料的目的DNA片段为模板，进行PCR扩 增，然后用MfeI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，最后对酶切产物进行2％琼脂糖凝 胶电泳检测。
参照图2(a)，酶切图谱显示出了145bp、84bp和61bp长度的三条条带。
说明播娘蒿ALS376位氨基酸由色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)。
我们用同样的方法对剩下的材料做了同样的检测，其中，第129号材料的酶切图谱 (参照图2(b))显示出了145bp、84bp和61bp长度的三条条带，说明说明播娘蒿ALS376位氨基 酸由色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；而其他材料的酶切图谱均只产生一条145bp长度的条带， 说明ALS574位氨基酸没有发生突变。
验证：
我们对第4号材料和第129号材料的PCR产物都进行了基因测序，二者的序列相同， 序列见SEQ.ALS574L。
我们对第49号材料的PCR产物也进行了基因测序，其序列与前者存在一个碱基的 差异，第49号材料的PCR产物的第88位碱基为G，而第4号材料和第129号材料的PCR产物的第 88位碱基为T。
因此，在第4号材料和第129号材料的PCR产物序列中均存在唯一一个MfeI限制性 内切酶的酶切位点，即C^AATTG，而在第49号材料的PCR产物序列中没有。
结论：本发明的方法能够准确、快速鉴定出播娘蒿是否具有抗性。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变 换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。