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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610126969.2 (22)申请日 2016.03.07 C12Q 1/48(2006.01) C12Q 1/32(2006.01) (71)申请人 王爰 地址 154601 黑龙江省七台河市妇幼保健院 (72)发明人 王爰 李建营 甘宜梧 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 张世静 (54) 发明名称 一种稳定的酶法血清镁离子检测试剂盒 (57) 摘要 本发明提供了一种稳定的酶法血清镁离子检 测试剂盒， 通过使用丙三醇、 D- 吡喃葡萄糖、 聚乙 二醇和葡聚糖物质， 通过不同比例的组合形成一 种具。
2、有较强隔离保护作用的膜物质， 达到了隔离 保护酶的目的， 当试剂 R1 和 R2 混合后， 被隔离的 酶被释放出来， 进而和底物发生反应， 达到了让试 剂长期储存的目的， 解决了酶在试剂中不稳定的 问题。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 105671127 A 2016.06.15 CN 105671127 A 1.一种稳定的酶法血清镁离子检测试剂盒， 其特征在于， 包括等量试剂R1和试剂R2， 其 中试剂R1组成为： 甘氨酸-盐酸缓冲液0.1mol/L NADH25mmol/L 葡萄糖0.1-0.。
3、5g/L 腺苷三磷酸2mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/L CTAB5mmol/L 三氯甲烷0.1ml/L 丙三醇0.1-0.75ml/L 聚乙二醇0.3-0.5g/L 葡聚糖1-2.34g/L D-吡喃葡萄糖 0.05-0.1g/L； 试剂R2组成为： TOOS缓冲液0.1mol/L 丙氨酸脱氢酶1000-5000U/L 己糖激酶2500-4000U/L 丙酮酸激酶 3000U/L 聚乙二醇1-1.5g/L 葡聚糖0.7-1.5g/L D-吡喃葡萄糖0.25-0.5g/L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105671127 A 2 一种稳定的酶法血清镁离子检测试剂盒 技术领域 。
4、0001 本发明涉及临床体外检测试剂技术领域， 特别涉及到利用酶法检测血清中的血清 镁离子含量的试剂盒。 背景技术 0002 血清镁离子检测方法主要有以下几种： 离子层析法、 酶法、 比色法、 同位素法、 荧光 法等。 0003 血清镁离子最具有权威的检测方法是同位素法， 但是同位素法检测血清镁离子的 设备较为复杂， 价格较为昂贵， 不适合自动分析。 0004 比色法主要包括达旦黄法， 钙镁试剂法， 偶氮法和甲基麝香草酚蓝法。 相对于同位 素法， 比色法价格便宜， 操作简单， 便于常规实验操作。 但是对仪器损伤较大， 不能排除胆红 素干扰的问题， 稳定性也极差。 0005 离子色谱法测定血清镁。
5、离子， 操作复杂。 需要前期对样本进行有效处理， 但是处理 不慎就会出现结果不准确， 受人为影响因素较大， 不适于自动化分析。 0006 酶法检测血清镁离子在近一段时间来有了很大突破， 也取得了飞跃式进展。 酶法 检测结果较为准确， 可用于自动化分析仪， 相比于同位素法， 酶法价格便宜， 能够满足医院 检验和实验室常规操作。 但是， 同样也存在一定问题， 酶法检测血清镁离子是通过酶促反应 进行的， 通过底物引起一定波长下的吸光度变化， 间接计算出血清镁离子含量。 但是酶法由 于其中有很多酶类参与生化反应， 其稳定性也是试剂成败的关键， 目前市场上流通的酶法 血清镁离子检测诊断试剂盒， 均做不到。
6、在保证酶活的基础上， 延长试剂储存时间， 因此试剂 极易受到温度的影响和破坏。 发明内容 0007 针对以上技术问题， 本发明提供了一种稳定的酶法血清镁离子检测诊断试剂盒， 通过一定的保护剂对试剂中的不同酶类加以保护， 减少或抑制酶发生反应， 在保证酶活的 基础上， 延长了试剂的储存和使用时间， 本发明试剂盒主要是解决了酶法血清镁离子试剂 不稳定以及抗胆红素干扰问题。 0008 本发明的检测原理如下： 说明书 1/8 页 3 CN 105671127 A 3 该方法是通过还原型辅酶的变化来检测镁离子的变化， 通过反应原理不难发现主要是 镁离子激活己糖激酶， 反应生成腺苷二磷酸， 腺苷二磷酸和烯。
7、醇式丙酮酸在丙酮酸激酶作 用下生成丙酮酸， 丙酮酸在氨离子和还原型辅酶存在条件下， 通过丙氨酸脱氢酶氧化作用 生成丙酮酸， L-丙氨酸和还原型辅酶。 还原性辅酶在340nm波长有最大吸光值， 通过监测 340nm处吸光度变化， 从而计算出还原型辅酶含量间接的计算出镁离子的含量。 0009 应用本发明试剂盒测定血清中镁离子含量方法如下： 检测波长为340nm， 样本量： 试剂R1： 试剂R2=10ul： 150ul： 150ul。 0010 本发明是一种稳定的血清镁离子检测诊断试剂盒， 本发明试剂盒是由试剂R1和试 剂R2两种试剂组成的液体型双试剂检测诊断试剂， 其中试剂R1组成为： 甘氨酸-盐。
8、酸缓冲液0.1mol/L NADH25mmol/L 葡萄糖 0.1-0.5g/L 腺苷三磷酸 2mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/L CTAB5mmol/L 三氯甲烷0.1ml/L 丙三醇0.1-0.75ml/L 聚乙二醇0.3-0.5g/L 葡聚糖1-2.34g/L D-吡喃葡萄糖 0.05-0.1g/L； 试剂R2组成为： TOOS缓冲液0.1mol/L 丙氨酸脱氢酶1000-5000U/L 己糖激酶2500-4000U/L 丙酮酸激酶3000U/L 聚乙二醇1-1.5g/L 葡聚糖0.7-1.5g/L D-吡喃葡萄糖0.25-0.5g/L。 0011 本发明提供的稳定的血清镁离。
9、子监测诊断试剂盒中， 甘氨酸-盐酸缓冲液主要是 说明书 2/8 页 4 CN 105671127 A 4 缓冲作用， 保证反应时外环境的稳定， 致使检测结果不会受到波动和影响。 NADH还原型辅酶 在酶促反应中生成不同形式的辅酶， 引起吸光度变化。 葡萄糖、 腺苷三磷酸以及磷酸烯醇式 丙酮酸是用作反应底物， 参与酶促反应。 CTAB十六烷基三甲基溴化铵作为反应助溶剂、 加速 剂， 保证良好的配位性， 提供铵离子。 三氯甲烷用于清除胆红素在检测时引起的干扰。 丙三 醇、 聚乙二醇、 葡聚糖和D-吡喃葡萄糖通过不同配比组合形成一定的保护膜， 在一定条件下 将酶包裹起来， 抑制反应， 但是在当促溶剂。
10、存在的某一条件下， 将包裹的酶释放出来参与反 应。 TOOS缓冲液主要是缓冲作用， 保证反应时外环境的稳定， 致使检测结果不会受到波动和 影响。 丙氨酸脱氢酶作用粗话丙酮酸脱氢反应生成丙氨酸。 己糖激酶催化葡萄糖生成葡萄 糖-6-P。 丙酮酸激酶催化烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。 0012 本发明可以应用到迪瑞、 迈瑞、 日立、 东芝等系列的全自动化分析仪中进行自动化 检测。 0013 应用本发明进行体外样本诊断检测时， 操作方法如下， 设置波长为340nm， 终点法， 样本量： 试剂R1： 试剂R2=10ul： 150ul： 150ul。 样本针吸取样本后于试剂R1中进行孵育， 以保 证反应环境外。
11、界条件的稳定， 然后读取吸光光度值为A1， 加入试剂R2后反应一定时间读 取A2。 血清镁离子含量= （A2-A1） 标准物质浓度。 0014 和市场目前流通的酶法血清镁离子检测试剂盒相比， 本发明稳定性好， 抗胆红素 能力强， 重复性好， 操作简便， 便于储存和运输。 适用于全自动生化分析仪， 临床使用价值较 大。 附图说明 0015 图1为对照试剂盒与本发明相关性图。 具体实施方式 0016 我们将结合图表、 实施例对本发明进行说明。 0017 实施例1 本发明在具体实施中， 所述的试剂R1为： 甘氨酸-盐酸缓冲液0.1mol/L NADH 25mmol/L 葡萄糖0.5g/L 腺苷三磷酸。
12、2mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸2mmol/L CTAB 5mmol/L 三氯甲烷0.1ml/L 丙三醇0.75ml/L 聚乙二醇0.5g/L 葡聚糖2.34g/L D-吡喃葡萄糖0.1g/L； 试剂R2组成为： TOOS缓冲液0.1mol/L 说明书 3/8 页 5 CN 105671127 A 5 丙氨酸脱氢酶5000U/L 己糖激酶2500U/L 丙酮酸激酶3000U/L 聚乙二醇1.5g/L 葡聚糖0.7g/L D-吡喃葡萄糖0.5g/L 实施例2 本发明在具体实施中， 所述的试剂R1为： 甘氨酸-盐酸缓冲液0.1mol/L NADH 25mmol/L 葡萄糖0.25g/L 腺苷三磷酸。
13、2mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸2mmol/L CTAB 10mmol/L 三氯甲烷0.1ml/L 丙三醇 1ml/L 聚乙二醇0.75g/L 葡聚糖1.75g/L D-吡喃葡萄糖0.2g/L 试剂R2组成为： TOOS缓冲液 0.1mol/L 丙氨酸脱氢酶5000U/L 己糖激酶2500U/L 丙酮酸激酶3000U/L 聚乙二醇1.5g/L 葡聚糖0.8g/L D-吡喃葡萄糖0.2g/L 实施例3 本发明在具体实施中， 所述的试剂R1为： 甘氨酸-盐酸缓冲液0.1mol/L NADH 25mmol/L 葡萄糖0.1g/L 腺苷三磷酸2mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸2mmol/L CTAB 5。
14、mmol/L 三氯甲烷0.1ml/L 丙三醇0.55ml/L 聚乙二醇0.25g/L 葡聚糖2g/L 说明书 4/8 页 6 CN 105671127 A 6 D-吡喃葡萄糖0.1g/L 试剂R2组成为： TOOS缓冲液 0.1mol/L 丙氨酸脱氢酶5000U/L 己糖激酶2500U/L 丙酮酸激酶3000U/L 聚乙二醇2.5g/L 葡聚糖1g/L D-吡喃葡萄糖0.5g/L 本发明试剂盒性能检测试验： 稳定性试验检测： 运用本发明实试剂盒 （实施例1配方配制） 和目前市场上流通的试剂盒进行对比， 校准 液和质控品分别是朗道926UN和1005UN， 使用仪器为全自动生化分析仪BS-800。
15、， 参数设置如 下， 波长为340nm， 反应方向为反方向， 读数点设置为14-16点和31-33点， 样本量： 试剂R1： 试 剂R2=10ul： 150ul： 150ul， 仪器为BS-800。 检测结果如表1所示： 表1本发明试剂与对照试剂稳定性检测结果 说明书 5/8 页 7 CN 105671127 A 7 备注:质控品1005UN靶值为0.89mmol/L 通过本实验， 我们发现本发明试剂盒在4条件下历时4个月之后几乎没有发生任何变 化， 但是对照试剂在4度条件下第60天时已经降低了10%， 应为30-60天没有详尽的数据不 能推算出对照试剂盒是30天之后的哪天开始衰减的； 37条。
16、件下我们发现本发明试剂盒对 照试剂盒历经120天后均有衰减， 但是本发明试剂盒衰减不足5%， 对照试剂盒却超过了10%； 45度条件下本发明试剂盒在第30天时衰减已经超过了10%， 对照试剂盒在第9天时衰减超过 了10%。 综合不同温度下的检测结果， 我们发现本发明试剂盒和市场上目前流通的试剂盒有 很强优越性， 这位本发明试剂盒投入市场奠定了一定基础。 0018 胆红素干扰实验 酶法血清镁离子检测试剂盒极易受到胆红素影响， 引起结果偏差。 购买纯品胆红素， 用 1005UN质控品配制成含有不同浓度的胆红素样本。 最高浓度为200uM， 其余依次为150uM、 说明书 6/8 页 8 CN 10。
17、5671127 A 8 100uM、 75uM、 50uM、 25uM和0uM留个梯度。 采用本发明试剂盒 （实施例2配方配制） 和对照 试剂盒， 分别检测二者浓度， 1005UN质控品靶值为0.89mM。 检测仪器为BS-800， 仪器参数设 置和操作不在重述。 检测结果如表2所示： 表2本发明试剂盒与对照试剂盒抗干扰实验结果 备注： 100UN质控品靶值为0.89mM 通过表2我们不难发现， 目前市场上流通的血清镁酶法检测试剂盒， 在胆红素含量50uM 时， 检测结果偏于靶值20%左右， 当胆红素高达150uM甚至更高时， 我们发现对照试剂盒是不 能够用来检测的， 其监测结果不仅仅是影响了。
18、临床判断， 而且容易误导医生对病人的病情 做出误诊。 相比二言本发明试剂盒在样本胆红素含量为150uM时对检测结果不会产生任何 误判， 但是当胆红素浓度为200uM结果偏低10%左右。 人胆红素含量一般在0-20uM左右， 但是 当肝脏， 出现病变时， 其胆红素含量远高于这个水平， 对照试剂不能准确地测出该类病人的 血清镁离子含量， 但是本发明试剂盒完全可以胜任这一工作。 0019 临床样本检测试验 本发明试剂盒同对比试剂盒对随进N=40个样本进行测试， 测试结果以表格的形式在下 表进行体现， 通过该表格3记录的数值， 进而计算出， 本发明试剂盒与市场流通的试剂盒的 相关性。 本发明试剂盒采用。
19、实施例3配方进行检测。 检测结果如表3所示： 表3本发明试剂盒与对照试剂盒临床样本检测结果 说明书 7/8 页 9 CN 105671127 A 9 对照试剂盒与本发明试剂盒临床相关性图谱如图1所示。 结合表3和图1说明本发明试 剂盒与对照试剂盒在检测普通临床样本时具有良好的相关性， 相关系数r=0.9995。 0020 综上所述， 本发明试剂盒通过了临床验证， 在检测40个临床样本时， 对照试剂盒与 本发明试剂盒相关性较高， 但是在稳定性方面本发明试剂盒远优于对照试剂盒， 为本发明 试剂盒投入市场奠定了基础。 在对待胆红素干扰性能上， 本发明一种稳定的酶法血清胆红 素检测试剂盒能够检测含量150uM胆红素的样本， 而且保证结果的准确性。 本发明试剂盒稳 定性好， 成本较低， 对仪器不会产生腐蚀影响， 操作方便， 对环境几乎没有污染， 可行性强， 经济和社会效益巨大， 对于以后开发市场， 扩大市场占有率提供坚强的技术支持和科学支 持。 说明书 8/8 页 10 CN 105671127 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 105671127 A 11 。