缺失E3区复制完全型重组腺病毒4型载体系统的构建及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610077764.X (22)申请日 2016.02.03 C12N 15/861(2006.01) C12N 7/01(2006.01) (71)申请人 河南农业大学 地址 450002 河南省郑州市金水区文化路 95 号 (72)发明人 赵军 王川庆 高冬生 李永涛 杨霞 刘红英 常洪涛 陈陆 王新卫 王永生 郑鹿平 姚惠霞 黄慧敏 (74)专利代理机构 郑州大通专利商标代理有限 公司 41111 代理人 陈大通 (54) 发明名称 缺失E3区复制完全型重组腺病毒4型载体系 统的构建及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种缺失。

2、 E3 区复制完全型重组 腺病毒 4 型载体系统的构建及其应用。本发明提 供的系统包括一个骨架质粒、 一个穿梭质粒和一 个包装细胞系， 所述的骨架质粒含有腺病毒 AdV4 基因组左侧 1-26569bp 的片段， 所述的腺病毒 AdV4 基因组具有缺失基因， 缺失基因为 E3 区基 因 ； 所述的穿梭质粒含有用于插入目的基因的克 隆位点以及腺病毒 AdV4 基因组右侧反向重复序 列 ； 所述的包装细胞系为 HEK-293 细胞系。由于 人源腺病毒 AdV4 基因组安全可靠， 因此在其可以 感染的宿主中有望被用作基因治疗及重组疫苗使 用。 即本发明产生的重组AdV4腺病毒具有安全广 泛的应用。 。

3、(51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表9页 附图7页 CN 105567736 A 2016.05.11 CN 105567736 A 1.一种缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 包括一个骨架质粒、 一个穿 梭质粒和一个包装细胞系， 其特征在于： 所述骨架质粒含有腺病毒AdV4基因组左侧1-26569bp的片段； 所述穿梭质粒含有用于插入目的基因的克隆位点以及腺病毒AdV4基因组右侧反向重 复序列； 所述腺病毒AdV4基因组具有缺失基因， 缺失基因为E3区基因； 所述的包装细胞系为HEK-293细胞。

4、系， 细胞系来源于ATCC细胞库， 编号为CRL-1573TM。 2.根据权利要求1所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 其特征在 于： 所述的骨架质粒为pAd4FAST， 所述的骨架质粒pAd4FAST依次含有pBR322质粒的复制起 点、 氨苄青霉素的抗性基因和AdV4腺病毒基因组左侧1-26569bp的片段。 3.根据权利要求2所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 其特征在 于： 所述的穿梭质粒为pAd4FAST-Shuttle， 所述的穿梭质粒依次含有PBR322质粒的复制起 点、 卡那霉素的抗性基因、 AdV4基因组右侧反向重复序列、 用于与骨。

5、架质粒pAd4FAST发生同 源重组的右臂和左臂。 4.根据权利要求3所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 其特征在 于： 所述的骨架质粒pAd4FAST中， AdV4基因组左侧末端添加限制性内切酶PacI位点， 右侧末 端添加限制性内切酶SpeI位点。 5.根据权利要求4所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 其特征在 于： 所述的穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle中， 在能够与骨架质粒pAd4FAST发生同源重组的右 臂和左臂序列之间含有一个限制性内切酶Swal的识别位点ATTTAAAT， 并在AdV4基因右侧反 向重复序列右侧末端添加一个限制性。

6、内切酶Pacl的识别位点TTAATTAA。 6.权利要求15任一项所述的载体系统用于制备重组腺病毒的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105567736 A 2 缺失E3区复制完全型重组腺病毒4型载体系统的构建及其 应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种缺失E3 区复制完全型重组腺病毒4型(AdV4)载体系统的构建及其应用。 技术背景 0002 腺病毒5型重组系统是目前使用最广泛的腺病毒系统， 自从该系统于1998年被构 建成功以来， 由于腺病毒5型自身的优势以及该系统使用的方便性， 已经被广泛地应用于体 外基因传导、 体内接种疫苗。

7、和基因治疗等各个领域。 但是由于腺病毒5型对人体具有一定的 危害， 不能被直接作为活载体疫苗使用， 只能被制备成复制缺陷型(缺失E1区)疫苗， 那么在 临床使用中只能产生短暂而有限的抗原表达， 最终产生的抗体也相应不足。 0003 近些年的研究还发现， 机体中针对腺病毒5型的预存免疫， 大大降低了腺病毒5型 载体的应用效果， 流行病学调查显示， 人体感染腺病毒5型的情况十分普遍， 在西方发达国 家， 腺病毒5型血清阳性率约为6070； 而在非洲和西南亚地区， 腺病毒5型血清阳性率高 达98； 在中国， 腺病毒5型血清阳性率也达到了72， 以上情况使腺病毒5型病毒载体的使 用更加受到了阻碍。 0。

8、004 腺病毒4型(AdV4)属于人源腺病毒E亚群中唯一的一个血清型， 该病毒早在70年代 已经作为活载体疫苗被军队广泛的应用于ARD的预防， 使与腺病毒相关的呼吸道疾病得到 了有效的遏制， 且免疫后未见不良反应。 1999年， 疫苗停止供应后， 新兵训练中心检测发现 呼吸道感染率明显上升。 美国开始开发新的AdV4-AdV7联合疫苗， 并于2011年获得FDA批准 启用， 再次有效降低了呼吸道感染疾病的发生。 因此， 腺病毒4型(AdV4)可以被制备成复制 完全型疫苗， 可以在机体内复制， 产生持续而丰富的抗原表达， 最终产生更高免疫效力的抗 体。 0005 另有研究表明， 腺病毒4型(Ad。

9、V4)同腺病毒5型病毒相比具有更高效的感染力， 能 够诱导更充分的先天免疫， 在机体存在针对腺病毒5型的抗体时， 如果先用腺病毒4型进行 初步免疫、 再用腺病毒5型加强免疫， 则会产生更多针对抗原的特异性细胞因子以及T淋巴 细胞， 这一结果显示， 联合使用腺病毒4型和腺病毒5型载体疫苗会取得更好的效果。 在中 国、 阿根廷、 美国、 埃及等地区的流行病学调查显示， 腺病毒4型在人体的感染率均较腺病毒 5型低， 这意味着在机体中针对腺病毒4型的预存免疫较腺病毒5型少， 这就使使用腺病毒4 型作为载体疫苗具有更多的优势。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种缺失E3区复制完全型重组腺病毒4型。

10、(AdV4E3Genome) 载体系统及其应用。 0007 本发明提供的载体系统包括1个骨架质粒、 1个穿梭质粒和1个包装细胞系； 所述骨 架质粒含有腺病毒AdV4基因组左侧1-26569bp的片段； 所述穿梭质粒含有用于插入目的基 说明书 1/8 页 3 CN 105567736 A 3 因的克隆位点以及腺病毒AdV4基因组右侧反向重复序列； 所述腺病毒AdV4基因组具有缺失 基因， 缺失基因为E3区基因； 所述的包装细胞系为HEK-293细胞系(ATCC， CRL-1573TM)。 0008 所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 所述的骨架质粒为 pAd4FAST， 所。

11、述的骨架质粒pAd4FAST依次含有pBR322质粒的复制起点、 氨苄青霉素的抗性 基因和AdV4基因组1-26569bp。 0009 所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 所述的穿梭质粒为 pAd4FAST-Shuttle， 所述的穿梭质粒依次含有PBR322质粒的复制起点、 卡那霉素的抗性基 因、 AdV4基因组右侧反向重复序列、 用于与骨架质粒pAd4FAST发生同源重组的右臂和左臂 (Rarm、 Larm)。 0010 所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 所述的骨架质粒 pAd4FAST中， AdV4基因组左侧末端添加限制性内切酶PacI位点，。

12、 右侧末端添加限制性内切 酶SpeI位点。 0011 所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统， 所述的穿梭质粒 pAd4FAST-Shuttle中， 在能够与骨架质粒pAd4FAST发生同源重组的右臂和左臂(Rarm、 Larm)序列之间含有一个限制性内切酶Swal的识别位点ATTTAAAT， 并在AdV4基因右侧反向 重复序列右侧末端添加一个限制性内切酶Pacl的识别位点TTAATTAA。 0012 所述的载体系统用于制备重组腺病毒的用途。 0013 利用本载体系统能够制备携带目的基因的重组AdV4腺病毒。 将目的基因克隆到穿 梭质粒pAd4FAST-Shuttle的克隆位点。

13、处， 将携带目的基因的穿梭质粒经限制性内切酶SwaI 酶切线性化后转化入含有骨架质粒pAd4FAST的大肠杆菌BJ5183菌株(美国Stratagene公 司)中， 在大肠杆菌BJ5183细胞内线性化的穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle与骨架质粒 pAd4FAST经过同源重组得到携带目的基因的腺病毒质粒。 该质粒经限制性内切酶PacI酶 切， 释放重组腺病毒基因组， 利用DNA转染方法将重组腺病毒基因组转染包装细胞系HEK- 293， 在包装细胞系内拯救得到携带目的基因的重组AdV4腺病毒。 起始得到的少量腺病毒可 以进一步用包装细胞扩增， 制备大量的重组病毒。 0014 在制备的重组腺。

14、病毒中， 除基因组含有部分外源序列(目的基因表达框)外， 基因 组其他部分以及病毒所有结构蛋白均源于人源腺病毒4型疫苗株(GenBank登录号： AY594254)。 0015 由于人源腺病毒AdV4基因组安全可靠， 因此在其可以感染的宿主中有望被用作基 因治疗以及重组疫苗使用。 附图说明 0016 图1为骨架质粒pAd4FAST的酶切鉴定图； 图中， 1表示 -EcoT14 digestDNA Marker； 2表示PacI和SpeI酶切后的pAd4FAST质粒； 3表示pAd4FAST质粒； 0017 图2为骨架质粒pAd4FAST的测序鉴定图； 图中， PacIsite中横线显示克隆标记。

15、位 点PacI； SpeIsite中横线显示克隆标记位点SpeI； AseIsite中横线显示克隆标记位点 AseI； 0018 图3为骨架质粒pAd4FAST的构建示意图； 0019 图4为载体pShuttle-1的酶切鉴定图； 图中， 1表示DL15000DNAMarker； 2表示 说明书 2/8 页 4 CN 105567736 A 4 pShuttle-1载体； 3-5依次表示经过PacI、 SwaI和SpeI酶切后的pShuttle-1载体； 6表示 250bpladderDNAMarker； 0020 图5为穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle的构建示意图； 0021 图6为。

16、穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle的酶切鉴定图； 图中， 1表示DL15000DNA Marker； 2表示pAd4FAST-Shuttle载体； 3-5表示依次为PacI、 SwaI和SpeI酶切后的 pAd4FAST-Shuttle载体； 0022 图7为携带目的基因的质粒pAd4FAST-Shuttle-EGFP的酶切鉴定图； 图中， 1表示 DL15000DNAMarker； 2表示pAd4FAST-Shuttle-EGFP载体； 3表示SwaI和SpeI酶切后的 pAd4FAST-Shuttle-EGFP(EGFP逆时针克隆)载体； 4表示SwaI和SpeI酶切后的pAd4FA。

17、ST- Shuttle-EGFP(EGFP顺时针克隆)载体； 0023 图8为重组质粒pAd4FAST-EGFP的酶切鉴定图； 0024 图9为骨架质粒pAd4FAST与携带目的基因的穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle-EGFP在 大肠杆菌BJ5183中重组的示意图； 0025 图10为拯救的P3代AdV4-EGFP病毒引起的致细胞病变效应(CPE)及荧光表达情况； 图中， a对应的横排图表示P3代AdV4-EGFP病毒感染HEK-293细胞后不同时间的病变情况； b 对应的横排图表示不同时间荧光蛋白的表达情况； 0026 图11为拯救的AdV4-EGFP病毒()与亲本病毒AdV4E3(。

18、)的生长曲线图。 具体实施方式 0027 在本发明的一个实施方案中， 本发明的骨架质粒含有腺病毒AdV4基因组左侧1- 26569bp的片段。 0028 在具体实施方案中， 所述的骨架质粒为pAd4FAST， 含有pBR322质粒的复制起点、 氨 苄青霉素的抗性基因和AdV4腺病毒基因组左侧1-26569bp的片段。 0029 在具体实施方案中， 所述骨架质粒pAd4FAST在AdV4基因组左侧末端添加限制性内 切酶PacI位点， 右侧末端添加SpeI位点。 0030 在本发明的一个实施方案中， 本发明的穿梭质粒为pAd4FAST-Shuttle， 依次含有 pBR322质粒的复制起点(Ori。

19、)、 卡那霉素的抗性基因(Kan)、 AdV4基因组右侧反向重复序列 (ITR)、 用于与骨架质粒pAd4FAST发生同源重组的右臂和左臂(Rarm、 Larm)(Larm在AdV4 (GenBank登录号： AY594254)基因组上的片段位置： Int-1000nt， Rarm在AdV4(GenBank登录 号： AY594254)基因组上的片段位置： 25833nt-27476nt)。 0031 在本发明的具体实施方案中， 所述穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle在能够与骨架质粒 pAd4FAST发生同源重组的左臂和右臂之间含有一个限制性内切酶SwaI的识别位点 (ATTTAAAT)。

20、， 在所述AdV4基因组右侧反向重复序列右侧末端添加有一个限制性内切酶PacI 的识别位点(TTAATTAA)。 0032 下面通过实施例对本发明进行更加详细的说明， 但本发明的内容并不限于以下具 体实施例。 0033 实施例1 0034 1.骨架质粒pAd4FAST的构建及电转化感受态细胞的制备 0035 (1)骨架质粒pAd4FAST的构建： 说明书 3/8 页 5 CN 105567736 A 5 0036 以pAdeasy-1载体(美国stratagene公司， GenBank登录号AY370909)为模板， 利 用引物P1： CCTTAATTAA(PacI)CATGC(SEQIDNO。

21、:1)和P2： GGACTAGA(SpeI)TCTAGTTTCG(SEQ IDNO:2)扩增其位置在27246-31123bp的片段(片段大小为3878bp)， 该片段含有pBR322复 制起点、 氨苄青霉素抗性基因等载体基本构成元件， 产物经PacI和SpeI酶切， 由DNA胶回收 试剂盒纯化回收， 得到产物1； 0037 扩增在标准的聚合酶链反应(PCR)体系中进行， 反应体系为50 l体系： 5PCR Buffer10uL， 模板10ng， 10mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)1 l， 上下游引物(25 M)各1 l， 高保真耐热DNA聚合酶1单位， ddH2O补足； 反应条件为： 。

22、98预变性2min， 扩增1个循环， 98 变性10s， 60退火15s， 68延伸10min补平末端， 扩增30个循环； 0038 以病毒基因组(人源腺病毒4型疫苗株， GenBank登录号为： AY594254)为模板， 引 物P3： CCTTAATTAA(PacI)CATCATCAATAATATAC(SEQIDNO:3)和P4： GGACTAGTAACACGCTGCT GT(SEQIDNO:4)扩增其1-13666bp的片段， 利用PacI和AseI进行酶切， 经DNA胶回收试剂盒 纯化回收， 得到产物2； 引物P5： GGACTAGTCTTCACGGACAGCGGT(SEQIDNO:5。

23、)和P6： GGACTAGT (SpeI)GAATTTCCTGGTACAC(SEQIDNO:6)扩增病毒基因组12686-26569bp的片段， 利用AseI 和SpeI进行酶切， 经DNA胶回收试剂盒纯化回收， 得到产物3， 产物2及产物3用到的限制性内 切酶AseI位点位于病毒基因组12686bp与13666bp之间； 0039 将步骤中产物1与步骤中的产物2、 产物3共同连接， 10 l连接体系： 10连 接缓冲液1 l， 3个片段各2 l， 1 lT4DNA连接酶(美国NEB公司， 400U/ l)， ddH2O2 l， 16 反应12小时， 得到连接产物A； 0040 将步骤得到的连。

24、接产物A转化入DH5 感受态细胞中， 转化的具体操作步骤如 下： 取5 l连接产物A加入到100 lDH5 感受态细胞中， 轻轻混匀， 冰浴30min， 42热激90s， 加入1mlLB液体培养基， 37200rpm转速摇菌1h， 摇菌完成后取200 l涂布于含氨苄青霉素 的LB琼脂平板上， 37培养18h； 完成培养后挑取单个菌落， 摇菌提取质粒后通过酶切(图1) 和测序鉴定(图2)， 得到骨架质粒pAd4FAST， 整个骨架质粒pAd4FAST构建过程如图3所示。 0041 图1为酶切鉴定图， 其中1为 -EcoT14 digestDNAMarker； 2为PacI和SpeI酶切 后的pA。

25、d4FAST质粒的鉴定结果， 由骨架质粒pAd4FAST的构建过程图3可知： PacI和SpeI对骨 架质粒进行酶切后得到两个片段， 鉴定图中显示出两个条带； 3为pAd4FAST质粒的鉴定结 果； 在该鉴定过程中， 由于基因过大， 电泳时位置稍有一定的偏差； 0042 图2为骨架质粒pAd4FAST的测序鉴定图。 0043 (2)电转化感受态细胞的制备： 0044 将上述步骤(1)得到的骨架质粒pAd4FAST转入BJ5183大肠杆菌， 转化方法同上述 步骤， 将含有骨架质粒pAd4FAST的BJ5183大肠杆菌制备成电转化感受态细胞， 具体制备 过程如下： 划线培养含有骨架质粒pAd4FA。

26、ST的BJ5183大肠杆菌菌体， 挑取单菌落， 放入5ml LB培养基中， 37200rpm摇菌过夜， 得到菌液； 然后按照菌液与培养液的体积比为1:500的 比例将菌液接种至500mlLB液体培养基中， 200rpm摇菌至OD600为0.8， 立刻置于冰水浴中 冰浴30min， 然后在250ml预冷的离心杯中离心于44000rpm条件下离心30min， 弃上清后， 用10的预冷甘油等体积重悬， 44000rpm离心20min， 重复上一步骤， 收集沉淀并用1ml 10的预冷甘油悬浮细胞， 然后以每管40 l分装到1.5mL的EP管(EP管要-20预冷)中， -80 保存备用。 说明书 4/8。

27、 页 6 CN 105567736 A 6 0045 2.穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle的构建 0046 (1)载体pShuttle-1的构建： 0047 以病毒基因组(人源腺病毒4型疫苗株)为模板， 利用引物P7： CCTTAATTAA(PacI) CATCATCAATAATATAC(SEQIDNO:7)和引物P8： GGACTAGT(SpeI)GATTTAAAT(SwaI) ACGGCTTGCACTCCA(SEQIDNO:8)扩增病毒基因组1-1000bp的片段， 利用PacI和SpeI酶切， 经 DN A 胶回收 试 剂盒 纯 化回收 ， 得 到 产物4 ； 利 用引物 P9 。

28、： G G AC T AG T( S pe I ) GGGCTCGGAGCAGCGTCT(SEQIDNO:9)和引物P10： CCTTAATTAA(PacI)CATCATCAATAATATACCTT (SEQIDNO:10)扩增病毒基因组27813-32766bp的片段， 利用PacI和SpeI酶切， 经DNA胶回 收试剂盒纯化回收， 得到产物5； 0048 将pShuttle-CMV载体(美国Stratagene公司)用PacI酶切后回收2922bp的片段 (参照pShuttle-CMV序列， version017005， 片段位置： 3692-6613bp)并去磷酸化， 该片段含 有pBR。

29、322复制起点和卡那霉素抗性基因， 经DNA胶回收试剂盒纯化回收， 得到产物6； 0049 将步骤中的产物4、 产物5与步骤中的产物6共同连接， 连接条件同步骤1. (1).， 连接完成得到连接产物B； 0050 取5 l步骤中所述的连接产物B， 转化入DH5 感受态细胞中， 转化的具体操作 同步骤1. (1).， 得到含有连接产物B的感受态细胞， 取200 l完成转化的DH5 感受态细胞， 涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上， 37培养18h； 完成培养后挑取单个菌落， 摇菌提取质 粒后通过酶切鉴定(图4)， 得到载体pShuttle-1， 质粒pShuttle-1的构建过程见图5； 0051。

30、 酶切鉴定图4中， 2表示载体pShuttle-1的鉴定结果， 其大小约为8875bp； 3表示利 用PacI酶切后的pShuttle-1载体的鉴定结果， 由pShuttle-1的构建过程图5可得， 利用PacI 酶切后得到组成pShuttle-1载体的两个片段， 其中一个片段的大小约为5954bp、 另一个片 段的大小约为2922bp； 4表示利用SwaI酶切后的pShuttle-1载体的鉴定结果、 5表示利用 SpeI酶切后的pShuttle-1载体的鉴定结果， 由图5可得， 利用SwaI或SpeI酶切后得到线性化 的载体pShuttle-1， 其大小约为8876bp； 图4的鉴定结果显示。

31、， 相应的产物大小均与标准大 小对应， 即通过连接得到了所需载体pShuttle-1。 0052 (2)穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle的构建： 0053 以病毒基因组(人源腺病毒4型疫苗株)为模板， 利用引物P11： CCAAGCATTTAAAT (SwaI)GCGGGGGCACA(SEQIDNO:11)和引物P12： GGACTAGT(SpeI)GAACAACGGCGATTG(SEQID NO:12)扩增病毒基因组25833-27476bp的片段， 利用SwaI和SpeI进行酶切， 经DNA胶回收试 剂盒纯化回收， 得到产物7； 利用SwaI和SpeI对步骤2. (1)制备的载体p。

32、Shuttle-1进行酶切， 经DNA胶回收试剂盒纯化回收， 得到产物8； 0054 将步骤中的产物7与产物8进行连接， 连接条件为(10 l体系)： 10连接缓冲 液1 L， 2个片段各2 l， 1 lT4DNA连接酶(美国NEB公司， 400U/ l)， 4 lddH2O， 16反应12 小时， 得到连接产物C； 0055 取5 l步骤得到的连接产物C， 转化入DH5 感受态细胞中， 转化的具体操作同 步骤1. (1).， 完成转化后， 取200 lDH5 感受态细胞涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上， 37培养18h； 完成培养后挑取单个菌落， 摇菌提取质粒后通过酶切鉴定(图6)， 得到载。

33、体 pAd4FAST-Shuttle， 整个穿梭质粒载体pAd4FAST-Shuttle的构建过程如图5所示。 载体 pAd4FAST-Shuttle中的SpeI限制性酶切位点位于E3缺失区， 用于外源基因的装入， SwaI限 说明书 5/8 页 7 CN 105567736 A 7 制性酶切位点位于左右同源臂中间， 用于重组前载体的线性化。 0056 酶切鉴定图6中， 2表示载体pAd4FAST-Shuttle的鉴定结果， 其大小约为10520bp； 3 表示利用PacI酶切后的pAd4FAST-Shuttle载体的鉴定结果， 由pAd4FAST-Shuttle的构建过 程图5可得， 利用P。

34、acI酶切后得到组成pAd4FAST-Shuttle载体的两个片段， 其中一个片段的 大小约为7598bp、 另一个片段的大小约为2922bp； 4表示利用SwaI酶切后的产物的鉴定结 果、 5表示利用SpeI酶切后的产物的鉴定结果， 由图5可得， 利用SwaI或SpeI酶切后均得到线 性化的载体pAd4FAST-Shuttle， 其大小约为10520bp； 图6的鉴定结果显示， 相应的产物大小 均与标准大小对应， 即通过连接得到了所需载体pAd4FAST-Shuttle。 0057 实施例2 0058 该实施例为携带目的基因的重组AdV4病毒的制备过程， 具体以 “携带EGFP报告基 因的重。

35、组腺病毒AdV4-EGFP” 的制备为例进行表述： 0059 利用本载体系统能够制备携带目的基因的重组AdV4腺病毒， 将目的基因克隆到穿 梭质粒pAd4FAST-Shuttle的克隆位点处。 将携带目的基因的穿梭质粒经过限制性内切酶 SwaI酶切线性化后， 转化入携带骨架质粒pAd4FAST的大肠杆菌BJ5183菌株(美国 Stratagenen公司)中， 在BJ5183细胞内经过同源重组得到携带目的基因的腺病毒质粒， 该 质粒经过限制性内切酶PacI酶切， 释放重组腺病毒基因组， 利用DNA转染的方法将重组腺病 毒基因组转染包装细胞系HEK-293， 在包装细胞内拯救得到携带目的基因的重组。

36、AdV4腺病 毒， 起始得到的少量腺病毒可以进一步用包装细胞扩增， 制备大量的重组腺病毒。 0060 1.上述EGFP基因的克隆及腺病毒质粒pAd4FAST-EGFP的制备 0061 (1)从pZJ-1-EGFP载体(SEQIDNO:13)中利用NheI和SpeI酶切， 回收1769bp的 片段(该片段在pZJ-1-EGFP载体中的位置为： 402-2170bp)， 该片段包含CMV-EGFP-SV40pA框 架； 0062 所述pZJ-1-EGFP载体的合成过程为： 首先人工合成CMV-EGFP-SV40pA序列(SEQID NO:14)(该序列上游依次含EcoRI、 NheI位点， 下游依。

37、次含SpeI、 HindIII位点)， 经过EcoRI和 HindIII酶切后克隆于经过EcoRI和HindIII酶切的pUC19载体上； 具体的连接条件为(10 l 体系)： 10连接缓冲液1 L， 2个片段各2 l， 1 lT4DNA连接酶(美国NEB公司， 400U/ l)， 4 lddH2O， 16反应12小时， 得到载体pZJ-1-EGFP。 0063 利用SpeI酶切pAd4FAST-Shuttle载体并去磷酸化， 得到线性化的pAd4FAST- Shuttle载体； 0064 将步骤中回收的片段与步骤中线性化的pAd4FAST-Shuttle载体进行连接， 连接条件同实施例1中步。

38、骤2. (2).， 得到连接产物D； 将连接产物D转化入DH5 感受态细胞 中， 转化条件同实施例1中步骤1.(1).， 完成转化后， 取200 lDH5 感受态细胞涂布于LB 琼脂平板上， 37培养18h； 完成培养后挑取单个菌落， 摇菌提取质粒分别经过SpeI和SwaI 酶切鉴定(图7)， 得到pAd4FAST-Shuttle-EGFP载体； 0065 图7为载体pAd4FAST-Shuttle-EGFP的酶切鉴定图， 2表示pAd4FAST-Shuttle- EGFP， 其大小为12289bp； 3为逆时针克隆情况下、 经SwaI和SpeI酶切后的pAd4FAST- Shuttle-EG。

39、FP载体， 由图5中pAd4FAST-Shuttle的重组过程可知， pAd4FAST-Shuttle-EGFP 经SwaI和SpeI酶切后形成两个片段， EGFP与小片段连接、 其大小为3413bp， 另一个大片段的 大小为8876bp； 4为顺时针克隆情况下， 经SwaI和SpeI酶切后的pAd4FAST-Shuttle-EGFP载 说明书 6/8 页 8 CN 105567736 A 8 体， 由上述图5中pAd4FAST-Shuttle的重组过程可得， pAd4FAST-Shuttle-EGFP经SwaI和 SpeI酶切后形成两个片段， EGFP与大片段连接、 其大小为10645bp，。

40、 另一个小片段的大小为 1644bp； 图7中的鉴定结果显示： 相应的片段大小均与对应的片段标准大小相同， 即得到了 载体pAd4FAST-Shuttle-EGFP。 也可得出： EGFP顺时针克隆、 逆时针克隆两种不同的克隆方 向是与不同的片段末端相连接。 0066 (2)将步骤(1)得到的pAd4FAST-Shuttle-EGFP载体， 利用SwaI酶切线性化， 线性化 的pAd4FAST-Shuttle-EGFP载体经过酚氯仿抽提后溶于去离子水， 得到含pAd4FAST- Shuttle-EGFP载体的溶液； 然后取500ng溶液电转化入实施例1步骤1.(2)制备并保存的电 转化感受态细。

41、胞中， 电转化的条件为： 2.5KV/cm条件下电击5ms； 取200 l电击后的电转化感 受态细胞涂布于LB平板(含50 g/ml卡那霉素的抗性基因Kan)， 37培养20小时即可。 0067 (3)步骤(2)培养完成后， 挑取小的菌落摇菌提取质粒电泳检测(图8A)， 在图8A中 位置较高的质粒为可疑阳性质粒， 由图可以得到其中标号为的1、 4、 10、 11、 12、 15检测结果 位置较高， 为可疑阳性质粒； 选取上述6个可疑阳性质粒利用PCR检测EGFP基因的存在(图 8B)， 由图8B可以看出， 上述6个可疑阳性质粒中均含有EGFP基因， 均为阳性质粒； 然后对标 号为1、 2、 3。

42、、 4的阳性质粒进一步采用PacI酶切鉴定(图8C)， 最终得到腺病毒质粒pAd4FAST- EGFP； 0068 骨架质粒pAd4FAST与携带目的基因的穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle-EGFP在大肠杆 菌BJ5183中的重组过程如图9所示。 0069 2.重组腺病毒AdV4-EGFP的拯救 0070 (1)将腺病毒质粒pAd4FAST-EGFP利用PacI酶切线性化后， 酚氯仿抽提一次， 与-20 无水乙醇沉淀过夜， 10000rpm离心30min， 弃上清， 收集沉淀用75冰乙醇洗涤一遍， 10000rpm离心10min， 弃上清， 然后收集沉淀室温自然风干5min， 1TE溶。

43、解， 测定腺病毒质 粒pAd4FAST-EGFP的含量； 0071 (2)转染： 转染过程在6孔板中进行， 每孔接种1106HEK-293细胞， HEK-293细胞采 用含有10胎牛血清的1DMEM培养基培养， 375CO2培养箱培养1824小时， 培养完成 后弃上清； 然后加入2 g步骤(1)中由1TE溶解后得到的的腺病毒质粒pAd4FAST-EGFP、 10ul脂质体Lipofectamine2000、 1mlopti-MEM培养基， 培养6小时后弃上清； 加入2ml含2 胎牛血清的1DMEM维持液， 375CO2培养箱培养， 中间每隔3天每个细胞孔补加500 l维 持液， 7天后收获细胞。

44、， 冻融裂解3次， 离心后上清(P0代病毒上清)再次感染HEK-293细胞， 随 着传代数的增加， EGFP细胞逐渐增多， P3代病毒上清使得培养的HEK-293细胞产生完全致细 胞病变效应(CPE)(图10a)， 并且荧光蛋白的表达随着时间的增加而增加(图10b)， 说明病毒 得到扩增。 0072 3.重组病毒生长特性的测定 0073 首先取重组病毒AdV4-EGFP与亲本病毒AdV4E3分别测定其蚀斑形成单位(PFU)， 两种病毒均按照MOI0.05感染细胞(HEK-293细胞)； 试验于T25细胞瓶中进行， 每瓶接种2 106细胞， 1824h内接种病毒； 接种完成后接下来在12h、 2。

45、4h、 36h、 48h、 60h、 72h、 84h、 96h 每个时间点分别各取三瓶于-70冻存， 最后测定各个时间点样品的TCID50， 绘制生长曲 线， 结果如图11所示； 由图11生长曲线可以看出， 重组腺病毒与亲本病毒的生长趋势相差不 大， 即外源基因克隆至人源腺病毒之后对腺病毒的生长影响不大， 因此人源腺病毒AdV4基 说明书 7/8 页 9 CN 105567736 A 9 因组在其可以感染的宿主中有望被用作基因治疗以及重组疫苗使用且本身具有的安全性 等性能不受影响。 说明书 8/8 页 10 CN 105567736 A 10 0001 序列表 1/9 页 11 CN 105。

46、567736 A 11 0002 序列表 2/9 页 12 CN 105567736 A 12 0003 序列表 3/9 页 13 CN 105567736 A 13 0004 序列表 4/9 页 14 CN 105567736 A 14 0005 序列表 5/9 页 15 CN 105567736 A 15 0006 序列表 6/9 页 16 CN 105567736 A 16 0007 序列表 7/9 页 17 CN 105567736 A 17 0008 序列表 8/9 页 18 CN 105567736 A 18 0009 序列表 9/9 页 19 CN 105567736 A 19 图1 图2 说明书附图 1/7 页 20 CN 105567736 A 20 图3 图4 说明书附图 2/7 页 21 CN 105567736 A 21 图5 说明书附图 3/7 页 22 CN 105567736 A 22 图6 图7 说明书附图 4/7 页 23 CN 105567736 A 23 图8 说明书附图 5/7 页 24 CN 105567736 A 24 图9 图10 说明书附图 6/7 页 25 CN 105567736 A 25 图11 说明书附图 7/7 页 26 CN 105567736 A 26 。