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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610021078.0 (22)申请日 2016.01.13 C07D 311/94(2006.01) C07D 493/04(2006.01) C07D 313/08(2006.01) C07C 49/83(2006.01) A61K 31/335(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61K 31/12(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 31/22(2006.01) (71)申请人 华中科技大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路 1037 号 (72)发明人 。
2、张勇慧 胡琳珍 薛永波 张锦文 王珍珍 (74)专利代理机构 华中科技大学专利中心 42201 代理人 夏惠忠 (54) 发明名称 地耳草中具有抗 EB 病毒和抗卡波氏肉瘤相 关疱疹病毒作用化合物及其制法及应用 (57) 摘要 本发明提供了具有抗 EB 病毒和抗 KSHV 活性 的化合物及其来源， 以及分离纯化方法和应用， 具 体是从金丝桃属植物地耳草中分离纯化得到化合 物1-18， 其中从湖北省蕲春县大别山地区10月份 采集的地耳草中分离纯化出化合物 1-10， 从江西 省庐山市庐山地区 8 月份采集的地耳草中分离纯 化出化合物 11-18。通过这 18 个化合物对两种 致瘤疱疹病毒进行抗病。
3、毒活性研究， 发现化合物 1、 3、 4、 7 和 8 对 EB 病毒的 DNA 复制有抑制活性 ； 化合物 3、 6 和 13-17 对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒 (KSHV) 裂解期的复制有抑制活性。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书4页 说明书11页 附图1页 CN 105646432 A 2016.06.08 CN 105646432 A 1.从金丝桃属植物地耳草中分离纯化得到的具有下式(I)所示结构的化合物1-18， 其 中， 从湖北省蕲春县大别山地区10月份采集的地耳草中分离纯化出化合物1-10， 从江西省 庐山市庐山地区8。
4、月份采集的地耳草中分离纯化出化合物11-18， 化合物1： 地耳草右旋抗EB病毒素A(+)-hyperjaponolA(1) 化合物2： 地耳草左旋抗EB病毒素A()-hyperjaponolA(2) 化合物3： 地耳草右旋抗EB病毒素B(+)-hyperjaponolB(3) 化合物4： 地耳草左旋抗EB病毒素B()-hyperjaponolB(4) 化合物5： 地耳草右旋抗EB病毒素C(+)-hyperjaponolC(5) 权利要求书 1/4 页 2 CN 105646432 A 2 化合物6： 地耳草左旋抗EB病毒素C()-hyperjaponolC(6) 化合物7： 地耳草抗EB病毒。
5、素D(hyperjaponolD)， RCH(CH3)2 化合物8： 地耳草抗EB病毒素E(hyperjaponolE)， 化合物9： 地耳草抗EB病毒素F(hyperjaponolF)， 化合物10： 地耳草绵马素G(hyperjaponolG) 化合物11： 地耳草右旋抗KS疱疹病毒素A(+)-japonicolA(11) 权利要求书 2/4 页 3 CN 105646432 A 3 化合物12： 地耳草左旋抗KS疱疹病毒素A()-japonicolA(12) 化合物13： 地耳草右旋抗KS疱疹病毒素B(+)-japonicolB(13) 化合物14： 地耳草左旋抗KS疱疹病毒素B()-j。
6、aponicolB(14) 化合物15： 地耳草右旋抗KS疱疹病毒素C(+)-japonicolC(15) 化合物16： 地耳草左旋抗KS疱疹病毒素C()-japonicolC(16) 权利要求书 3/4 页 4 CN 105646432 A 4 化合物17： 地耳草右旋抗KS疱疹病毒素D(+)-japonicolD(17) 化合物18： 地耳草左旋抗KS疱疹病毒素D()-japonicolD(18) 式(I)。 2.权利要求1所述结构的化合物制备来源， 特征在于： 化合物110来源于10月份采集 的湖北省蕲春县大别山地区的地耳草全草； 化合物1118来源于8月份采集的江西省庐山 市庐山地区的。
7、地耳草全草。 3.权利要求1所述结构的化合物1、 3、 4、 7和8在制备抗EB病毒(Epstein-Barvirus)药 物中的应用以及化合物3、 6和13-17在制备抗卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi s Sarcoma-AssociatedHerpesvirus)药物中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的抗病毒药物为抗EB病毒和抗卡波氏 肉瘤相关疱疹病毒。 5.如权利要求3所述化合物的用途， 是在制备用于抗病毒药物的应用。 6.如权利要求3所述化合物的用途， 其特征在于， 所述化合物和药学上可接受的添加剂 制成抗病毒药物。 7.如权利要求3所述化合物的用途，。
8、 其特征在于， 所述化合物制成的抗病毒药物类型为 注射剂、 粉针剂、 口服剂、 喷雾剂、 胶囊、 栓剂。 权利要求书 4/4 页 5 CN 105646432 A 5 地耳草中具有抗EB病毒和抗卡波氏肉瘤相关疱疹病毒作用化 合物及其制法及应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 涉及抗EB病毒和抗卡波氏肉瘤相关疱疹病毒作用化合 物化合物及其分离制备方法和应用， 具体涉及分离纯化过程， 结构确证， 抗病毒及抑制病毒 DNA复制作用等。 背景技术 0002 EB病毒(Epstein-Barrvirus， EBV)属于疱疹病毒科疱疹病毒亚科， 是一种嗜人 类淋巴细胞病毒， 全球范围内约95。
9、的健康成人携带该病毒。 EBV主要潜伏于人类静止状态 的成熟B淋巴细胞， 是传染性单核细胞增多症的病原体， 同时与多种人类淋巴细胞性和上皮 细胞性肿瘤的发生发展有关， 如鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma， NPC)、 何杰金氏病、 T/ B淋巴细胞瘤、 Burkitt S淋巴瘤以及免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤等， 是公认的DNA肿瘤病 毒。 EB病毒在裂解期的DNA复制是它在细胞里繁殖的重要阶段， 因此， 筛选和研发针对EBV裂 解期的DNA复制的药物， 对于治疗EBV相关疾病具有重要的意义。 0003 卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi ssarcomaassociat。
10、edherpesvirus， KSHV) 又称为人疱疹病毒8型(Humanherpesvirus8， HHV-8)， 属于疱疹病毒科(Herpesviridae)， 是一种双链DNA(dsDNA)病毒。 KSHV是卡波氏肉瘤(Kaposi ssarcoma， KS)、 原发性渗出性淋 巴瘤(Primaryeffusionlynphoma， PEL)及多中心卡氏病(Multicentrecattleman s disease， MCD)的病原体， 在我国新疆维吾尔自治区地区有较高的KSHV感染率及KS发病率。 目前临床上治疗KSHV相关疾病的方法取得了一定的进展， 但是这些方法不能完全治愈， 并。
11、 且对人体有一定的副作用。 因此， 筛选和研发针对KSHV裂解期复制的药物， 对于治疗KSHV相 关疾病具有重要的意义。 0004 地耳草(Hypericumjaponicum)是藤黄科金丝桃属多年生草本植物地耳草 Hypericumjaponicum(Thunb.)Herb的全草， 又名田基黄、 小元宝草、 四方草、 千重楼(浙 江)等， 产于辽宁、 山东至长江以南各省区。 民间以全草入药， 有清热解毒、 止血消肿的功效； 主要用于治疗传染性肝炎、 泻痢、 小儿惊风、 疳积、 喉蛾、 肠痈、 疖肿蛇咬伤等。 在欧洲、 美洲 的民间也有药用记载。 现代药理研究表明,田基黄具有抑菌、 保肝、 抑。
12、制肿瘤和防治心血管 疾病等作用,现已开发成针剂在临床上治疗急、 慢性肝炎。 发明内容： 0005 本发明的任务是提供具有抗EB病毒和抗KSHV活性的化合物及其来源以及分离纯 化方法和应用。 0006 实现本发明的具体方案是： 0007 本发明提供的具有抗EB病毒和抗KSHV活性的化合物是具有以下式(I)所示的化合 物1至化合物18： 说明书 1/11 页 6 CN 105646432 A 6 0008 0009 化合物1： 地耳草右旋抗EB病毒素A(+)-hyperjaponolA(1) 0010 0011 化合物2： 地耳草左旋抗EB病毒素A()-hyperjaponolA(2) 0012 。
13、0013 化合物3： 地耳草右旋抗EB病毒素B(+)-hyperjaponolB(3) 0014 0015 化合物4： 地耳草左旋抗EB病毒素B()-hyperjaponolB(4) 0016 0017 化合物5： 地耳草右旋抗EB病毒素C(+)-hyperjaponolC(5) 说明书 2/11 页 7 CN 105646432 A 7 0018 0019 化合物6： 地耳草左旋抗EB病毒素C()-hyperjaponolC(6) 0020 0021 化合物7： 地耳草抗EB病毒素D(hyperjaponolD)， RCH(CH3)2 0022化合物8： 地耳草抗EB病毒素E(hyperja。
14、ponolE)， 0023化合物9： 地耳草抗EB病毒素F(hyperjaponolF)， 0024 0025 化合物10： 地耳草绵马素G(hyperjaponolG) 0026 0027 化合物11： 地耳草右旋抗KS疱疹病毒素A(+)-japonicolA(11) 说明书 3/11 页 8 CN 105646432 A 8 0028 0029 化合物12： 地耳草左旋抗KS疱疹病毒素A()-japonicolA(12) 0030 0031 化合物13： 地耳草右旋抗KS疱疹病毒素B(+)-japonicolB(13) 0032 0033 化合物14： 地耳草左旋抗KS疱疹病毒素B()-j。
15、aponicolB(14) 0034 0035 化合物15： 地耳草右旋抗KS疱疹病毒素C(+)-japonicolC(15) 0036 0037 化合物16： 地耳草左旋抗KS疱疹病毒素C()-japonicolC(16) 说明书 4/11 页 9 CN 105646432 A 9 0038 0039 化合物17： 地耳草右旋抗KS疱疹病毒素D(+)-japonicolD(17) 0040 0041 化合物18： 地耳草左旋抗KS疱疹病毒素D()-japonicolD(18) 0042 式(I) 0043 我们在抗病毒活性筛选的指导下， 对采自湖北省蕲春县大别山地区和采自江西省 庐山市庐山地。
16、区的地耳草进行了系统的抗病毒活性成分研究， 分离得到了18个新化合物。 其中， 从采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草中分离得到化合物1-10， 从采自江西省庐 山市庐山地区的地耳草种分离得到化合物11-18。 结构式如式(I)所示。 0044 通过这18个化合物对两种致瘤疱疹病毒进行抗病毒活性研究， 发现化合物1、 3、 4、 7和8对EB病毒的DNA复制有抑制活性； 化合物3、 6和13-17对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒 (KSHV)裂解期的复制有抑制活性。 本发明涉及地耳草中化合物的分离制备、 以及它具有抑 制病毒的活性。 化合物1、 3、 4、 7和8可以预期发展成为治疗由EB病毒引起的红斑。
17、狼疮、 风湿 性关节炎、 和鼻咽癌、 何杰金氏病、 T/B淋巴细胞瘤、 Burkitt S淋巴瘤以及免疫缺陷病人的B 淋巴细胞瘤等肿瘤疾病的药物； 化合物3、 6和13-17可以预期发展成为治疗由KSHV引起的卡 波氏肉瘤、 原发性渗出性淋巴瘤及多中心卡氏病等疾病的药物。 由此完成了本发明。 0045 本发明人通过对采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草全草的乙醇提取物进行 分离纯化， 得到10个新化合物， 即化合物1-10。 对采自江西省庐山市庐山地区的地耳草全草 的乙醇提取物进行分离纯化， 得到8个新化合物， 即化合物11-18。 运用多种波谱分析方法和 其他手段， 确定它们的结构为杂萜类化合。
18、物， 具体结构如式(I)所示。 通过对化合物1-18的 抗病毒活性评价， 发现化合物1、 3、 4和7-9对EB病毒在B95-8细胞中用佛波酯(PMA/TPA)诱导 后进行裂解复制， 表现出良好的抑制病毒DNA复制的活性， 其中化合物3和7的活性尤其显 著， 可以作为抑制EB病毒药物开发的潜在药物； 发现化合物3、 6和13-17对KSHV在iSLK.219 细胞中用四环素(Dox)和丁酸钠(NaB)诱导后进行裂解复制， 表现出良好的抑制KSHV裂解复 制的活性， 其中化合物13活性较为显著， 可以作为抑制KSHV药物开发的先导化合物。 0046 本发明的另一任务是提供式(I)中所示化合物1-。
19、18在制备抗病毒药物中的应用。 当为化合物3和7时， 所述的抗病毒药物优选为抗EB病毒的药物。 当为化合物13时， 所述的抗 说明书 5/11 页 10 CN 105646432 A 10 病毒药物优选为抗KSHV。 附图说明 0047 图1： 式(1)所示化合物地耳草右旋抗病毒素B、 地耳草左旋抗病毒素B、 地耳草抗病 毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C的结构鉴定。 对化合物地耳草右旋抗病毒素B、 地耳草左旋 抗病毒素B、 地耳草抗病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C进行质谱， 紫外光谱， 红外光谱， 旋 光， 核磁共振， 圆二色谱和X射线单晶衍射等数据测试， 从而确定化合物的结构。 化合物3和。
20、 4： UV(CH3OH) max(log )227(3.22),242(3.25),325(3.28)nm； IR max3460,2963,2930, 1658,1624,1553,1474,1383cm1； for1HNMR(600MHz)and13CNMR(150MHz)datasee Table1and2； HRESIMSM+H+m/z457.2946(calcdforC28H41O5,457.2954)。 3:Colorless oil ,+135.4(c0.03 ,MeOH)； ECD(MeOH) ()216(+13.01)nm； 4:Colorless amorphouspow。
21、der,-134.5(c0.03,MeOH)； ECD(MeOH) ( )217(-10.91)nm。 化合物3 和4的绝对构型的确定是通过计算ECD的方法。 实验所测的CD(圆二色谱)的Cotton效应与计 算值吻合。 如图1所示。 0048图2： 化合物7： orange-redoil,+64.7(c0.11,MeOH)； ECD(MeOH) ( )227 (+3.23),272(+0.78),317(+0.74)nm； UV(CH3OH) max(log )229(3.64),240(3.15),329 (3.26)nm； IR max3521,3054,2980,2933,2873,1。
22、659,1626,1475,1383cm1； for1HNMR (400MHz)and13CNMR(100MHz)dataseeTable1and2； HRESIMSM+H+m/z475.3046 (calcdforC28H43O6,475.3060)。 化合物7绝对构型的确定是通过计算ECD的方法。 实验所测 的CD(圆二色谱)的Cotton效应与计算值吻合。 如图2所示。 0049 图3： 化合物16晶体结构如图3所示。 具体实施方式 0050 实施例1： 化合物地耳草右旋抗病毒素B、 地耳草左旋抗病毒素B、 地耳草抗病毒素D 和地耳草左旋抗KS病毒素C的制备和结构鉴定。 0051 (一)。
23、如式(1)所示化合物地耳草右旋抗病毒素B、 地耳草左旋抗病毒素B、 地耳草抗 病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C的制备 0052 1.地耳草(Hypericumjapocicum)的采集： 0053 采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草： 10月份采集全草50kg， 晒干， 真空干燥 后， 保存于华中科技大学同济医学院药学院中草药标本库。 0054 采自江西省庐山市庐山地区的地耳草： 8月份采集全草， 晒干， 真空干燥后， 保存于 华中科技大学同济医学院药学院中草药标本库。 0055 2.提取： 0056 均采用溶剂提取法， 将干燥的地耳草全草粉碎后， 加入95乙醇进行渗漉提取4 次。 低于40。
24、下减压浓缩回收乙醇。 采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草， 得到230.0g浸 膏； 采自江西省庐山市庐山地区的地耳草， 得到130.0g浸膏。 0057 3.分离： 0058 将230.0g的总浸膏(采自湖北省蕲春县大别山地区的地耳草)用100-200目硅胶拌 说明书 6/11 页 11 CN 105646432 A 11 样， 干法装柱后， 用石油醚-丙酮梯度洗脱(100:15:1)， TLC检测， 合并相同的组分， 共得到5 个组分。 组分3再经过反复的正反相硅胶柱色谱， 凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物 地耳草抗病毒素B(3.7mg)， 并通过手性制备柱进行手性拆分， 得到一对质量。
25、相等的对映异 构体， 即()-hyperjaponolB(3和4)； 组分4经过反复的正反相硅胶柱色谱， 凝胶色谱和高 效液相色谱分离分到化合物地耳草抗病毒素D(10.1mg)， 即hyperjaponolD； 0059 将130.0g的总浸膏(采自江西省庐山市庐山地区的地耳草)用120目硅胶拌样， 干 法装柱后， 用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(100:15:1)， TLC检测， 合并相同组分后， 得到8个 组分。 组分7经过反复的正反相硅胶柱色谱， 凝胶色谱和高效液相色谱分离分到化合物地耳 草抗KS病毒素C， 即()-japonicolC(5.1mg)， 然后用手性制备柱进行手性拆分， 得到一。
26、对 质量相等的对映异构体， 即()-japonicolC(15和16)。 0060 (二)如式(1)所示化合物地耳草右旋抗病毒素B、 地耳草左旋抗病毒素B、 地耳草抗 病毒素D和地耳草左旋抗KS病毒素C的结构鉴定 0061 对化合物地耳草右旋抗病毒素B、 地耳草左旋抗病毒素B、 地耳草抗病毒素D和地耳 草左旋抗KS病毒素C进行质谱， 紫外光谱， 红外光谱， 旋光， 核磁共振， 圆二色谱和X射线单晶 衍射等数据测试， 从而确定化合物的结构。 0062 化合物3和4： UV(CH3OH) max(log )227(3.22),242(3.25),325(3.28)nm； IR max 3460,2。
27、963,2930,1658,1624,1553,1474,1383cm1； for1HNMR(600MHz)and13CNMR (150MHz)dataseeTable1and2； HRESIMSM+H+m/z457.2946(calcdforC28H41O5, 457.2954)。 3:Colorlessoil,+135.4(c0.03,MeOH)； ECD(MeOH) ( )216(+13.01) nm； 4:Colorlessamorphouspowder,-134.5(c0.03,MeOH)； ECD(MeOH) ( )217(- 10.91)nm。 化合物3和4的绝对构型的确定是通过。
28、计算ECD的方法。 实验所测的CD(圆二色谱) 的Cotton效应与计算值吻合。 如图1所示。 0063化合物7： orange-redoil,+64.7(c0.11,MeOH)； ECD(MeOH) ( )227(+ 3.23),272(+0.78),317(+0.74)nm； UV(CH3OH) max(log )229(3.64),240(3.15),329 (3.26)nm； IR max3521,3054,2980,2933,2873,1659,1626,1475,1383cm1； for1HNMR (400MHz)and13CNMR(100MHz)dataseeTable1and2。
29、； HRESIMSM+H+m/z475.3046 (calcdforC28H43O6,475.3060)。 化合物7绝对构型的确定是通过计算ECD的方法。 实验所测 的CD(圆二色谱)的Cotton效应与计算值吻合。 如图2所示。 0064化合物16： Colorlesscrystal,-100.6(c0.24,MeOH)； UV(CH3OH) max(log ) 203(4.49),226(4.37),289(4.31)nm； IR max3225,2964,2927,2854,1718,1619,1494, 1460,1420cm1； ECD(MeOH) ( )218(+6.80),275。
30、(+2.78),307(-10.72)nm； for1HNMR (400MHz)and13CNMR(100MHz)dataseeTable1and2； HRESIMSM+Na+m/z371.1807 (calcdforC20H28O5Na,371.1834)。 化合物16绝对构型的确定是通过X射线单晶衍射的方 法。 16晶体结构如图3所示。 0065 实施例2： 化合物1-10对EB病毒的DNA复制的抑制活性； 化合物1-18对KSHV裂解复 制的抑制活性。 0066化合物1-10的抗EB病毒活性的评价： 首先采用了cellviability 说明书 7/11 页 12 CN 10564643。
31、2 A 12 reagent试剂盒(thermofisher)检测化合物物对细胞的毒性作用； 然后利用带有EBV病毒的 B95-8细胞作为评估化合物对EBV裂解复制的模型， 利用TPA(20ng/mL)激活EBV进入裂解复 制， 通过QPCR的方法检测EBV基因拷贝数评估化合物对复制的影响。 0067化合物1-18的抗KSHV活性的评价： 首先采用了cellviability reagent试剂盒(thermofisher)检测化合物对细胞的毒性作用； 然后利用潜伏存在重组GFP 基因的KSHV病毒的细胞系iSLK.219作为评估化合物对EBV裂解复制的模型， 利用Dox联合 NaB诱导KSH。
32、V进入裂解期复制， 观测分析Vero细胞中GFP表达的荧光密度， 从而得知化合物 对细胞上清液中感染性病毒颗粒产生水平的影响。 结果如Table3所示。 0068 Table1.1HNMRdataforcompounds3/4,7,and16(400MHz,JinHz,in CDCl3) 0069 0070 a600MHz 说明书 8/11 页 13 CN 105646432 A 13 0071 Table2. 13CNMRforcompounds3/4,7,and16(100MHz,JinHz) 0072 0073 0074 a150MHz 0075 Table3.anti-EBVactiv。
33、itiesofcompounds110. 说明书 9/11 页 14 CN 105646432 A 14 0076 0077 Table4.anti-KSHVactivitiesofcompounds118. 0078 0079 0080 注： 选择指数(SI)是CC50/EC50所得的值， 用来判断药物的效果， SI大于3可视为有 效， 指数越大说明药物抗病毒效果越好， 一般来讲如果药物的SI值大于10， 且EC50值相对较 低(小于100 M)， 那么该药物可以作为潜在药物进行开发。 0081 实验结论： 化合物1、 3、 4、 7和8表现出较低的毒性和较高的选择指数， 可以作为抑 制EB病毒药物开发的先导化合物， 并且， 其中化合物3和7的活性尤其显著， EC50均远低于阳 说明书 10/11 页 15 CN 105646432 A 15 性药物Gancilovir， 而且化合物7的选择指数高于Gancilovir， 可以作为潜在抗EB病毒药物 进行开发； 化合物13-17表现出低毒性和较高的选择指数， 可以作为抑制KSHV药物开发的先 导化合物。 说明书 11/11 页 16 CN 105646432 A 16 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 17 CN 105646432 A 17 。