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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610033463.7 (22)申请日 2016.01.19 C07C 227/40(2006.01) C07C 229/22(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市塘沽区经济技术开发区 第十三大街 29 号 (72)发明人 陈宁 麻杰 徐庆阳 范晓光 谢希贤 张成林 李燕军 (74)专利代理机构 天津佳盟知识产权代理有限 公司 12002 代理人 侯力 (54) 发明名称 一种从发酵液中分离提取 4- 羟基异亮氨酸 的方法 (57) 摘要 一种从发酵液中分离提取 4- 羟基异亮氨酸 的方法， 该。
2、方法首先通过双膜即微滤膜、 超滤膜 分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、 大部分 蛋白和色素， 然后通过阳离子交换柱除去酮戊 二酸等杂酸、 粉末活性炭脱色、 真空浓缩、 冷冻结 晶、 离心收集产品、 干燥成品操作步骤， 得到纯度 97.0以上的 4- 羟基异亮氨酸结晶， 收率达到 65以上。本发明采用微滤和超滤双膜过滤菌体 蛋白， 菌体蛋白去除彻底， 过滤液澄清透明 ； 采用 阳离子离子交换工艺， 高效去除难分离的酮戊二 酸等杂质。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 CN 105566136 A 2016.05.11。
3、 CN 105566136 A 1.一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法， 该技术从发酵液中分离提取4-羟 基异亮氨酸， 首先将4-羟基异亮氨酸发酵液通过双膜即微滤膜、 超滤膜分离系统错流过滤 去除发酵液中的菌体、 大部分蛋白和部分色素， 然后通过阳离子交换柱除去杂酸酮戊二酸、 粉末活性炭脱色、 真空浓缩、 冷冻结晶、 离心收集产品和干燥成品操作步骤， 得到纯度 97.0以上的4-羟基异亮氨酸结晶， 收率达到65以上， 具体步骤如下： a、 将4-羟基异亮氨酸发酵液经活菌灭活， 用盐酸调节pH为4.0， 进入微滤膜分离系统进 行微滤， 得到去除菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液以及菌体蛋白；。
4、 b、 将经a步得到澄清的4-羟基异亮氨酸过滤液泵入超滤膜过滤器， 对过滤液进行除蛋 白和脱色处理， 操作温度为20-50， 操作压力为0.01-0.1MPa， 得到4-羟基异亮氨酸过滤 液； c、 将b步获得的过滤液上732阳离子交换树脂吸附， 吸附饱和后用去离子水反洗， 之后 采用2-7的氨水洗脱， 收集pH为7.0-10.5的4-羟基异亮氨酸高流分洗脱液； d、 将c步获得高流分洗脱液加入洗脱液重量的0.05-2的活性炭脱色， 温度30-60 ， 搅拌脱色20-30min， 过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液； e、 将d步获得的脱色液用盐酸调pH为7.0-8.0后进行减压蒸发至原体积液的1。
5、0- 20， 获得含有大量4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液； f、 将e步得到的4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液放置于4结晶2-10h， 过滤， 获得4-羟基 异亮氨酸晶体。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于上述a步所述微滤膜分离系统采用金属膜分 离系统， 微滤膜孔径为50nm， 操作温度为2080， 进膜压力与出膜压力差为0 .01 0.1Mpa， 过滤过程分多次利用纯化水顶洗， 直至浓液中4-羟基异亮氨酸含量低于2.0g/L后 停机， 得到除去菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于b步所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离 系统， 截留分子量为6000， 。
6、其操作条件为pH2-12， 操作温度20-50， 进膜压力与出膜压力 差为0.01-0.1MPa， 得到4-羟基异亮氨酸过滤液。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105566136 A 2 一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸的方法， 属于发酵法生产氨 基酸的技术领域。 背景技术 0002 4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine， 4-HIL)是一种主要存在于胡芦巴属植物 种子中的L-异亮氨酸羟化物。 4-HIL分子式C6H13NO3， 分子量147.17， 熔点大于200， 沸点 332， 密度。
7、1.181g/cm3。 研究表明4-羟基异亮氨酸具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌 的活性以及促进肌细胞对血糖吸收、 加速脂肪代谢、 降血脂和保护肝功能的作用。 因此， 作 为有效预防和治疗糖尿病及肥胖症的理想药物， 4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市 场需求。 0003 4-羟基异亮氨酸的生产方法有提取法、 化学合成法、 酶催化法和生物法。 提取法和 化学合成法由于原料来源受限制， 分离纯化困难， 收率低， 产品纯度低， 污染环境严重， 大量 制备成本高， 难以实现工业化生产。 目前， 国内还没有直接发酵法生产4-羟基异亮氨酸， 而 以发酵法生产具有原料成本低、 反应条件温和、 容易实现。
8、大规模生产等优点。 0004 随着生物技术的发展， 在研究化学合成4-HIL的过程中尝试引入酶催化反应来简 化一些步骤。 例如， Wang等于2002年发明了八步法合成4-HIL， 该方法以2-甲基乙酰乙酸乙 酯为原料， 在地霉菌的作用下得到(2S， 3S)-3-羟基-2-甲基丁酸乙酯， 再经过7步化学合成 将其转变成4-HIL。 这其中借助地霉菌转化2-甲基乙酰乙酸乙酯是最关键一步。 该方法总收 率为39。 进一步地， Fulcrand等提出六步化学-酶合成法合成4-HIL。 第一步以溴乙酸叔丁 酯为底物， 在二苄胺的催化下得到二-N-苯甲基甘氨酸叔丁酯， 经过开环色层分析等分离得 到外消旋。
9、4-HIL内酯， 最后在青霉素酰基转移酶作用下水解N-苯乙酰内酯衍生物得到4- HIL。 上述方法需要复杂的多步反应， 同时难以控制生成的L-异亮氨酸羟化物的立体结构。 2009年， Kodera等首次在苏云金芽孢杆菌2e2AKU0251中发现有上述功能的氧化酶， 即L-异 亮氨酸双加氧酶(L-isoleucinedioxygenase， IDO)。 其研究小组将该酶蛋白纯化， 详细的 研究了酶学性质并找到其对应的基因序列， 借助质谱和核磁共振等分析技术， 他们发现IDO 特异地催化L-Ile生成4-HIL。 2010年， Smirnov等结合IDO催化过程特点， 失活大肠杆菌 (Escher。
10、ichiacoli)MG1655的 -酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶， 在此基础上过表达 IDO， 首次将4-HIL的合成与三羧酸循环联系起来。 用该菌株进行微生物转化， 最终L-异亮氨 酸转化率为82。 0005 近年来， II型糖尿病和肥胖症的快速发展， 使得关于4-HIL的研究愈发受到青睐。 目前主要采用葫芦巴种子提取法生产4-HIL， 然而该方法提取效率低(0.091-0.6)且采用 该方法获得的4-HIL构型较多但仅(2S,3R,4S)-4-HIL具有生物学活性。 有关化学法合成4- HIL的报道较多， 但主要是以葡萄糖、 薄荷酮或2-甲基乙酰乙酸乙酯为原料经多步化学反应 生成， 该。
11、方法反应条件苛刻、 步骤多、 分离困难、 收率低， 而且容易造成环境污染。 酶法合成 是以己醛、 -酮戊二酸化及L-谷氨酸为底物经4-羟基-3-甲基-2-酮基-戊酸醛缩酶和分支 说明书 1/3 页 3 CN 105566136 A 3 链氨基酸氨基转移酶两步催化合成， 虽然该方法具有周期短等优点， 但据报道因其转化率 较低且产品中含有大量 -氨基丁酸等副产物而不能达到生产要求。 发明内容 0006 本发明目的是提供一种新型的4-羟基异亮氨酸的分离提取工艺， 改变现有生产工 艺中存在的分离纯化困难， 收率低， 产品纯度低， 污染环境严重， 大量制备成本高等问题。 0007 针对上述问题， 本发明。
12、课题组曾开发了一种4-羟基异亮氨酸提取工艺技术， 该技 术从发酵液中分离提取4-羟基异亮氨酸， 首先将4-羟基异亮氨酸发酵液通过双膜即微滤 膜、 超滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、 大部分蛋白和部分色素， 然后通过阳离 子交换柱除去酮戊二酸等杂酸、 粉末活性炭脱色、 真空浓缩、 冷冻结晶、 离心收集产品和干 燥成品操作步骤， 得到纯度97.0以上的4-羟基异亮氨酸结晶， 收率达到65以上， 具体步 骤如下： 0008 a、 将4-羟基异亮氨酸发酵液经活菌灭活， 用4mol/L的盐酸调节pH为4.0， 进入微滤 膜分离系统进行微滤， 得到去除菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液以及菌体蛋白； 所。
13、述微滤膜 分离系统采用金属膜分离系统， 微滤膜孔径为50nm， 操作温度为2080， 进膜压力与出膜 压力差为0.010.1Mpa， 过滤过程分多次利用纯化水顶洗， 直至浓液中4-羟基异亮氨酸含 量低于2.0g/L后停机， 得到除去菌体的4-羟基异亮氨酸微滤液。 0009 b、 将经a步得到澄清的4-羟基异亮氨酸过滤液泵入超滤膜过滤器， 对过滤液进行 除蛋白和脱色处理， 操作温度为20-50， 操作压力为0.01-0.1MPa， 得到4-羟基异亮氨酸过 滤液。 所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统， 截留分子量为6000， 其操作条件为pH 2-12， 操作温度20-50， 进膜压力与出膜压。
14、力差为0.01-0.1MPa， 得到4-羟基异亮氨酸过滤 液。 0010 c、 将b步获得的过滤液上732阳离子交换树脂吸附， 吸附饱和后用去离子水反洗， 之后采用2-7的氨水洗脱， 收集pH为7.0-10.5的4-羟基异亮氨酸高流分洗脱液。 0011 d、 将c步获得高流分洗脱液加入洗脱液重量的0.05-2的活性炭脱色， 温度30- 60， 搅拌脱色20-30min， 过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液。 0012 e、 将d步获得的脱色液用盐酸调pH为7.0-8.0后进行减压蒸发至原体积液的10- 20， 获得含有大量4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液； 0013 f、 将e步得到的4-羟基异亮氨酸。
15、晶体的悬混液放置于4结晶2-10h， 过滤， 获得4- 羟基异亮氨酸晶体。 0014 本发明的优点和积极效果： 0015 与现有工艺相比， 本发明的方法具有以下优点： 0016 1、 本发明采用微滤和超滤双膜过滤菌体蛋白， 去除菌体蛋白效果较好， 过滤液澄 清透明； 0017 2、 本发明采用阳离子交换工艺， 高效去除难分离的酮戊二酸等杂质； 0018 3、 本发明提供一种新型的4-羟基异亮氨酸生产工艺， 得到的4-羟基异亮氨酸晶体 0019 经氨基酸分析仪分析测定纯度达97.0以上。 具体实施方式 说明书 2/3 页 4 CN 105566136 A 4 0020 实施例1 0021 a、 。
16、取4-羟基异亮氨酸发酵液25L(4-羟基异亮氨酸含量18.0g/L)于80加热10min 以上， 用盐酸调节pH为4.0， 进入微滤膜分离系统进行微滤， 得到去除菌体的4-羟基异亮氨 酸微滤液以及菌体蛋白； 所述微滤膜分离系统采用金属膜分离系统， 微滤膜孔径为50nm， 操 作温度为3040， 进膜压力与出膜压力差为0.04Mpa， 过滤过程分多次利用纯化水顶洗， 直至浓液中4-羟基异亮氨酸含量低于2.0g/L后停机， 得到除去菌体的4-羟基异亮氨酸微滤 液。 清液4-羟基异亮氨酸回收率达95.2， 菌体去除率大于99.9， 膜通量达到78L(m2 h)-1。 0022 b、 将经a步得到澄清。
17、的4-羟基异亮氨酸过滤液泵入超滤膜过滤器， 对过滤液进行 除蛋白和脱色处理， 得到4-羟基异亮氨酸过滤液。 所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离 系统， 截留分子量为6000， 其操作条件为pH4.0， 操作温度30， 进膜压力与出膜压力差为 0.08MPa， 得到4-羟基异亮氨酸过滤液。 0023 c、 将b步获得的过滤液上732阳离子交换树脂吸附， 吸附饱和后用去离子水反洗， 之后采用5的氨水洗脱， 收集pH为7.0-10.5的4-羟基异亮氨酸高流分洗脱液。 0024 d、 将c步获得高流分洗脱液加入洗脱液重量的1.5的活性炭脱色， 温度60， 搅 拌脱色25min， 过滤获得4-羟基异亮氨。
18、酸脱色液。 0025 e、 将d步获得的脱色液用盐酸调pH为7.2， 进行减压蒸发至原体积液的12， 获得 含有大量4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液； 0026 f、 将e步得到4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液放置于4结晶8h， 过滤， 获得4-羟基 异亮氨酸晶体， 称重293.0g， 计算收率为65.1， 纯度为95.8。 0027 实施例2 0028 取4-羟基异亮氨酸发酵液20L(4-羟基异亮氨酸含量20.3g/L)于80加热10min以 上， 用盐酸调节pH为4.0， 按照实施例1的方法进行微滤除菌体和超滤除蛋白， 采用3的氨 水洗脱树脂， 收集pH为7.0-10.0的洗脱液， 加入洗脱液重量。
19、的1.8的活性炭脱色， 温度55 ， 搅拌脱色25min， 过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液， 用盐酸调pH为7.2后进行减压蒸发至 原体积液的12， 得到4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液， 放置于4结晶4h， 过滤， 获得4-羟基 异亮氨酸晶体， 称重252.5g， 计算收率为62.2， 纯度为96.5。 0029 实施例3 0030 取4-羟基异亮氨酸发酵液28L(4-羟基异亮氨酸含量19.1g/L)于80加热10min以 上， 用盐酸调节pH为4.0， 按照实施例1的方法进行微滤除菌体和超滤除蛋白， 采用6的氨 水洗脱树脂， 收集pH为7.5-10.5的洗脱液， 加入洗脱液重量的1.5的活性炭脱色， 温度50 ， 搅拌脱色20min， 过滤获得4-羟基异亮氨酸脱色液， 用盐酸调pH为7.2后进行减压蒸发至 原体积液的15， 得到4-羟基异亮氨酸晶体的悬混液， 放置于4结晶4h， 过滤， 获得4-羟基 异亮氨酸晶体， 称重322.5g， 计算收率为60.3， 纯度为96.8。 说明书 3/3 页 5 CN 105566136 A 5 。