一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102757496 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757496 A *CN102757496A* (21)申请号 201210185573.7 (22)申请日 2012.06.07 C07K 16/22(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 山东泉港药业有限公司 地址 250014 山东省济南市浆水泉路 225 号 (72)发明人 刘宁 宋磊 赵文明 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限。

2、公 司 37205 代理人 张建成 (54) 发明名称 一种抗 VEGF 抗体片段的纯化制备方法 (57) 摘要 本发明涉及在大肠杆菌周质表达重组 VEGF 抗体片段的纯化制备方法。关键技术是大肠杆菌 周质表达 VEGF 抗体片段的纯化制备工艺和方法。 纯化该重组抗体时， 周质提取过程中加入可溶性 增强试剂， 利于抗体重链和轻链的正确折叠， 对抗 体片段纯化前进行热处理， 使部分宿主菌蛋白失 活、 沉淀， 而抗体分子更加稳定。在纯化过程中， 仅使用阳离子交换疏水层析两步法纯化获得纯 度大于 95% 的抗体蛋白， 是一种操作简单方便， 低 成本， 高产出， 适合产业化的抗体片段纯化制备方 法。 。

3、(51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 大肠杆菌周质表达的抗 VEGF 抗体片段的纯化制备方法， 其特征在于， 包括 以下步骤 ： （1） 菌株构建和目标蛋白表达 ： 构建人源化抗血管内皮生长因子 Fab 噬菌体抗体库， 使用 VEGF-A 为配基进行生物淘选， 获得高特异性阳性克隆， 测序后对序列进行比对和分 析 ； 构建适合抗体 Fab 片段表达的胞周质表达载体， 载体元件包括 ： 大肠杆菌启动子、 复制 子、 抗生素筛选标记。

4、、 多克隆酶切位点、 两个核糖体识别位点、 两个信号肽序列、 两个终止 子， 分别转录和引导抗体的重链和轻链， 引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割 信号肽， 重链和轻链形成 N 末端是天然氨基酸序列的蛋白， 两条链在周质腔的氧化环境中， 通过二硫键的配对和形成， 最终形成一个具有生物活性的蛋白分子 ； 载体转化大肠杆菌株 Rosetta-gami 2（DE3） （黙克公司） ， 筛选阳性菌株， 摇瓶法小试筛选高表达菌株， 对高表达 菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子 Fab 片段 ； （2） 周质提取 ： 收集发酵菌液进行离心， 将菌体细胞重悬于磷酸盐缓冲液， 使用剪切机 进行剪。

5、切至悬液均匀， 筛网过滤后加入溶解性增强剂， 匀浆在 1000bar 压力下匀质 3-5 次， 8500rpm， 15min 离心， 上清即为包含 Fab 单抗的蛋白质溶液 ； （3） 纯化预处理 ： 将包含 Fab 单抗的蛋白质溶液进行热处理， 此过程中出现大量宿主菌 蛋白沉淀、 絮凝， 离心取上清即为初步纯化后的抗体片段 ； （4） 纯化 ： 使用阳离子交换疏水介质两步法对表达的抗体进行纯化， SDS PAGE 电 泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度， 蛋白纯度大于 95 ； （5） 超滤 ： 使用 Milipore 超滤系统， 将纯化后的蛋白进行脱盐、 更换至抗体稳定的柠檬 酸 （10mM。

6、 pH5.0） 缓冲液系统。 2. 根据权利要求 1 所述的重组 VEGF 抗体片段的纯化方法， 其特征在于， 所述的步骤 （2） 中， 磷酸盐缓冲液 pH 为 5.0-8.0。 3. 根据权利要求 1 所述的重组 VEGF 抗体片段的纯化方法， 其特征在于， 所述的步骤 （2） 中， 溶解性增强试剂为二价阳离子试剂 ： 氯化钙和硫酸镁。 4. 根据权利要求 1 所述的重组 VEGF 抗体片段的纯化方法， 其特征在于， 所述的步骤 （2） 中， 溶解性增强试剂为硫酸镁。 5. 根据权利要求 1 所述的重组 VEGF 抗体片段的纯化方法， 其特征在于， 所述的步骤 （2） 中， 硫酸镁浓度为 1。

7、0-120mM。 6. 根据权利要求 1 所述的重组 VEGF 抗体片段的纯化方法， 其特征在于， 所述的步骤 （2） 中， 热处理温度为 30 C-70 C， 时间为 30min-100min。 7. 根据权利要求 1 所述的重组 VEGF 抗体片段的纯化方法， 其特征在于， 所述的步骤 （3） 中， 热处理温度为 50 C-60 C， 时间为 30min-50min。 8. 根据权利要求 1 所述的重组 VEGF 抗体片段的纯化方法， 其特征在于， 所述的步骤 （4） 中， 阳离子交换介质为 Capto MMC。 9. 根据权利要求 1 所述的重组 VEGF 抗体片段的纯化方法， 其特征在。

8、于， 所述的步骤 （4） 中， 疏水层析介质为 Phenyl Sepharose High Performance。 权 利 要 求 书 CN 102757496 A 2 1/9 页 3 一种抗 VEGF 抗体片段的纯化制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 提供一种抗 VEGF 抗体片段的纯化制备方法。 背景技术 0002 单抗药物以其高特异性、 有效性和安全性已经成为国际生物技术药物的支柱品 种， 占到了生物技术药物总额的 36%， 位居医药生物技术产品前列。2010 年， 单克隆抗体药 物以 480 亿美元的销售额继续领跑全球药品市场， 同比增长 20%。2000-201。

9、0 年十年间全球 单克隆抗体药物市场复合增长率高达32%。 整个抗体产品市场呈现爆炸式的增长方式， 预计 在未来十年内单克隆抗体药物将会成为全球生物医药领域发展的主导产品。 单抗药物在肿 瘤、 自身免疫病、 心血管及感染性等重大疾病的诊断治疗方面取得了突出的进展， 目前 FDA 批准的治疗性抗体药物的主要靶点有 ： CD3、 CD11、 CD20、 CD25、 CD33、 CD52、 GpIIb/IIIa、 呼 吸道合胞体病毒 F 蛋白、 人表皮生长因子受体 -2（Her2） 、 肿瘤坏死因子 alpha（TNF-） 、 血管内皮生长因子 （VEGF） 及表皮生长因子受体 （EGFR） 等。 。

10、0003 1989 年， Gospodarow 从牛垂体滤泡细胞中分离纯化得到一种蛋白质， 能特异作用 于血管内皮细胞， 引起血管内皮细胞增殖， 并在体内诱导血管形成， 命名为血管内皮细胞生 长因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF） ， 已证实 VEGF 是最重要的血管生成 因子之一， 是特异的内皮细胞促有丝分裂剂。VEGF 分子量为 46KD， PI 8.5， 对热、 酸稳定， 人类 VEGF 基因定位于 6 号染色体短臂 （6p21.3） 上， 全长 14 kb， 由 8 个外显子和 7 个内含 子组成。 因VEGF mRNA剪接方式不同。

11、， 可产生5种异构体， 分别编码121， 145， 165， 189和206 个氨基酸， 其中 VEGF165 是主要的效应分子。VEGF 是一种具有内皮细胞特异性的有丝分裂 原， 体外促进内皮细胞生长， 体内诱导血管发生， 促进血管生长。VEGF 可以强烈地增加毛细 血管后静脉和小静脉的通透性。Brock 等报道， VEGF 是已知的最强的血管渗透剂， 高于组胺 50000 倍。目前认为， VEGF 增加血管通透性与血管内皮细胞的渗透细胞器 VVO（vascular vacuolar organelle） 有关。 0004 VEGF 的过表达与肿瘤、 渗出型年龄相关性黄斑变性 (age-re。

12、lated macular degeneration， AMD)、 糖尿病视网膜病变 (diabetic retinopathy， DR)、 视网膜静脉阻塞 (retinal vein occlusion， RVO) 性黄斑水肿、 骨髓增生异常性等疾病的发生密切相关， 对 VEGF 单抗药物、 反义核苷酸抑制剂、 VEGF 受体的药物研发成为当前医药领域的研究热点。 0005 美 国 Genetech 公 司 研 制 的 血 管 表 皮 生 长 因 子 （VEGF）抗 体， 贝 伐 单 抗 （Bevacizumab， 商品名 Avastin） ， 其通过抑制 VEGF， 使肿瘤组织无法获得所需。

13、的血液、 氧 和其他养分， 以达到抗癌功效。2004 年 2 月 FDA 批准上市用于治疗转移性结直肠癌和非 小细胞肺癌 NSCLC 一线治疗的 VEGF 抑制剂， 分子量为 148 KD。继而 Genetech 公司开发 和生产雷珠单抗 （Ranibizumab， 商品名 Lucentis） ， 其是针对脉络膜新生血管 （choroidal noevascularization ， CNV） 的 VEGF 抑制剂， 是第二代人源化的抗 VEGF 重组鼠单克隆抗体 片段， 由可降低免疫原性的非结合性人源化片段以及鼠高亲和力抗原决定簇两部分组成。 Ranibizumab对人VEGF的所有亚型都具。

14、有特异性和亲和力， 主要作用机制为结合VEGF165、 说 明 书 CN 102757496 A 3 2/9 页 4 VEGF121 和 VEGF110， 阻止血管渗漏和新生血管的形成， 从而抑制 CNV 的生成。2006 年 6 月， FDA 批准兰尼单抗用于治疗年龄相关性黄斑变性 （age-related macular degeneration， AMD） ， 2010 年 11 月增加新的适应症继发于视网膜静脉阻塞 (retinal vein occlusion， RVO)的黄斑水肿。 Ranibizumab的分子量为48KD， 动物实验表明， 玻璃体内注射分子量较大 的 Bevaci。

15、zumab 不能穿透猴视网膜的内界膜， 而注射 Ranibizumab 则可在 1 小时内完全渗 透视网膜各层， 并测得玻璃体内药物的半衰期为 3.2 天。 0006 Fab 片段由重链 Fd 和完整轻链组成， 两者通过一个键间二硫键连接， 形成异二聚 体。在 B 细胞的粗面内质网中， 可变区立体折叠， 链内二硫键形成， 从而轻链和重链可变区 两个分子间相互作用， 形成正确的立体构象。 大肠杆菌周质腔有类似于内质网的环境， 将重 链和轻链 5 端连接细菌蛋白的前导肽， 在其引导作用下表达的蛋白可以分泌到周质腔， 前 导肽被前导肽酶特异切割， 生成的 N 末端为天然蛋白的 Fd 段和轻链在周质腔。

16、内完成折叠、 形成正确的链内和链间二硫键， 成为有生物学活性的 Fab 片段。Fd 基因片段和 L 链基因可 以分别构建在 2 个载体上， 然后共转染细胞， 也可以构建在一个载体上转染细胞进行表达。 以证明有效地细菌前导肽包括外膜蛋白 A （outer membrane protein A,OmpA） 、 碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase , phoA)、 果胶酸盐裂解酶 (pectate lyase, pelB) 等。使用包涵 体方式表达抗体片段， 需要在体外进行复性， 这一过程对于抗体这样复杂的分子结构效率 很低， 对重组蛋白的活性有一定影响。 0007 传统的抗体和。

17、抗体片段的纯化第一步采用亲和色谱 （ProteinA、 ProteinG、 Kappa select） ， 在捕获目标蛋白的同时， 一步纯化获得纯度比较理想的目标蛋白。 但是， 在大规模 生产的过程中， 亲和色谱存在着某些缺陷 ： 1、 载量低 2、 配基容易脱落 3、 价格昂贵 4、 绝大多 数亲和层析介质需要酸性条件下洗脱抗体蛋白， 导致某些不耐酸的抗体蛋白聚集、 沉淀、 活 性丧失。 亲和配基通过化学键偶联到基质骨架上， 在每批纯化过程中存在配基脱落的可能， 故而产品需要检测配基残留量 ； 配基脱落造成本身载量不高的介质的动态结合载量进一步 降低， 为了保证样品的处理量， 需要定期补充和。

18、更换凝胶， 成本递增 ； 亲和介质的价格昂贵， 提高产品的生产成本， 所以在大规模生产抗体和抗体片段的工艺中， 不使用亲和色谱能够 快速获取药典纯度要求的重组蛋白， 是一种低成本、 高效的纯化制备方法。 发明内容 0008 本发明的目的在于克服上述技术上的缺陷， 提供一种抗 VEGF 抗体片段的纯化制 备方法。 纯化该重组抗体时， 周质提取过程中加入可溶性增强试剂， 利于抗体重链和轻链的 正确折叠， 对抗体片段纯化前进行热处理， 使部分宿主菌蛋白失活、 沉淀， 而抗体分子更加 稳定。 0009 大肠杆菌周质表达抗 VEGF 抗体片段， 经过周质提取后的蛋白悬液， 纯化前使用热 击处理， 可使抗。

19、体的重链和轻链形成的 Fab 分子的稳定性提高， 同时， 去除 50% 以上宿主菌 蛋白和蛋白聚合物， 利于下面的纯化。 在纯化过程中， 使用阳离子交换疏水层析两步法纯 化， 快速获得纯度大于 95% 的抗体蛋白， 是一种操作简单方便， 低成本、 高产出的适合产业 化的纯化制备方法。 0010 大肠杆菌周质表达的抗 VEGF 抗体片段的纯化制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 菌株构建和目标蛋白表达 ： 构建人源化抗血管内皮生长因子 Fab 噬菌体抗体库， 说 明 书 CN 102757496 A 4 3/9 页 5 使用 VEGF-A 为配基进行生物淘选， 获得高特异性阳性克隆， 测序后对序。

20、列进行比对和分 析 ； 构建适合抗体 Fab 片段表达的胞周质表达载体， 载体元件包括 ： 大肠杆菌启动子、 复制 子、 抗生素筛选标记、 多克隆酶切位点、 两个核糖体识别位点、 两个信号肽序列、 两个终止 子， 分别转录和引导抗体的重链和轻链， 引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割 信号肽， 重链和轻链形成 N 末端是天然氨基酸序列的蛋白， 两条链在周质腔的氧化环境中， 通过二硫键的配对和形成， 最终形成一个具有生物活性的蛋白分子 ； 载体转化大肠杆菌株 Rosetta-gami 2（DE3） （黙克公司） ， 筛选阳性菌株， 摇瓶法小试筛选高表达菌株， 对高表达 菌株使用高密度发酵生。

21、产抗血管内皮生长因子 Fab 片段 ； （2） 周质提取 ： 收集发酵菌液进行离心， 将菌体细胞重悬于磷酸盐缓冲液， 剪切机进 行剪切至悬液均匀， 筛网过滤后加入溶解性增强剂， 匀浆在 1000bar 压力下匀质 3-5 次， 8500rpm， 15min 离心， 上清即为包含 Fab 单抗的蛋白质溶液 ； （3） 纯化预处理 ： 将包含 Fab 单抗的蛋白质溶液进行热处理， 此过程中出现大量宿主菌 蛋白沉淀、 絮凝， 离心取上清即为初步纯化后的抗体片段。热击温度不同， 对杂蛋白等的去 除比例也不同 （图 1） ； （4） 纯化 ： 使用阳离子交换疏水介质两步法对表达的抗体进行纯化， SDS 。

22、PAGE 电泳 用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度， 蛋白纯度大于 95 ； （5） 超滤 ： 使用 Milipore 超滤系统， 将纯化后的蛋白进行脱盐、 更换至抗体稳 定的柠檬酸 （10mM pH5.0） 缓冲液系统。 0011 上述步骤 （2） 中， 磷酸盐缓冲液pH为5.0-8.0 ； 使用的溶解性增强剂为一种二价阳 离子试剂 ； 此二价阳离子为氯化钙或硫酸镁 ； 二价溶解性增强剂为硫酸镁 ； 其中硫酸镁浓 度为 10-120mM。 0012 上述步骤 （3） 中， 热处理温度为 30 C-70 C， 时间为 30min-100min ； 优选热处理温度为 50 C-60 C， 优选时间为。

23、 30min-50min。 0013 上述步骤 （4）中， 阳离子交换介质为 Capto MMC ； 疏水层析介质为 Phenyl Sepharose High Performance。 0014 构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库， 使用VEGF-A为配基进行生物 淘选， 获得高特异性阳性克隆， 测序后对序列进行比对和分析。构建适合抗体 Fab 片段表达 的胞周质表达载体， 转化、 筛选阳性菌株并对高表达菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮 生长因子 Fab 片段。发酵液离心后菌体进行周质提取， 即将离心后的菌体细胞重悬于磷酸 盐缓冲液， 剪切机进行剪切至悬液均匀， 晒网过滤后加入可。

24、溶性增强试剂， 匀质 3-5 次， 离 心上清为包含 Fab 单抗的蛋白质溶液。将此蛋白质溶液进行热处理， 可有效去除宿主菌杂 蛋白 HCP 成分， 同时保证抗体片段重链和轻链更稳定的结合。采用阳离子交换层析 （Capto MMC） 和疏水层析 （Phenyl Sepharose High Performance） 两步法进行纯化生产， 获得纯度 大于 95% 的抗体片段。周质提取后蛋白悬液的离子强度和电导较高 （16-20ms/cm） ， 普通离 子交换层析时， 需要利用超滤系统进行脱盐， 目标蛋白才能结合在柱子上。 本发明在第一步 捕获层析过程中采用 Capto MMC 阳离子交换层析， 。

25、周质提取蛋白溶液不需要任何处理直接 上样， 进行目标蛋白的分离和纯化。Capto MMC 是一种高度交联多重作用弱阳离子吸附介 质， 其吸附过程具有耐受高盐的特性， 目标蛋白在高电导下直接进样， 结合在配基上 ； 同时 该介质结合在高强度的琼脂碱性配基上， 放大时具有流率快、 低反压的特点。 使用此凝胶介 说 明 书 CN 102757496 A 5 4/9 页 6 质不需要超滤系统对样品进行脱盐预处理， 可以避免超滤系统处理大量周质提取液的过程 中因剪切力比较高可能造成目标蛋白活性减低。这样不但节约了生产设备成本， 缩短纯化 时间， 而且提高了产品的质量。第二步精细层析采用疏水介质Pheny。

26、l Sepharose High Performance， 因为疏水层析具有高盐吸附， 低盐洗脱的特性。Capto MMC 阳离子交换层析 需要高盐的条件下洗脱蛋白， 从 Capto MMC 阳离子交换层析中收集的目标蛋白液加入适当 盐后可直接上 Phenyl Sepharose High Performance， 这样操作简单， 减少了样品的处理过 程， 降低了生产成本， 提高了产率， Phenyl Sepharose High Performance 凝胶介质颗粒为 34m， 可有效去除 Capto MMC 不能去除的杂蛋白， 使目标蛋白纯度到达 95% 以上。最后， 对 纯化产物使用超滤。

27、系统脱盐、 浓缩。 整个纯化组合合理， 操作简单， 工艺稳定， 易于产业化放 大。 0015 本发明技术方案的有益效果为 ： 1稳定性好、 操作简单、 耗时短、 纯度高 周质提取液使用热处理， 可有效去除宿主菌杂蛋白成分， 同时保证抗体片段重链和轻 链更稳定的结合， 采用 Capto MMC 快速捕获和 Phenyl Sepharose High Performance 精 细分离纯化两步进行纯化生产， 即可得到纯度 95% 的抗体片段。Capto MMC 和 Phenyl Sepharose High Performance 均属于耐受高盐的凝胶介质， 样品在高电导下直接进样， 不 需要传统。

28、利用超滤等方式进行脱盐降低样品电导后上样等步骤， 从而具有稳定性好、 操作 简单、 耗时短、 纯度高的优点。 0016 2降低生产成本 传统对抗体及抗体片段的纯化第一步多采用亲和介质进行纯化， Protein G、 Protein A 等亲和介质的价格约 16-18 万元 /L， 本发明使用符合配基的阳离子交换介质Capto MMC， 价格约 4 万元 /L ； 同时对目标蛋白的动态结合载量， Capto MMC 比常用亲和介质 protein A sepharose CL-4B 和 Protein G sepharose 4 FF 高出 1 倍以上， 从而大幅度降 低生产成本， 增加产品竞争。

29、力。 0017 3不存在亲和配基脱落、 残留和检测问题 使用亲和介质进行纯化的过程中， 通过化学键偶联的配基会脱落至产品组分中， 后期 需要使用其他的方法进行去除， 根据药典规定， 纯化过程中使用亲和介质需要检测产品中 亲和配基的残留量。本发明不需要使用亲和配基， 不存在亲和配基脱落、 残留和检测的问 题。 0018 附图说明 0019 图 1 周质提取液热击 SDS-PAGE 还原电泳 1 周质提取上清 2 周质提取上清 30 C 热击 3 周质提取上清 40 C 热击 4 周质提取上清 50 C 热击图 5 周质提取上清 60 C 热击 6 低分子量蛋白标准 7 周质提取沉淀 30 C 热。

30、击 8 周质提取沉淀 40 C 热击 9 周质提取沉淀 50 C 热击图 10 周质提取沉淀 60 C 热击 图 2 阳离子层析 （Capto MMC） 色谱图 1 穿过峰 2 杂质峰 3 目标蛋白峰 4 杂质峰 说 明 书 CN 102757496 A 6 5/9 页 7 图 3 疏水层析 （Phenyl Sepharose High Performance） 色谱图 1 穿过峰 2 杂质峰 3 目标蛋白峰 4 杂质峰 图 4 实施例 1 中纯化抗体各步 SDS-PAGE 电泳 1 周质提取液 2 热击后周质提取液 3 Capto MMC 纯化 4 Phenyl HP 纯化 5 低分子量标准。

31、蛋白 图 5 MALDI-TOF 质谱测定分子量 图 6 重链与轻链 N 端氨基酸序列分析 图 7 人脐静脉内皮细胞增殖抑制作用 对照品 Lucentis 抑制曲线 重组生产 Fab 片段抑制曲线。 具体实施方式 0020 下面通过具体实施例的方式进一步说明本发明， 并不因此将本发明限制在所述的 实施例范围之中。 0021 实施例 1 1. 菌株构建和重组抗体表达 ： 构建人源化抗血管内皮生长因子 Fab 噬菌体抗体库， 使用 VEGF-A 为配基进行生物淘选， 获得高特异性阳性克隆， 测序后对序列进行比对和分 析 ； 构建适合抗体 Fab 片段表达的胞周质表达载体， 载体元件包括 ： 大肠杆。

32、菌启动子、 复制 子、 抗生素筛选标记、 多克隆酶切位点、 两个核糖体识别位点、 两个信号肽序列、 两个终止 子， 分别转录和引导抗体的重链和轻链， 引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割 信号肽， 重链和轻链形成 N 末端是天然氨基酸序列的蛋白， 两条链在周质腔的氧化环境中， 通过二硫键的配对和形成， 最终形成一个具有生物活性的蛋白分子 ； 载体转化大肠杆菌株 Rosetta-gami 2（DE3） （黙克公司） ， 筛选阳性菌株， 摇瓶法小试筛选高表达菌株， 对高表达 菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子 Fab 片段 ； 2. 匀浆 ： 1L 发酵液进行离心， 取菌体细胞重悬于 。

33、10 倍体积 50mM pH 7.2 磷酸盐缓冲 液， 剪切机进行剪切至悬液均匀， 筛网过滤后加入溶解性增强剂 80-100mM MgSO4， 匀浆在 1000bar 压力下匀质 3-5 次， 8500rpm 离心 20min 离心弃去沉淀， 上清即为包含 Fab 单抗的 蛋白质溶液 ； 3. 纯化预处理 ： 将包含 Fab 单抗的蛋白质溶液， 水浴 56-60 C 热击处理 60min， 热处 理过程中匀速搅拌， 此过程中溶液出现大量宿主菌蛋白絮凝， 8500rpm 离心 15min， 取上清 即为初步纯化的抗体片段溶液 ； 4. 第一步阳离子交换层析 （1） 色谱柱 ： XK26/20， 。

34、层析介质 ： Capto MMC， 均为美国 GE 公司 ； （2） 样品处理 ： 用 0.5M 柠檬酸调节热击后上清液至 pH4.5（电导 18ms/cm） ， 0.22m 微 孔滤膜过滤 ； （3） 缓冲液配置 ： 缓冲液 A ： 25mM 柠檬酸 - 柠檬酸钠 (pH=4.5), 缓冲液 B ： 为 25mM MES（pH 5.2） +0.1M NaCl， 缓冲液 C ： 25mM 柠檬酸 - 柠檬酸钠 (pH=6.5) 0.3M NaCl ； （4） 纯化过程 ： 用缓冲液 A 预先平衡 Capto MMC 柱， 样品直接上样 Capto MMC 柱， 上完样后以缓冲液 A 平衡柱子，。

35、 将未结合到柱子的杂质冲洗干净， 用缓冲液 B 洗脱 说 明 书 CN 102757496 A 7 6/9 页 8 杂蛋白， 再用缓冲液 A 平衡柱子至酸性条件下， 最后用缓冲液 C 洗脱目标蛋白 ； （5） 结果 ： 收集目标蛋白峰 ( 图 2)， 测蛋白浓度计算回收率， 作 SDS PAGE 电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化， 蛋白回收率为 70% 左右， 蛋白纯 度 90（图 4） 。 0022 5. 第二步疏水层析 （1） 色谱柱 ： XK26/20， 层析填料为 Phenyl Sepharose High Performance， 均为美国 GE 公司 ； （2） 样品。

36、处理 ： 阳离子交换后洗脱目标蛋白组分加入终浓度为 0.8M Na2SO4， 1N NaOH 调节 pH6.8 ； （3） 缓冲液配置 ： 缓冲液 A 为 25mM pH 6.8 的磷酸盐缓冲液加 0.8M Na2SO4, 缓冲液 B 为 25mM pH6.8 的 PB 缓冲液加 0.2M Na2SO4； （4） 纯化过程 ： 用缓冲液A预先平衡Phenyl Sepharose High Performance柱， 上样后 以缓冲液 A 平衡柱子， 将未结合到柱子的物质冲洗干净， 再用 100的缓冲液 B 洗脱目标蛋 白 ； （5） 结果 ： 收集目标蛋白峰 （图 3） ， 测蛋白浓度计算回收。

37、率， 作 SDS PAGE 电泳， 分离胶 浓度为 12%， 加样量不低于 10g， 用考马斯亮蓝 R250 染色过夜， 脱色后用凝胶成像系统扫 描计算蛋白纯度。经此步纯化， 蛋白回收率为 80 % 左右， 蛋白纯度可达 98以上 （图 4） 。 0023 6. 超滤浓缩 ： 使用 Millipore 纵向流超滤系统， 截留分子量为 10KD 的再生纤维 素膜包对纯化后的蛋白质溶液进行脱盐和浓缩。首先进行蛋白质浓缩至 OD2802.0、 然后使 用 8-10 倍样品体积的 10mM 柠檬酸缓冲液 pH5.0， 更换缓冲系统， 耗时 2-2.2h， 蛋白回收率 97%， 蛋白纯度同 5 不变。 。

38、0024 7. 对实施例 1 的蛋白质液进行初步检测 ： 分子量、 N 末端残基序列、 生物学活性进 行检定 （1） 分子量测定 ： 委托国家生物医学分析中心进行测定， 使用 MALDI-TOF-MS 测定 VEGF Fab 抗体的分子量为 48249.6 道尔顿 （图 5） 。 0025 （2） 重链与轻链 N 端氨基酸序列测定分析 ： 委托国家生物医学分析中心进行测定 Fab 重链和轻链 N 端 15 个氨基酸 , 结果重链的 N 端序列为 ： EVQLVESGGGLVQPG， 轻链的 N 端 序列为 ： DIQLTQSPSSLSASV， 均与设计一致 （图 6） 。 0026 （3） 生。

39、物活性测定 ： 通过体外对人脐静脉内皮细胞增殖抑制作用测定重组抗体片 段的生物学活性， 选生长状态良好的人脐静脉内皮细胞 （HuVEC） ， 加入一定量的3% M199， 制 成 2-4104个 /ml 细胞悬液， 100l/ 孔加入 96 孔板， 于 37， 5%CO2的培养箱中培养 24h。 用含 0.2nM VEGF 的分析培养基将纯化样品和阳性对照品 （Lucentis） 进行梯度稀释， 每个 浓度3个平行样， 阴性对照不加药物， 以测定培养基补齐。 加入96孔板， 100l/孔于37， 5%CO2的培养箱中培养 20-24h。每孔加入 0.5 Ci 3H 胸腺嘧啶脉冲细胞 24 小时。

40、后收 集细胞， 使用 gamma 计数仪计数， 显示重组抗 VEGF Fab 抗体片段对人脐静脉内皮细胞增殖 抑制作用与进口同类产品 Lucentis 的抑制作用基本一致 （图 7） 。 0027 实施例 2 1. 菌株构建和目标蛋白表达 ： 构建人源化抗血管内皮生长因子 Fab 噬菌体抗体库， 使用 VEGF-A 为配基进行生物淘选， 获得高特异性阳性克隆， 测序后对序列进行比对和分 说 明 书 CN 102757496 A 8 7/9 页 9 析。构建适合抗体 Fab 片段表达的胞周质表达载体， 载体元件包括 ： 大肠杆菌启动子、 复 制子、 抗生素筛选标记、 多克隆酶切位点、 两个核糖体。

41、识别位点、 两个信号肽序列、 两个终止 子， 分别转录和引导抗体的重链和轻链， 引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割 信号肽， 重链和轻链形成 N 末端是天然氨基酸序列的蛋白， 两条链在周质腔的氧化环境中， 通过二硫键的配对和形成， 最终形成一个具有生物活性的蛋白分子。载体转化大肠杆菌株 Rosetta-gami 2（DE3） （黙克公司） ， 筛选阳性菌株， 摇瓶法小试筛选高表达菌株， 对高表达 菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子 Fab 片段。 0028 2. 匀浆 ： 发酵液进行离心， 取菌体细胞重悬于 10 倍体积 50mM pH 7.2 磷酸盐缓 冲液， 剪切机进行剪切至。

42、悬液均匀， 筛网过滤后加入溶解性增强剂 50-70mM MgSO4， 匀浆在 1000bar 压力下匀质 3-5 次， 8500rpm 离心 20min 离心弃去沉淀， 上清即为包含 Fab 单抗的 蛋白质溶液。 0029 3. 纯化预处理 ： 将包含 Fab 单抗的蛋白质溶液， 水浴 50-55 C 热击处理 60min， 热处理过程中匀速搅拌， 此过程中溶液出现大量宿主菌蛋白絮凝， 8500rpm 离心 15min， 取 上清即为初步纯化的抗体片段溶液， 不同热击温度对纯度的影响 （图 1） 。 0030 4. 第一步阳离子交换层析 （1） 色谱柱 ： XK26/20， 层析介质 ： Ca。

43、pto MMC， 均为美国 GE 公司 ； （2） 样品处理 ： 用 0.5M 柠檬酸调节热击后上清液至 pH4.5（电导 18ms/cm） ， 0.22m 微 孔滤膜过滤 ； （3） 缓冲液配置 ： 缓冲液 A ： 25mM 柠檬酸 - 柠檬酸钠 (pH=4.5), 缓冲液 B ： 为 25mM MES（pH 5.2） +0.12M NaCl， 缓冲液 C ： 25mM 柠檬酸 - 柠檬酸钠 (pH=6.5) 0.3M NaCl ； （4） 纯化过程 ： 用缓冲液 A 预先平衡 Capto MMC 柱， 样品直接上样 Capto MMC 柱， 上完样后以缓冲液 A 平衡柱子， 将未结合到柱子。

44、的杂质冲洗干净， 用缓冲液 B 洗脱 杂蛋白， 再用缓冲液 A 平衡柱子至酸性条件下， 最后用缓冲液 C 洗脱目标蛋白 ； （5） 结果 ： 收集目标蛋白峰， 测蛋白浓度计算回收率， 作 SDS PAGE 电泳用凝胶成像系 统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化， 蛋白回收率为 64% 左右， 蛋白纯度 82。 0031 5. 第二步疏水层析 （1） 色谱柱 ： XK26/20， 层析填料为 Phenyl Sepharose High Performance， 均为美国 GE 公司 ； （2） 样品处理 ： 阳离子交换后洗脱目标蛋白组分加入终浓度为 1.0 M(NH4)2SO4， 1N NaOH 调节。

45、 pH7.0 ； （3） 缓冲液配置 ： 缓冲液A为25mM pH 7.0 的磷酸盐缓冲液加1.0 M (NH4)2SO4, 缓冲 液 B 为 25mM pH7.0 的 PB 缓冲液加 0.3M (NH4)2SO4； （4） 纯化过程 ： 用缓冲液A预先平衡Phenyl Sepharose High Performance柱， 上样后 以缓冲液 A 平衡柱子， 将未结合到柱子的物质冲洗干净， 再用 100的缓冲液 B 洗脱目标蛋 白 ； （5） 结果 ： 收集目标蛋白峰， 测蛋白浓度计算回收率， 作 SDS PAGE 电泳， 分离胶浓度 为 12%， 加样量不低于 10g， 用考马斯亮蓝 R2。

46、50 染色过夜， 脱色后用凝胶成像系统扫描计 算蛋白纯度。经此步纯化， 蛋白回收率为 82% 左右， 蛋白纯度为 93%。 说 明 书 CN 102757496 A 9 8/9 页 10 0032 6. 超滤浓缩 ： 使用Millipore纵向流超滤系统， 截留分子量为10KD的再生纤维素 膜包对纯化后的蛋白质溶液进行脱盐和浓缩。首先进行蛋白质浓缩、 然后使用 8-10 倍样品 体积的 10mM 柠檬酸缓冲液 pH5.0， 更换缓冲系统， 耗时 2-2.2h， 蛋白回收率 93%。 0033 实施例 3 1. 菌株构建和目标蛋白表达 ： 构建人源化抗血管内皮生长因子 Fab 噬菌体抗体库， 使。

47、用 VEGF-A 为配基进行生物淘选， 获得高特异性阳性克隆， 测序后对序列进行比对和分 析。构建适合抗体 Fab 片段表达的胞周质表达载体， 载体元件包括 ： 大肠杆菌启动子、 复 制子、 抗生素筛选标记、 多克隆酶切位点、 两个核糖体识别位点、 两个信号肽序列、 两个终止 子， 分别转录和引导抗体的重链和轻链， 引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割 信号肽， 重链和轻链形成 N 末端是天然氨基酸序列的蛋白， 两条链在周质腔的氧化环境中， 通过二硫键的配对和形成， 最终形成一个具有生物活性的蛋白分子。载体转化大肠杆菌株 Rosetta-gami 2（DE3） （黙克公司） ， 筛选阳性。

48、菌株， 摇瓶法小试筛选高表达菌株， 对高表达 菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子 Fab 片段。 0034 2. 匀浆 ： 发酵液进行离心， 取菌体细胞重悬于 10 倍体积 50mM pH 7.2 磷酸盐缓 冲液， 剪切机进行剪切至悬液均匀， 筛网过滤后加入溶解性增强剂 20-40mM MgSO4， 匀浆在 1000bar 压力下匀质 3-5 次， 8500rpm 离心 20min 离心弃去沉淀， 上清即为包含 Fab 单抗的 蛋白质溶液。 0035 3. 纯化预处理 ： 将包含Fab单抗的蛋白质溶液， 水浴40-45C热击处理100min， 热处理过程中匀速搅拌， 此过程中溶液出现大量。

49、宿主菌蛋白絮凝， 8500rpm 离心 15min， 取 上清即为初步纯化的抗体片段溶液， 不同热击温度对纯度的影响 （图 1） 。 0036 4. 第一步阳离子交换层析 （1） 色谱柱 ： XK26/20， 层析介质 ： Capto MMC， 均为美国 GE 公司 ； （2） 样品处理 ： 用 0.5M 柠檬酸调节热击后上清液至 pH4.2（电导 18ms/cm） ， 0.22m 微 孔滤膜过滤 ； （3） 缓冲液配置 ： 缓冲液 A ： 25mM 柠檬酸 - 柠檬酸钠 (pH=4.2), 缓冲液 B ： 为 25mM MOPS （pH 5.5） +0.10M NaCl， 缓冲液 C ： 25mM 柠檬酸 - 柠檬酸钠 (pH=6.5) 0.3M NaCl ； （4） 纯化过程 ： 用缓冲液 A 预先平衡 Capto MMC 柱， 样品直接上样 Capto MMC 柱， 上完样后以缓冲液 A 平衡柱子， 将未结合到柱子的杂质冲洗干净， 用缓冲液 B 洗脱 杂蛋白， 再用缓冲液 A 平衡柱子至酸性条件下， 最后用缓冲液 C 洗脱目标蛋白 ； （5） 结果 ： 收集目标蛋白峰， 测蛋白浓度计算回收率， 作 SDS PAGE 电泳用凝胶成像系 统扫描计算蛋白纯度。经此步纯化， 蛋白回收率为 75% 左右， 蛋白纯度 80。 0。