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生物酶-化学法制备瑞舒伐他汀中间体.pdf

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文档编号：8587670

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510997985.4 (22)申请日 2015.12.26 C12P 7/62(2006.01) C07F 7/18(2006.01) C07C 69/708(2006.01) C07C 67/31(2006.01) (71)申请人尚科生物医药（上海）有限公司地址 201318 上海市浦东新区蓝靛路 1199 号 1 号楼 101 (72)发明人竺伟王波吴会李兵豪伍宝龙 (54) 发明名称生物酶 - 化学法制备瑞舒伐他汀中间体 (57) 摘要本发明公开了一种生物酶 - 化学法制备。

2、瑞舒伐他汀中间体 ( 式 I) 的方法， P 为羟基保护基，包括如下步骤： a)(R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯在腈水解酶的作用下得到 (R)-3- 羟基戊二酸单乙酯； b) (R)-3- 羟基戊二酸单乙酯在甲醇溶液中经酯交换得到(R)-3-羟基戊二酸单甲酯； c)(R)-3-羟基戊二酸单甲酯在缚酸剂条件下进行羟基保护得到式 I 所示的化合物。与现有技术相比，本发明方法所需原料性质稳定且价格低廉、工艺路线可靠，生产成本降低，产品收率提高，适合批量工业化生产。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利。

3、申请权利要求书1页说明书3页 CN 105385714 A 2016.03.09 CN 105385714 A 1/1 页 2 1.一种生物酶 - 化学法制备瑞舒伐他汀中间体 ( 式 I) 的方法， P 为羟基保护基，其特征在于，包括如下步骤： a)(R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯在腈水解酶的作用下得到 (R)-3- 羟基戊二酸单乙酯； b)(R)-3- 羟基戊二酸单乙酯在甲醇溶液中经酯交换得到 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯； c)(R)-3- 羟基戊二酸单甲酯在缚酸剂条件下进行羟基保护得到式 I 所示的化合物。 2.如权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述。

4、 P 为叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，三甲基硅基或苄基，优选为叔丁基二甲基硅基。 3.如权利要求 1 所述的方法，其特征在于：步骤 a) 中将腈水解酶、 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯和缓冲液按一定比例混合后反应得到 (R)-3- 羟基戊二酸单乙酯。 4.如权利要求 3 所述的方法，其特征在于：所述腈水解酶是由基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到。 5.如权利要求 3 所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液。 6.如权利要求 3 所述的方法，其特征在于：步骤 a) 中反应在 pH 为 6-8 的缓冲液中、 0-50下反。

5、应 1-48 小时。 7.如权利要求 1 所述的方法，其特征在于：步骤 c) 中所述缚酸剂为三乙胺、吡啶或咪唑。 8.如权利要求 1 所述的方法，其特征在于：步骤 c) 中 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯与缚酸剂的摩尔比为 1:1 3.5。权利要求书 CN 105385714 A 2 1/3 页 3 生物酶 - 化学法制备瑞舒伐他汀中间体技术领域 0001 本发明属于医药生化领域，具体涉及一种生物酶 - 化学法制备瑞舒伐他汀中间体的方法。背景技术 0002 瑞舒伐他汀钙 (Rosuvastain Calcium) 是一种新型的 HMG-COA 还原酶抑制剂，。

6、能够有效降低血脂，其单独使用效果超过其它他汀类药物，号称 “超级他汀” 。2003 年 8 月通过FDA上市审批， 2009年全球销售额高达44亿美元。其中手性侧链是合成瑞舒伐他汀的重要中间体。 0003 0004 (R)-3- 羟基保护 - 戊二酸单甲酯 ( 式 I) 是合成瑞舒伐他汀手性侧链关键中间体 ( 式 V) 的重要手性前体，如下所示： 0005 0006 (R)-3-羟基保护-戊二酸单甲酯的合成分为化学法和生物法。其中化学合成方法选择性差，反应副产物较多，使得纯化过程困难，产率低，不适于工业化生产。 0007 专利 CN101805756 报道了生物法。

7、将消旋的 4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯制备成 (R)-3- 羟基戊二酸单乙酯，但是该方法目标产物只有 50的理论产率，一半的原料将会被废弃掉，产率较低，生产成本高，不具有工业应用的价值。 0008 此外，专利 CN103361386 公开了一种 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯的生物制备方法，路线如下所示： 0009 说明书 CN 105385714 A 3 2/3 页 4 0010 该路线所用原料(R)-4-氰基-3-羟基丁酸甲酯没有商业化来源，原料不稳定且价格较高，无法用于工业化生产。发明内容 0011 为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种生物。

8、酶 - 化学法制备瑞舒伐他汀中间体的方法。 0012 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 0013 0014 P 为羟基保护基，其特征在于，包括如下步骤： 0015 a)(R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯在腈水解酶的作用下得到 (R)-3- 羟基戊二酸单乙酯； 0016 b)(R)-3- 羟基戊二酸单乙酯在甲醇溶液中经酯交换得到 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯； 0017 c)(R)-3- 羟基戊二酸单甲酯在缚酸剂条件下进行羟基保护得到式 I 所示的化合物。 0018 进一步说， P 为叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，三甲基硅基或苄基，优选为。

9、叔丁基二甲基硅基。 0019 进一步说，步骤 a) 中将腈水解酶、 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯和缓冲液按一定比例混合后反应得到 (R)-3- 羟基戊二酸单乙酯。 0020 进一步说，步骤 a) 中腈水解酶是由基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到。 0021 进一步说，步骤 a) 中缓冲液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。 0022 进一步说，步骤 a) 中反应在 pH 为 6-8 的缓冲溶液中、 0-50下反应 1-48 小时。 0023 进一步说，步骤 a) 中反应在 pH 为 7 的缓冲溶液中、 25下反应 24 小时。 0024 进一步说，步。

10、骤 a) 中腈水解酶浓度为 1 100g/l、 R-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯浓度 20 250g/l、缓冲液浓度为 0.01 0.2mol/l。 0025 进一步说，步骤 a) 中所用的腈水解酶为选自尚科生物医药 ( 上海 ) 有限公司公开销售的腈水解酶酶粉。 0026 进一步说，步骤 c) 中所述缚酸剂为三乙胺、吡啶或咪唑，优选为三乙胺。 0027 进一步说，步骤 c) 中 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯与缚酸剂的摩尔比为 1:1 3.5，优选为 1:1.5。 0028 进一步说，步骤 c) 中羟基保护试剂为叔丁基二甲基氯硅烷，叔丁基二苯基氯硅烷 , 三甲基氯。

11、硅烷或苄氯。 0029 进一步说，步骤 c) 中羟基保护试剂为叔丁基二甲基氯硅烷。 0030 进一步说，步骤 c) 中 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯与羟基保护试剂的摩尔比为 1:1 1.5，优选为 1:1。说明书 CN 105385714 A 4 3/3 页 5 0031 与现有技术相比，本发明方法所需原料性质稳定且价格低廉、工艺路线可靠，生产成本降低，产品收率提高，适合批量工业化生产。具体实施方式 0032 下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。 0033 实施例 1(R)-3- 。

12、羟基戊二酸单乙酯 (III) 的制备 0034 将(R)-4-氰基-3-羟基-丁酸乙酯(100g)、磷酸钠缓冲液(100mmol/L， pH7.0， 850ml)、腈水解酶粉 (12g) 加入到 2L 的三口瓶中，升温至 35，保温反应 24h。反应液用 2.5M 的盐酸调 pH 至 2-3，过滤，滤液用二氯甲烷 (1L*3) 萃取，合并所有有机层，硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得油状产品 101g，收率 92。该产物不需纯化直接用于下一步反应。 0035 实施例 2(R)-3- 羟基戊二酸单甲酯 (IV) 的制备 0036 在 1L 的三口瓶中加入 (R)-3- 羟基。

13、戊二酸单乙酯 (III)(100g)、甲醇 (800ml)、碳酸氢钠(56g)，搅拌回流2h后，减压浓缩至干，再加400ml甲醇，升温至回流2h后，减压浓缩至干，加水100ml，用5mol/L的盐酸调上述水溶液pH至2-3，乙酸乙酯萃取(500ml*3)，合并有机层，加硫酸钠干燥，减压浓缩，得油状产品 83g，收率约 90。该产物不需纯化直接用于下一步反应。 0037 实施例 3(R)-3- 叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯 (I-a) 的制备 0038 在2L的三口瓶中，加入(R)-3-羟基戊二酸单甲酯(IV)(81g)、咪唑(102g)和二氯甲烷(。

14、750ml)，然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(160g)，搅拌8h后，静置分层，分出有机层；水层用 0.5mol/L 的盐酸调 pH 至 3 4，用二氯甲烷 (500ml*2) 萃取；合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得产品 121g，收率 88。 0039 实施例 4(R)-3- 苄氧基戊二酸单甲酯 (I-b) 的制备 0040 在 2L 的三口瓶中，加入 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯 (IV)(100g)、四氢呋喃 (800ml)，降温到 -20，然后加入钠氢 (20g， 60 )， -20下加入苄氯 (160g) 的四氢呋喃 (200ml) 溶液。缓慢回到室温，搅拌 2h 后，加入 2mol/L 氢氧化钠水溶液 (1L)，室温搅拌 2h 后，用 2mol/L 的盐酸调 pH 至 3 4，用乙酸乙酯 (1L*3) 萃取；合并有机层，无水硫酸钠干燥；过滤，减压浓缩干，得产品 132g，收率 86。说明书 CN 105385714 A 5 。

摘要
申请专利号：	CN201510997985.4	申请日：	20151226
公开号：	CN105385714A	公开日：	20160309
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12P7/62,C07F7/18,C07C69/708,C07C67/31	主分类号：	C12P7/62,C07F7/18,C07C69/708,C07C67/31
申请人：	尚科生物医药（上海）有限公司
发明人：	竺伟,王波,吴会,李兵豪,伍宝龙
地址：	201318 上海市浦东新区蓝靛路1199号1号楼101
优先权：	CN201510997985A
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内容摘要

本发明公开了一种生物酶-化学法制备瑞舒伐他汀中间体(式I)的方法，P为羟基保护基，包括如下步骤：a)(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在腈水解酶的作用下得到(R)-3-羟基戊二酸单乙酯；b)(R)-3-羟基戊二酸单乙酯在甲醇溶液中经酯交换得到(R)-3-羟基戊二酸单甲酯；c)(R)-3-羟基戊二酸单甲酯在缚酸剂条件下进行羟基保护得到式I所示的化合物。与现有技术相比，本发明方法所需原料性质稳定且价格低廉、工艺路线可靠，生产成本降低，产品收率提高，适合批量工业化生产。

权利要求书

1.一种生物酶-化学法制备瑞舒伐他汀中间体(式I)的方法，P为羟基保护基，其特征在于，包括如下步骤：a)(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在腈水解酶的作用下得到(R)-3-羟基戊二酸单乙酯；b)(R)-3-羟基戊二酸单乙酯在甲醇溶液中经酯交换得到(R)-3-羟基戊二酸单甲酯；c)(R)-3-羟基戊二酸单甲酯在缚酸剂条件下进行羟基保护得到式I所示的化合物。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述P为叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，三甲基硅基或苄基，优选为叔丁基二甲基硅基。 3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中将腈水解酶、(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯和缓冲液按一定比例混合后反应得到(R)-3-羟基戊二酸单乙酯。 4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述腈水解酶是由基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到。 5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液。 6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤a)中反应在pH为6-8的缓冲液中、0-50℃下反应1-48小时。 7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c)中所述缚酸剂为三乙胺、吡啶或咪唑。 8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c)中(R)-3-羟基戊二酸单甲酯与缚酸剂的摩尔比为1:1～3.5。

说明书

技术领域

本发明属于医药生化领域，具体涉及一种生物酶-化学法制备瑞舒伐他汀中间体的方法。

背景技术

瑞舒伐他汀钙(RosuvastainCalcium)是一种新型的HMG-COA还原酶抑制剂，能够有效降低血脂，其单独使用效果超过其它他汀类药物，号称“超级他汀”。2003年8 月通过FDA上市审批，2009年全球销售额高达44亿美元。其中手性侧链是合成瑞舒伐他汀的重要中间体。

(R)-3-羟基保护-戊二酸单甲酯(式I)是合成瑞舒伐他汀手性侧链关键中间体(式 V)的重要手性前体，如下所示：

(R)-3-羟基保护-戊二酸单甲酯的合成分为化学法和生物法。其中化学合成方法选择性差，反应副产物较多，使得纯化过程困难，产率低，不适于工业化生产。

专利CN101805756报道了生物法将消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯制备成(R)-3-羟基戊二酸单乙酯，但是该方法目标产物只有50％的理论产率，一半的原料将会被废弃掉，产率较低，生产成本高，不具有工业应用的价值。

此外，专利CN103361386公开了一种(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的生物制备方法，路线如下所示：

该路线所用原料(R)-4-氰基-3-羟基丁酸甲酯没有商业化来源，原料不稳定且价格较高，无法用于工业化生产。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种生物酶-化学法制备瑞舒伐他汀中间体的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

P为羟基保护基，其特征在于，包括如下步骤：

a)(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯在腈水解酶的作用下得到(R)-3-羟基戊二酸单乙酯；

b)(R)-3-羟基戊二酸单乙酯在甲醇溶液中经酯交换得到(R)-3-羟基戊二酸单甲酯；

c)(R)-3-羟基戊二酸单甲酯在缚酸剂条件下进行羟基保护得到式I所示的化合物。

进一步说，P为叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，三甲基硅基或苄基，优选为叔丁基二甲基硅基。

进一步说，步骤a)中将腈水解酶、(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯和缓冲液按一定比例混合后反应得到(R)-3-羟基戊二酸单乙酯。

进一步说，步骤a)中腈水解酶是由基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到。

进一步说，步骤a)中缓冲液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。

进一步说，步骤a)中反应在pH为6-8的缓冲溶液中、0-50℃下反应1-48小时。

进一步说，步骤a)中反应在pH为7的缓冲溶液中、25℃下反应24小时。

进一步说，步骤a)中腈水解酶浓度为1～100g/l、R-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯浓度 20～250g/l、缓冲液浓度为0.01～0.2mol/l。

进一步说，步骤a)中所用的腈水解酶为选自尚科生物医药(上海)有限公司公开销售的腈水解酶酶粉。

进一步说，步骤c)中所述缚酸剂为三乙胺、吡啶或咪唑，优选为三乙胺。

进一步说，步骤c)中(R)-3-羟基戊二酸单甲酯与缚酸剂的摩尔比为1:1～3.5，优选为 1:1.5。

进一步说，步骤c)中羟基保护试剂为叔丁基二甲基氯硅烷，叔丁基二苯基氯硅烷,三甲基氯硅烷或苄氯。

进一步说，步骤c)中羟基保护试剂为叔丁基二甲基氯硅烷。

进一步说，步骤c)中(R)-3-羟基戊二酸单甲酯与羟基保护试剂的摩尔比为1:1～1.5，优选为1:1。

与现有技术相比，本发明方法所需原料性质稳定且价格低廉、工艺路线可靠，生产成本降低，产品收率提高，适合批量工业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1(R)-3-羟基戊二酸单乙酯(III)的制备

将(R)-4-氰基-3-羟基-丁酸乙酯(100g)、磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH＝7.0，850ml)、腈水解酶粉(12g)加入到2L的三口瓶中，升温至35℃，保温反应24h。反应液用2.5M 的盐酸调pH至2-3，过滤，滤液用二氯甲烷(1L*3)萃取，合并所有有机层，硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得油状产品101g，收率92％。该产物不需纯化直接用于下一步反应。

实施例2(R)-3-羟基戊二酸单甲酯(IV)的制备

在1L的三口瓶中加入(R)-3-羟基戊二酸单乙酯(III)(100g)、甲醇(800ml)、碳酸氢钠(56g)，搅拌回流2h后，减压浓缩至干，再加400ml甲醇，升温至回流2h后，减压浓缩至干，加水100ml，用5mol/L的盐酸调上述水溶液pH至2-3，乙酸乙酯萃取 (500ml*3)，合并有机层，加硫酸钠干燥，减压浓缩，得油状产品83g，收率约90％。该产物不需纯化直接用于下一步反应。

实施例3(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯(I-a)的制备

在2L的三口瓶中，加入(R)-3-羟基戊二酸单甲酯(IV)(81g)、咪唑(102g)和二氯甲烷(750ml)，然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(160g)，搅拌8h后，静置分层，分出有机层；水层用0.5mol/L的盐酸调pH至3～4，用二氯甲烷(500ml*2)萃取；合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得产品121g，收率88％。

实施例4(R)-3-苄氧基戊二酸单甲酯(I-b)的制备

在2L的三口瓶中，加入(R)-3-羟基戊二酸单甲酯(IV)(100g)、四氢呋喃(800ml)，降温到-20℃，然后加入钠氢(20g，60％)，-20℃下加入苄氯(160g)的四氢呋喃(200ml) 溶液。缓慢回到室温，搅拌2h后，加入2mol/L氢氧化钠水溶液(1L)，室温搅拌2h后，用2mol/L的盐酸调pH至3～4，用乙酸乙酯(1L*3)萃取；合并有机层，无水硫酸钠干燥；过滤，减压浓缩干，得产品132g，收率86％。