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一种志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法.pdf

上传人：00062****4422

文档编号：8587352

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510809447.8 (22)申请日 2015.11.20 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人浙江省疾病预防控制中心地址 310051 浙江省杭州市滨江区滨盛路 3399 号 (72)发明人梅玲玲徐昌平卢亦愚冯燕占利须周恒 (74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司 33201 代理人黄美娟李世玉 (54) 发明名称一种志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法 (57) 摘要本发明公开了一种志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法，该。

2、试剂盒包含 DNA 提取试剂、恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；核酸扩增反应全部恒定同一温度，恒温扩增仅需 35min，核酸试纸条检测结果需 1 2min，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需 1h 左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合志贺氏菌现场快速检测与排除。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书2页说明书5页序列表2页附图2页 CN 105420355 A 2016.03.23 CN 105420355 A 1/2 页 2 1.一种志贺。

3、氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成： (1)DNA 提取试剂； (2) 恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、 1Thermol Buffer， MgSO4， dNTPs 溶液， Bst DNA 聚合酶和无菌双蒸水；所述正向外围引物为： 5 -GGCAGGGAAATGTTCCGC-3 ；反向外围引物为： 5 -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3 ；所述两条探针的序列分别为：正向 5端 Biotin 标记探针： 5 -Biotin-CCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTT-。

4、3 ；反向 5端 FitC 标记探针： 5 -Fitc-TCCACTGCCGTGAAGGAA-3 ；所述两条扩增交叉引物分别为：扩增正向引物： 5 -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3 ；扩增反向引物： 5 -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTTGCTGTCACTCCCGACA-3 ； (3) 阳性对照：含有志贺氏菌 ipaH 基因的 DNA 质粒； (4) 阴性对照：无菌双蒸水。 2.如权利要求 1 所述志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述 1Thermol Buffer 组成为： 20m。

5、M 的 Tris-HCl、 10mM 的 KCl、 10mM 的 (NH4)2SO4、 2mM 的 MgSO4 以及质量浓度为 0.1的 Triton X-100， pH 7.5。 3.如权利要求 1 所述志贺氏菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有长 216bp 的志贺氏菌 ipaH 基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列为 SEQ ID NO.1 所示。 4.如权利要求 1 所述志贺氏菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照按如下步骤制备：以包含扩增区域的志贺氏菌 ipaH 基因片段为模板，通过两条外围引物进行 PCR 扩增获得目的基因；利用 PCR 纯。

6、化试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过 T-easy 质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒定量并稀释至 1 个拷贝 /l，获得阳性对照， -20保存。 5.如权利要求 1 所述志贺氏菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各自 10pmol，两条探针各自 20pmol，两条交叉引物各自 40pmol， 1Thermol buffer， MgSO4为 6mmol， dNTPs 溶液各 0.4mmol， Bst DNA 聚合酶 8U，无菌双蒸水组成补足至 25l。 6.一种权利要求。

7、1 所述志贺氏菌恒温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述检测方法为： a) 用 DNA 提取试剂从待检测的标本中提取 DNA ； b) 将步骤 a) 提取得到的 DNA 作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的 PCR 管中，在 65下扩增反应 35 分钟；标准阳性模板加入阳性对照 PCR 管中，标准阴性模板加入阴性对照 PCR 管中，所述标准阳性模板为含有志贺氏菌 ipaH 基因片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；权利要求书 CN 105420355 A 2 2/2 页 3 c) 将反应后的 PCR 管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测， 2 。

8、分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有志贺氏菌 ipaH 基因 DNA 核酸。权利要求书 CN 105420355 A 3 1/5 页 4 一种志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一种针对志贺氏菌核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对志贺氏菌的定性检测。 ( 二 ) 背景技术 0002 志贺氏菌(Shigella)是重要的肠道传染病的病原菌之一,为无动力、无芽胞的革兰阴性杆菌 , 具有肠杆菌科细菌的基本特性。据国内综合资料 , 志贺氏菌在我国感染性腹泻病原菌中居首位。全世界每年有16470万例志贺氏菌。

9、感染病例,有110万人因此而死亡。志贺氏菌引起的细菌性痢疾常发现于人员大量集中的地方 , 如餐厅和食堂。与其相关的食品包括色拉、生蔬菜、奶和奶制品、肉禽、水果和面包制品等。因此 , 对志贺氏菌的快速检测具有重要的意义。 0003 目前检测志贺氏菌的方法主要有传统分离培养、免疫学和分子水平的检测。在分子水平方面,传统PCR技术以高敏感性和特异性被广泛应用，但因其对设备要求较高，在基层应用方面较难普及。近年来 , 环介导等温扩增 (LAMP) 技术的发明为病原菌的检测提供了新的思路和研究方向。本发明研制了恒温扩增志贺菌核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果的方法，。

10、且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该志贺氏菌恒温扩增 - 核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，因此非常适用在基层检验机构使用，同时在突发公共卫生事件的现场检测与临床上的床边诊断上也具有很好的应用前景。 ( 三 ) 发明内容 0004 本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测志贺氏菌核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。 0005 本发明采用的技术方案是： 0006 本发明提供一种志贺氏菌的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成： 0007 (1)DN。

11、A 提取试剂 ( 优选 Takara 公司的 Bacterial Genomic DNA Extraction Kit( 货号 DV810A) ； 0008 (2) 恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、 1Thermol buffer、 MgSO4、 dNTPs 溶液、 Bst DNA 聚合酶和无菌双蒸水；其中： 0009 所述的外围引物分别为： 0010 所述正向外围引物为： 5 -GGCAGGGAAATGTTCCGC-3 (SEQ ID NO.2) ； 0011 反向外围引物为： 5 -GCTTCTGACCATGGCTTC。

12、G-3 (SEQ ID NO.3) ； 0012 所述两条探针的序列分别为： 0013 正向 5端 Biotin 标记探针： 5 -Biotin- 0014 CCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTT-3 (SEQ ID NO.4) ；说明书 CN 105420355 A 4 2/5 页 5 0015 反向 5端 FitC 标记探针： 5 -Fitc-TCCACTGCCGTGAAGGAA-3 (SEQ ID NO.5) ； 0016 所述两条扩增交叉引物分别为： 0017 扩增正向引物： 0018 5 -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACA。

13、TTGCCCG-3 0019 (SEQ ID NO.6) ； 0020 扩增反向引物： 0021 5 -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTTGCTGTCACTCCCGACA-3 0022 (SEQ ID NO.7) ； 0023 (3) 阳性对照：含有志贺氏菌 ipaH 基因片段的 DNA 质粒； 0024 (4) 阴性对照：无菌双蒸水。 0025 进一步，本发明所述的 1Thermol buffer 组成为： 20mM 的 Tris-HCl、 10mM 的 KCl、 10mM 的 (NH4)2SO4、 2mM 的 MgSO4以及质量浓度为 0.1的 Triton 。

14、X-100， pH 7.5。 0026 进一步，本发明所述阳性对照为含有长 216bp 的志贺氏菌 ipaH 基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列如下 (SEQ ID NO.1) ： 0027 GGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTT GTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGA AATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCG。

15、AAGCCATGGTCAGAAGC 0028 进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备： 0029 以包含扩增区域的志贺氏菌ipaH基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒(Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒(Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测 A280定量并稀释至 1 个拷贝 /l，获得阳性对照， -20保存。 0030 进一步，本发明所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各 10pmol，两条探针各 20pmol，两。

16、条交叉引物各 40pmol， 1Thermol buffer， MgSO4为 6mmol， dNTPs 溶液各 0.4mmol， Bst DNA 聚合酶 8U，无菌双蒸水组成补足至 25l。 0031 本发明还提供一种所述志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒的检测方法，所述检测方法为： 0032 a) 用 DNA 提取试剂从待检测的标本中提取 DNA ； 0033 b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在 65下扩增反应 35 分钟；标准阳性模板 ( 即阳性对照 ) 加入阳性对照 PCR 管中，标准阴性模板 ( 即阴性对照 ) 加入阴性对照。

17、PCR 管中，所述标准阳性模板为含有志贺氏菌 ipaH 基因片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水； 0034 c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司 3 号装置 ) 中进行检测， 2 分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时 (C、 T 线均为红色)，说明样品中含有志贺氏菌核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗 FitC 抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗 FitC 抗。

18、体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。 0035 在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试说明书 CN 105420355 A 5 3/5 页 6 剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA 合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的志贺氏菌核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度， Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了志贺氏菌核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出 10 个拷贝，。

19、可以满足快速检测志贺氏菌核酸的要求。 0036 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 0037 (1) 本发明所述志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高； 0038 (2) 反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需 1 小时左右； 0039 (3) 整个扩增和检测过程中不需要打开 PCR 管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器。 ( 四 ) 附图说明 0040 图 1 为核酸检测试纸条原理示意图。 0041 图2为特异性实验结果，图中1-16分别表示鲍氏志贺氏菌ATCC 8704、宋氏志贺氏。

20、菌CMCC 51592、痢疾志贺氏菌CMCC 51105、福氏志贺氏菌CMCC 51572、铜绿假单胞杆菌(绿脓杆菌 )ATCC 27853、金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、大肠埃希氏菌 ATCC 25922、阴沟肠杆菌 ATCC 13047、副溶血性弧菌 ATCC 17802、空肠弯曲菌 ATCC 33291、单增李斯特氏菌 ATCC 19111、伤寒沙门氏菌 CMCC 50071、鼠伤寒沙门氏菌 CMCC 50115、艰难梭菌 ATCC 9689、阳性对照品、阴性对照品的实验结果 0042 图 3 为敏感性实验，图中 1-6 分别表示 104拷贝。

21、 / 微升、 10 3拷贝 / 微升、 102拷贝 / 微升、 101拷贝 / 微升、 10 0拷贝 / 微升、阴性对照品的实验结果 ( 五 ) 具体实施方式 0043 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： 0044 实施例 1 本发明试剂盒的组成与配制 0045 a)DNA 提取试剂 ( 优选 Takara 公司的 Bacterial Genomic DNA Extraction Kit( 货号 DV810A) ； 0046 b) 志贺氏菌的核酸恒温扩增反应液：两条外围引物 (10pmol)，两条探针 (20pmol) 和两条交。

22、叉引物 (40pmol)， 1Thermol buffer， MgSO4(6mmol)， dNTPs 溶液 ( 各 0.4mmol)， Bst DNA 聚合酶 (8U) 和无菌双蒸水组成，总反应液体积为 25l ； 0047 正向外围引物为： 5 -GGCAGGGAAATGTTCCGC-3 ； 0048 反向外围引物为： 5 -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3 ； 0049 正向 5端 Biotin 标记探针： 0050 5 -Biotin-CCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTT-3 ； 0051 反向 5端 FitC 标记探针： 5 -Fitc-TCCACTG。

23、CCGTGAAGGAA-3 ； 0052 扩增正向引物：说明书 CN 105420355 A 6 4/5 页 7 0053 5 -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3 ； 0054 扩增反向引物： 0055 5 -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTTGCTGTCACTCCCGACA-3 ； 0056 所述的 1Thermol buffer 组成为： 20mM 的 Tris-HCl、 10mM 的 KCl、 10mM 的 (NH4)2SO4、 2mM 的 MgSO4以及质量浓度为 0.1的 Triton X-100，。

24、 pH 7.5。 0057 所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。 0058 c) 阳性对照：阳性对照为含有长 216bp 的志贺氏菌 ipaH 基因序列，序列如下： 0059 GGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTT GTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGA AATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAA。

25、GCCATGGTCAGAAGC 0060 阳性对照按如下步骤制备： 0061 以包含扩增区域的志贺氏菌 ipaH 基因基因片段为模板，通过两条外围引物进行 PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过 T-easy 质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测 A280定量并稀释至 20 个拷贝 /l， -20保存。 0062 d) 阴性对照：无菌双蒸水。 0063 实施例 2 用本发明试剂盒检测志贺氏菌核酸的具体方法 0064 a) 用志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒中 DNA 提取液从待检。

26、测的标本中提取 DNA。 0065 b)取标本DNA作为模板，加入到装有志贺氏菌恒温扩增反应液的PCR管中，其中标本 DNA3l，反应液 22l， 60扩增反应 35 分钟；阳性和阴性对照 PCR 管中分别加入阳性模板和阴性模板。 0066 c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司 3 号装置 ) 中进行检测， 2 分钟以后判读结果。当样本中含有志贺氏菌核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。 0067 反复重复实验 3 次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的。

27、试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要 1 个小时左右就能完成，大大缩短检测时间。 0068 实施例 3 用本发明试剂盒检测志贺氏菌的特异性 0069 按照实施例2的方法检测鲍氏志贺氏菌ATCC 8704、宋氏志贺氏菌CMCC 51592、痢疾志贺氏菌 CMCC 51105、福氏志贺氏菌 CMCC 51572、铜绿假单胞杆菌 ATCC 27853、金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、 0070 大肠埃希氏菌 ATCC 25922、阴沟肠杆菌 ATCC 13047、副溶血性弧菌 ATCC 17802、空肠弯曲菌 ATCC 33291、单增李斯特氏菌 ATCC 。

28、19111、伤寒沙门氏菌 CMCC 50071、鼠伤寒沙门氏菌 CMCC 50115、艰难梭菌 ATCC 9689 以及志贺氏菌检测试剂盒阳性对照品，结果显示用本发明试剂盒检测志贺氏菌核酸具有很强的特异性，除了鲍氏志贺氏菌 ATCC 8704、宋氏志贺氏菌 CMCC 51592、痢疾志贺氏菌 CMCC 51105、福氏志贺氏菌 CMCC 51572 和试剂盒阳性对照品，其他菌株检测均为阴性。如图 2 所示，图中 1-16 分别表示鲍氏志贺氏菌 ATCC 8704、宋氏志贺氏菌 CMCC 51592、痢疾志贺氏菌 CMCC 51105、福氏志贺氏菌 CMCC 5。

29、1572、说明书 CN 105420355 A 7 5/5 页 8 铜绿假单胞杆菌 ATCC 27853、金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、大肠埃希氏菌 ATCC 25922、阴沟肠杆菌 ATCC 13047、副溶血性弧菌 ATCC 17802、空肠弯曲菌 ATCC 33291、单增李斯特氏菌 ATCC 19111、伤寒沙门氏菌 CMCC 50071、鼠伤寒沙门氏菌 CMCC 50115、艰难梭菌 ATCC 9689、阳性对照品、阴性对照品的实验结果。 0071 实施例 4 用本发明试剂盒检测志贺氏菌核酸的灵敏度 0072 对含有志贺氏菌 ipaH 基因片段。

30、的质粒 DNA 进行定量，分别稀释至浓度为 104拷贝 / 微升、 103拷贝 / 微升、 10 2拷贝 / 微升、 101拷贝 / 微升、 100拷贝 / 微升，采用实施例 2 中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测志贺氏菌核酸的灵敏度。结果如图3所示，图中1-6 分别表示 104拷贝 / 微升、 10 3拷贝 / 微升、 102拷贝 / 微升、 101拷贝 / 微升、 100拷贝 / 微升、阴性对照品的实验结果，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出 10 个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测志贺氏菌的要求。说明书 CN 105420355 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序列表 CN 105420355 A 9 2/2 页 10 序列表 CN 105420355 A 10 1/2 页 11 图 1 说明书附图 CN 105420355 A 11 2/2 页 12 图 2 图 3 说明书附图 CN 105420355 A 12 。

摘要
申请专利号：	CN201510809447.8	申请日：	20151120
公开号：	CN105420355A	公开日：	20160323
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12Q1/68,C12Q1/04	主分类号：	C12Q1/68,C12Q1/04
申请人：	浙江省疾病预防控制中心
发明人：	梅玲玲,徐昌平,卢亦愚,冯燕,占利,须周恒
地址：	310051 浙江省杭州市滨江区滨盛路3399号
优先权：	CN201510809447A
专利代理机构：	杭州天正专利事务所有限公司	代理人：	黄美娟;李世玉
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内容摘要

本发明公开了一种志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包含DNA提取试剂、恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；核酸扩增反应全部恒定同一温度，恒温扩增仅需35min，核酸试纸条检测结果需1～2min，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需1h左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合志贺氏菌现场快速检测与排除。

权利要求书

1.一种志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：(1)DNA提取试剂；(2)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×ThermolBuffer，MgSO，dNTPs溶液，BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；所述正向外围引物为：5′-GGCAGGGAAATGTTCCGC-3′；反向外围引物为：5′-GCTTCTGACCATGGCTTCG-3′；所述两条探针的序列分别为：正向5′端Biotin标记探针：5′-Biotin-CCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTT-3′；反向5′端FitC标记探针：5′-Fitc-TCCACTGCCGTGAAGGAA-3′；所述两条扩增交叉引物分别为：扩增正向引物：5′-GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3′；扩增反向引物：5′-TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTTGCTGTCACTCCCGACA-3′；(3)阳性对照：含有志贺氏菌ipaH基因的DNA质粒；(4)阴性对照：无菌双蒸水。 2.如权利要求1所述志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述1×ThermolBuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH)SO、2mM的MgSO以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH7.5。 3.如权利要求1所述志贺氏菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有长216bp的志贺氏菌ipaH基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。 4.如权利要求1所述志贺氏菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照按如下步骤制备：以包含扩增区域的志贺氏菌ipaH基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒定量并稀释至1个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。 5.如权利要求1所述志贺氏菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各自10pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自40pmol，1×Thermolbuffer，MgSO为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，BstDNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μl。 6.一种权利要求1所述志贺氏菌恒温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述检测方法为：a)用DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA；b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在65℃下扩增反应35分钟；标准阳性模板加入阳性对照PCR管中，标准阴性模板加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有志贺氏菌ipaH基因片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有志贺氏菌ipaH基因DNA核酸。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种针对志贺氏菌核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对志贺氏菌的定性检测。

(二)背景技术

志贺氏菌(Shigella)是重要的肠道传染病的病原菌之一,为无动力、无芽胞的革兰阴性杆菌,具有肠杆菌科细菌的基本特性。据国内综合资料, 志贺氏菌在我国感染性腹泻病原菌中居首位。全世界每年有16470万例志贺氏菌感染病例,有110万人因此而死亡。志贺氏菌引起的细菌性痢疾常发现于人员大量集中的地方,如餐厅和食堂。与其相关的食品包括色拉、生蔬菜、奶和奶制品、肉禽、水果和面包制品等。因此,对志贺氏菌的快速检测具有重要的意义。

目前检测志贺氏菌的方法主要有传统分离培养、免疫学和分子水平的检测。在分子水平方面,传统PCR技术以高敏感性和特异性被广泛应用，但因其对设备要求较高，在基层应用方面较难普及。近年来,环介导等温扩增(LAMP)技术的发明为病原菌的检测提供了新的思路和研究方向。本发明研制了恒温扩增志贺菌核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果的方法，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该志贺氏菌恒温扩增- 核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，因此非常适用在基层检验机构使用，同时在突发公共卫生事件的现场检测与临床上的床边诊断上也具有很好的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测志贺氏菌核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种志贺氏菌的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：

(1)DNA提取试剂(优选Takara公司的BacterialGenomicDNA ExtractionKit(货号DV810A)；

(2)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO4、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

所述正向外围引物为：5′-GGCAGGGAAATGTTCCGC-3′(SEQID NO.2)；

反向外围引物为：5′-GCTTCTGACCATGGCTTCG-3′(SEQIDNO.3)；

所述两条探针的序列分别为：

正向5′端Biotin标记探针：5′-Biotin-

CCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTT-3′(SEQIDNO.4)；

反向5′端FitC标记探针：5′-Fitc-TCCACTGCCGTGAAGGAA-3′(SEQID NO.5)；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3′

(SEQIDNO.6)；

扩增反向引物：

5′-TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTTGCTGTCACTCCCGACA-3′

(SEQIDNO.7)；

(3)阳性对照：含有志贺氏菌ipaH基因片段的DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述的1×Thermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、 10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为 0.1％的TritonX-100，pH7.5。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长216bp的志贺氏菌ipaH基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列如下(SEQIDNO.1)：

GGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGG ATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTG GCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCG TGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGA CCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGC

进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的志贺氏菌ipaH基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒(Promega)对PCR 扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒 (Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至1个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。

进一步，本发明所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各 10pmol，两条探针各20pmol，两条交叉引物各40pmol，1×Thermolbuffer， MgSO4为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，BstDNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μl。

本发明还提供一种所述志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒的检测方法，所述检测方法为：

a)用DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA；

b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在65℃下扩增反应35分钟；标准阳性模板(即阳性对照) 加入阳性对照PCR管中，标准阴性模板(即阴性对照)加入阴性对照PCR 管中，所述标准阳性模板为含有志贺氏菌ipaH基因片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；

c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时(C、T线均为红色)，说明样品中含有志贺氏菌核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗FitC抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗FitC抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。

在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的志贺氏菌核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了志贺氏菌核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10个拷贝，可以满足快速检测志贺氏菌核酸的要求。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)本发明所述志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；

(2)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；

(3)整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器。

(四)附图说明

图1为核酸检测试纸条原理示意图。

图2为特异性实验结果，图中1-16分别表示鲍氏志贺氏菌ATCC 8704、宋氏志贺氏菌CMCC51592、痢疾志贺氏菌CMCC51105、福氏志贺氏菌CMCC51572、铜绿假单胞杆菌(绿脓杆菌)ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、阴沟肠杆菌ATCC 13047、副溶血性弧菌ATCC17802、空肠弯曲菌ATCC33291、单增李斯特氏菌ATCC19111、伤寒沙门氏菌CMCC50071、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115、艰难梭菌ATCC9689、阳性对照品、阴性对照品的实验结果

图3为敏感性实验，图中1-6分别表示104拷贝/微升、103拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升、100拷贝/微升、阴性对照品的实验结果

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1本发明试剂盒的组成与配制

a)DNA提取试剂(优选Takara公司的BacterialGenomicDNA ExtractionKit(货号DV810A)；

b)志贺氏菌的核酸恒温扩增反应液：两条外围引物(10pmol)，两条探针(20pmol)和两条交叉引物(40pmol)，1×Thermolbuffer， MgSO4(6mmol)，dNTPs溶液(各0.4mmol)，BstDNA聚合酶(8U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为25μl；

正向外围引物为：5′-GGCAGGGAAATGTTCCGC-3′；

反向外围引物为：5′-GCTTCTGACCATGGCTTCG-3′；

正向5′端Biotin标记探针：

5′-Biotin-CCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTT-3′；

反向5′端FitC标记探针：5′-Fitc-TCCACTGCCGTGAAGGAA-3′；

扩增正向引物：

5′-GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3′；

扩增反向引物：

5′-TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTTGCTGTCACTCCCGACA-3′；

所述的1×Thermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、 10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH7.5。

所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。

c)阳性对照：阳性对照为含有长216bp的志贺氏菌ipaH基因序列，序列如下：

GGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGG ATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTG GCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCG TGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGA CCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGC

阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的志贺氏菌ipaH基因基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至20个拷贝/μl，-20℃保存。

d)阴性对照：无菌双蒸水。

实施例2用本发明试剂盒检测志贺氏菌核酸的具体方法

a)用志贺氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒中DNA提取液从待检测的标本中提取DNA。

b)取标本DNA作为模板，加入到装有志贺氏菌恒温扩增反应液的 PCR管中，其中标本DNA3μl，反应液22μl，60℃扩增反应35分钟；阳性和阴性对照PCR管中分别加入阳性模板和阴性模板。

c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果。当样本中含有志贺氏菌核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。

反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要1个小时左右就能完成，大大缩短检测时间。

实施例3用本发明试剂盒检测志贺氏菌的特异性

按照实施例2的方法检测鲍氏志贺氏菌ATCC8704、宋氏志贺氏菌 CMCC51592、痢疾志贺氏菌CMCC51105、福氏志贺氏菌CMCC51572、铜绿假单胞杆菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923、

大肠埃希氏菌ATCC25922、阴沟肠杆菌ATCC13047、副溶血性弧菌 ATCC17802、空肠弯曲菌ATCC33291、单增李斯特氏菌ATCC19111、伤寒沙门氏菌CMCC50071、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115、艰难梭菌 ATCC9689以及志贺氏菌检测试剂盒阳性对照品，结果显示用本发明试剂盒检测志贺氏菌核酸具有很强的特异性，除了鲍氏志贺氏菌ATCC 8704、宋氏志贺氏菌CMCC51592、痢疾志贺氏菌CMCC51105、福氏志贺氏菌CMCC51572和试剂盒阳性对照品，其他菌株检测均为阴性。如图2所示，图中1-16分别表示鲍氏志贺氏菌ATCC8704、宋氏志贺氏菌 CMCC51592、痢疾志贺氏菌CMCC51105、福氏志贺氏菌CMCC51572、铜绿假单胞杆菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、阴沟肠杆菌ATCC13047、副溶血性弧菌ATCC17802、空肠弯曲菌ATCC33291、单增李斯特氏菌ATCC19111、伤寒沙门氏菌 CMCC50071、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115、艰难梭菌ATCC9689、阳性对照品、阴性对照品的实验结果。

实施例4用本发明试剂盒检测志贺氏菌核酸的灵敏度

对含有志贺氏菌ipaH基因片段的质粒DNA进行定量，分别稀释至浓度为104拷贝/微升、103拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升、100拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测志贺氏菌核酸的灵敏度。结果如图3所示，图中1-6分别表示104拷贝/微升、 103拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升、100拷贝/微升、阴性对照品的实验结果，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测志贺氏菌的要求。