通过乙酸代谢调控酿酒酵母风味物质的合成的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610056297.2 (22)申请日 2016.01.27 C12N 1/19(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区第十三大街 29 号 (72)发明人 陈叶福 肖冬光 钱泓 罗伟伟 薛星祥 郭学武 (74)专利代理机构 北京鼎佳达知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 11348 代理人 王伟锋 (54) 发明名称 通过乙酸代谢调控酿酒酵母风味物质的合成 的方法 (57) 摘要 本发明属于生物工程技术领域， 具体涉及通 过乙酸代。

2、谢调控酿酒酵母风味物质的合成的方 法。 通过强化乙酸合成途径、 削弱乙酸分解途径或 外源添加乙酸的方法使细胞适量积累乙酸， 可一 步降低酿酒酵母高级醇、 乙醛和乙酸乙酯的生成 量， 适量提高乙酸的生成量。 该方法为调控酒类产 品中风味物质提供了新的途径， 在不影响酿酒酵 母基本发酵性能的前提下， 从整体上降低所有高 级醇、 酯以及乙醛等微量风味物质的生成， 提高酒 品的纯净度。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表4页 附图1页 CN 105505807 A 2016.04.20 CN 105505807 A 。

3、1.一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 通过使细胞积累乙酸， 从而一 步降低酿酒酵母高级醇、 乙醛和乙酸乙酯的生成量。 2.如权利要求1所述的一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 所述使细 胞积累乙酸的方法为强化乙酸合成途径， 包括丙酮酸脱羧酶、 乙醛脱氢酶、 乙醇脱氢酶、 乙 酰辅酶A水解酶活力的提高。 3.如权利要求1所述的一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 所述使细 胞积累乙酸的方法为削弱乙酸分解途径， 具体为乙酰辅酶A合成酶活力的削弱。 4.如权利要求1所述的一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 所述使细 胞积累乙酸的方法为发。

4、酵过程中外源添加乙酸。 5.如权利要求2所述的一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 所述酶活 力提高的具体方法包括： 诱变、 酶定向进化或者基因表达水平的上调。 6.如权利要求3所述的一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 所述酶活 力削弱的具体方法包括诱变、 酶定向进化或者基因表达水平的下调。 7.如权利要求2所述的一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 乙醛脱氢 酶活力提高的具体方法为构建一株基因工程菌， 所述基因工程菌通过在酿酒酵母中过表达 乙醛脱氢酶的表达基因ALD6基因， 达到降低酒品中高级醇、 乙酸乙酯及乙醛含量并增加乙 酸生成量的目的； 所述。

5、酿酒酵母具体为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315； 所述ALD6基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。 8.如权利要求7所述的一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 所述基因 工程菌在酿酒过程中的应用。 9.如权利要求4所述的一种调控酿酒酵母风味物质合成的方法， 其特征在于， 所述乙酸 的添加量为2-20mg/L发酵液， 添加时间为发酵24h时。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505807 A 2 通过乙酸代谢调控酿酒酵母风味物质的合成的方法 技术领域： 0001 本发明属于生物工程技术领域， 涉及工业微生物育种和酒类酿造， 。

6、具体涉及通过 乙酸代谢调控酿酒酵母高级醇、 乙酸、 酯、 醛等风味物质的合成。 背景技术： 0002 醇、 酸、 酯、 醛等风味物质决定着酒的品质， 对于所有酒品都不可或缺， 但其在特定 酒品中的含量必需适宜， 过多或过少都会对酒的品质产生负面影响。 0003 高级醇是乙醇之外的重要醇类风味化合物， 主要包括正丙醇、 异丁醇、 异戊醇(约 占高级醇总量的50左右)、 活性戊醇和 -苯乙醇等， 每种高级醇都有自己独特的呈味特 征， 不同的醇酯比赋予了每种酒种与众不同的香味。 然而， 高级醇含量若超过一定标准， 不 仅使酒体产生异杂味， 影响酒的品质， 而且会使消费者产生 “头晕、 头疼” 等症状。

7、， 俗称 “上 头” ， 危害人体健康。 当前， 高级醇含量在所有酒类当中均偏高， 因此需要降低高级醇的含 量。 0004 乙酸乙酯等酯类对于各种酒的香气至关重要， 尤其对于中国白酒而言， 酯的种类 和含量是不同香型白酒分类的主要依据。 但酯含量并不是越高越好， 酒体中酯含量过高， 会 使得香气过于突出， 不协调。 高浓啤酒发酵过程， 会产生过多的乙酸乙酯等酯类， 影响啤酒 的风味。 0005 有机酸是重要的呈味物质， 酸也是形成酒的 “后味” 的重要物质。 含酸量太少的酒, 酒味寡淡， 后味短， 苦涩有异杂味； 含酸量过大的酒， 则酒味粗糙。 适量的酸在酒中能起到缓 冲和调味作用， 可消除饮。

8、后上头和口感不协调现象。 乙酸是主要的调味酸， 酿酒过程中乙酸 主要是由酿酒酵母之外的杂菌产生的， 酿酒酵母本身产乙酸能力严重不足， 对于通过酿酒 酵母单一纯种发酵， 严控杂菌污染的酿酒过程， 需要适量提高酿酒酵母的产乙酸能力。 0006 乙醛是酒中的挥发性香味物质， 低浓度的乙醛具有愉快的水果香气。 但乙醛浓度 较高时， 会产生类似青草味等不愉快气味。 乙醛是饮酒易上头的一个主要因素， 且是一种潜 在的致癌物质， 高乙醛含量的酒对饮酒者身体是有害无益的， 乙醛在酒中绝非有益成分。 乙 醛一般是酿酒酵母乙醇发酵过程的产生的， 一些乳酸菌和醋酸菌等杂菌也会产生乙醛， 对 于避免杂菌污染的纯种酿酒。

9、酵母酒类酿造过程， 降低酿酒酵母自身的乙醛生成能力， 有助 于提高酒品的饮用安全性。 0007 酒体中高级醇、 乙醛等有害物质， 以及酯和酸类物质的控制， 大多是通过从发酵工 艺上着手的， 例如， 申请号为2012101252759的一种低乙醛啤酒及其制备方法， 通过调整啤 酒发酵温度， 延长发酵时间， 并控制其他发酵参数， 使得发酵后的半成品啤酒的乙醛含量低 于 8mg/L。 对于高级醇这一特定物质， 可以从酿酒酵母的高级醇代谢途径入手， 通过基因 工程改造实现高级醇含量的降低。 申请号为201010227788.1的低产高级醇酿酒酵母工程菌 及其构建方法， 通过氨基酸转氨酶编码基因(BAT。

10、2)的缺失实现了转化子菌株比亲本菌株的 异丁醇、 异戊醇含量分别降低了55.19、 34.43， 总高级醇含量降低了35.01。 总体来 看， 缺乏对醇、 醛、 酸、 酯等风味物质一次性全局调控的方法。 说明书 1/10 页 3 CN 105505807 A 3 0008 从代谢的角度分析， 乙醛经由乙醛脱氢酶生成乙酸， 当乙酸合成途径增强， 胞内乙 酸含量提高时， 作为底物的乙醛含量将有所降低； 乙酸作为合成乙酸乙酯的前体物质， 当胞 内乙酸含量提高时， 会增强乙酸乙酯的合成。 而本发明在实验过程， 通过适量提高胞内乙酸 含量后， 除了降低乙醛含量外， 还意外的发现酒中高级醇和酯等风味物质含。

11、量均有所降低。 0009 并且， 现有技术中尚未出现通过调节乙酸达到对醇、 醛、 酸、 酯等风味物质一次性 全局调控的方法。 因此， 本发明通过强化酵母胞内生成乙酸的水平， 或外源添加乙酸的方 法， 从全局上调控醇、 醛、 酸、 酯等的风味物质的生成。 发明内容： 0010 为了实现上述目的， 本发明基于酿酒酵母的乙酸代谢， 提供一种通过使细胞积累 乙酸， 从而达到对醇、 醛、 酸、 酯等风味物质进行一次性全局调控的方法。 通过本方法， 可一 步降低酿酒酵母高级醇、 乙醛和乙酸乙酯的生成量， 适量提高乙酸的生成量。 0011 所述使细胞积累乙酸的方法， 包括但不限于以下途径： 0012 (1)。

12、强化乙酸合成途径， 包括丙酮酸脱羧酶(PDC1基因)， 乙醛脱氢酶(ALD1基因， ALD2基因， ALD3基因， ALD6基因)， 乙醇脱氢酶(ADH2基因)， 乙酰辅酶A水解酶(ACH1基因)等 乙酸生物合成所涉酶活力的提高。 具体方法包括诱变、 酶定向进化或者基因表达水平的上 调。 0013 (2)削弱乙酸分解途径， 乙酰辅酶A合成酶(ACS1基因， ACS2基因)活力的削弱。 具体 方法包括诱变、 酶定向进化或者基因表达水平的下调。 0014 (3)外源添加乙酸途径， 即在发酵液中添加适量的乙酸； 0015 所述乙酸的添加量为2-20mg/L发酵液； 0016 所述乙酸的添加时间为发酵。

13、24h时。 0017 本发明还提供一株基因工程菌， 所述基因工程菌通过在酿酒酵母中过表达乙醛脱 氢酶的表达基因ALD6基因， 达到降低酒品中高级醇、 乙酸乙酯及乙醛含量并增加乙酸生成 量的目的； 0018 所述ALD6基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示； 0019 优选地， 所述酿酒酵母具体为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315。 0020 有益效果： 0021 本发明所述技术内容为调控酒类产品中风味物质提供了新的途径， 通过胞内乙酸 水平的适度升高能够从全局调控酿酒酵母的生理代谢， 在不影响酿酒酵母基本发酵性能的 前提下， 从整体上降低高级醇、 。

14、酯以及乙醛等微量风味物质的生成， 提高酒品的纯净度。 同 时， 乙酸生成量可适增加， 可提高酒品风味丰富度和协调性， 有助于提高酒质， 具体如下： 0022 1、 本发明所提供的过表达乙醛脱氢酶ALD6基因的菌株， 与亲本菌株相比， 玉米浓 醪白酒发酵结束后， 乙酸含量为原菌的5.8倍， 乙醛的含量降低了49.97， 正丙醇的含量降 低了49.58， 异丁醇的含量降低了22.8， 异戊醇的含量降低了43.1， 乙酸乙酯的含量 降低了54.95。 0023 2、 本发明所提供的过表达乙醛脱氢酶ALD6基因的菌株， 模拟高粱原料固态白酒发 酵实验时， 乙酸的含量提高了1 .40倍， 乙醛的含量降低。

15、了81 .44， 异丁醇含量降低了 34.66， 异戊醇降低了49.52， 苯乙醇降低了64.89， 乙酸乙酯含量降低了27.20。 说明书 2/10 页 4 CN 105505807 A 4 0024 3、 本发明所提供的过表达乙醛脱氢酶ALD6基因的菌株， 高浓啤酒发酵结束后， 乙 酸的含量为原菌的1.9倍， 乙醛的含量降低了9.33， 正丙醇的含量降低了60.8， 异丁醇 的含量降低了21.7， 异戊醇的含量降低了25.9， 乙酸乙酯降低了37.3。 0025 4、 通过外源乙酸添加的方式使胞内适量积累乙酸的效果： 在玉米浓醪发酵培养条 件下， 在发酵的24h后添加6.2mg/L的乙酸，。

16、 发酵结束后测得酒样中的正丙醇的含量降低了 18.61， 异丁醇的含量与对照相比没有太大差别， 异戊醇的含量降低了41.71， 乙酸乙酯 降低了12.36， 乙酸的含量提高了90.70。 附图说明： 0026 图1为酿酒酵母中乙酸的代谢图； 0027 图2重组质粒Yep-PAK的构建流程示意图； 0028 图3构建重组质粒Yep-PAK的PCR验证电泳图 0029 其中， 泳道M为5000bpDNALadderMarker； 泳道1为以酿酒酵母 5为模版PCR扩增 到的1503bpALD6； 泳道2为以Yep-PAK为模版扩增到的1503bpALD6； 泳道3为以Yep-PAK为 模版扩增到的。

17、3203bpPGK1P-ALD6； 泳道4为以酵母基因组为模版扩增到的1613bp的KANMX 片段； 泳道5为以Yep-PAK为模版扩增到的1613bp的KANMX片段； 泳道6为以Yep-PAK为模版扩 增到的5020bp的A-PGK1P-ALD6-PGK1T-KANMX-B片段。 0030 图4重组片段与酵母基因组的同源重组示意图； 0031 图5重组酿酒酵母菌株的PCR验证凝胶电泳图 0032 其中， 泳道1为原始菌株 5为模版PCR的上游定点验证的阴性对照； 泳道2为以重组 转化子为模版PCR的581bp的上游定点验证片段； 泳道3为原始菌株 5为模版PCR的下游定点 验证的阴性对照。

18、； 泳道4为以重组转化子为模版PCR的1077bp的下游定点验证片段。 具体实施方式： 0033 下面通过具体的实施方案叙述本发明。 除非特别说明， 本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。 另外， 实施方案应理解为说明性的， 而非限制本发明的 范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。 对于本领域技术人员而言， 在不背离本 发明实质和范围的前提下， 对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。 0034 本发明所使用的酿酒酵母单倍体菌体是可以采用任何来源的酿酒酵母单倍体菌 株。 0035 实施例1： 适量积累胞内乙酸含量的菌株 5-A6。

19、的构建 0036 (1)基因工程菌株的构建 0037 1)Yep-PAK质粒的构建 0038 以Yep-PGK1为基础质粒构建重组质粒Yep-PAK， 构建流程如图2所示， 以酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)CICC32315单倍体 5基因组为模板， ALD6-U、 ALD6-D为引物， PCR扩增得到1503bp的乙醛脱氢酶基因ALD6， 通过XhoI单酶切插入到Yep-PGK1质粒上的启 动子PGK1p和终止子PGK1T之间， 得到质粒Yep-PA； 以pUG6为模板， KAN-U、 KAN-D为引物， PCR 扩增获得1613bp的KanMX基因， SphI分。

20、别酶切KanMX基因和质粒Yep-PA， 用SolutionI连接 说明书 3/10 页 5 CN 105505807 A 5 酶连接， 构成重组质粒Yep-PAK； 整个过程所用引物的序列如表1。 0039 表1PCR引物 0040 0041 0042 图3为重组质粒Yep-PAK的验证电泳图： 其中泳道M为5000bpDNALadderMarker； 泳道1为以酿酒酵母 5为模版PCR扩增到的1503bpALD6； 泳道2为以Yep-PAK为模版扩增到 的1503bpALD6； 泳道3为以Yep-PAK为模版扩增到的3203bpPGK1P-ALD6； 泳道4为以酵母基 因组为模版扩增到的1。

21、613bp的KANMX片段； 泳道5为以Yep-PAK为模版扩增到的1613bp的 KANMX片段； 泳道6为以Yep-PAK为模版扩增到的5020bp的A-PGK1P-ALD6-PGK1T-KANMX-B片 段。 0043 2)重组酿酒酵母菌株的构建 0044 以柠檬酸合酶CIT2基因的上下同源区间A、 B分别添加到PGK1上游引物ALD6-U及 KANMX下游引物KAN-D的5 端， 构成新的长引物P-U及K-D； 以重组质粒Yep-PAK为模板， 长引 物PCR扩增获得重组片段A-PGK1P-ALD6-PGK1T-KANMX-B， 用醋酸锂转化法将其转化入酿酒酵 母CICC32315单倍。

22、体 5中， 得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株 5-A6。 0045 重组酿酒酵母菌株的验证： 0046 根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列， 分别设计两组定 点验证上下游引物， 分别以生长较好的转化子基因组为模板， 进行PCR扩增， 验证重组子。 0047 分别以引物A-U/A-D和B-U/B-D进行上、 下游定点PCR验证， 其中上游引物A-U/A-D 的PCR产物经0.8的琼脂糖凝胶电泳， 可看到一条大小约581bp左右的特异性条带， 其大小 与预期相当； 下游引物B-U/B-D的PCR产物经0.8的琼脂糖凝胶电泳， 可看到一条大小约 1077bp左右的特异性。

23、条带， 其大小与预期相当， 说明重组盒A-PGK1P-ALD6-PGK1T-KANMX-B片 段已成功重组到酿酒酵母基因组中， 并且重组位置也正确。 电泳结果如图5所示。 0048 图5中M为5000bpDNALadderMarker， 泳道1为原始菌株 5为模版PCR的上游定点 验证的阴性对照； 泳道2为以重组转化子为模版PCR的581bp的上游定点验证片段； 泳道3为 说明书 4/10 页 6 CN 105505807 A 6 原始菌株 5为模版PCR的下游定点验证的阴性对照； 泳道4为以重组转化子为模版PCR的 1077bp的下游定点验证片段。 0049 实施例2： 5-A6模拟玉米原料。

24、液态白酒发酵实验 0050 1)发酵工艺路线： 0051 玉米粉浸泡液化糖化冷却接菌发酵蒸酒测定指标 0052 2)工艺条件： 浸泡条件： 60670， 浸渍20min； 液化条件： 85690， 加入耐高温 -淀 粉酶， 液化90min； 糖化条件： 55660， 加入糖化酶和营养盐， 糖化20min； 酸化条件： 45， 加 入酸性蛋白酶， 20min； 发酵条件： 30， 4天。 蒸酒时取100mL醪液， 加100mL水， 蒸出100mL酒 样。 0053 3)配料： 玉米粉： 60g； 加水130mL； 耐高温 -淀粉酶： 30 L； 糖化酶： 90 L； 酸性蛋白 酶： 1.2mL；。

25、 营养盐： 1mL； 接种量： 7.5； 0054 按上述模拟工艺对酿酒酵母工程菌 5-A6和出发菌株 5分别进行玉米浓醪白酒发 酵实验； 发酵期间每隔12h振荡并称重， 记录失重； 发酵结束后， 停止培养并称重； 测定发酵 液的残糖浓度、 酒精体积分数以及主要香气成分含量。 以发酵能力、 残糖浓度和产物生成量 表征其综合性能， 结果见表2、 3。 0055 表2玉米原料液态白酒发酵的发酵性能 0056 0057 表2表明， 本发明所获得的酿酒酵母工程菌与初始的原菌相比， 模拟玉米原料液态 白酒发酵实验时， 酒精度和CO2失重与对照相比几乎没有差别， 残糖含量略有升高。 0058 表3玉米原料。

26、液态白酒发酵的风味物质 0059 0060 表3 表明 ， 本发明 所获 得的 低产高 级醇 及乙 酸乙 酯的 酿酒 酵 母工程 菌 (Saccharomycescerevisiae) 5-A6与初始的酿酒酵母菌 5相比： 玉米浓醪白酒发酵结束 后， 转化子菌株与亲本菌株相比， 乙酸的含量为原菌的5.8倍， 乙醛的含量比对照菌株降低 了49.97， 正丙醇的含量比对照菌株降低了49.58， 异丁醇的含量比对照菌株降低了 22.8， 异戊醇的含量比对照菌株降低了43.1， 乙酸乙酯的含量比对照降低了54.95。 0061 实施例3： 5-A6模拟高粱原料固态白酒发酵实验 0062 1)发酵工艺路。

27、线： 0063 高粱润料加稻壳蒸煮摊晾接菌发酵蒸馏 说明书 5/10 页 7 CN 105505807 A 7 0064 2)工艺条件： 浸泡条件： 80混匀， 充分吸水无硬心； 蒸煮条件： 加入稻壳常压蒸 60min左右， 颗粒均匀、 内心无白。 发酵条件： 30， 5天。 蒸酒条件： 100g原料， 加200mL水， 蒸 出100mL酒样。 0065 3)配料： 高粱100g； 稻壳20g； 接种量： 0.6亿/g原料； 0066 按上述模拟工艺对酿酒酵母重组菌株 5-A6和出发菌株 5分别进行高粱原料固态 白酒发酵实验； 发酵期间每隔12h振荡并称重， 记录失重； 发酵结束后， 停止培养。

28、并称重； 测 定发酵液的残糖浓度、 酒精体积分数以及主要香气成分含量。 以CO2失重、 残糖量和酒精度 表征其综合性能， 结果见表4、 5。 0067 表4固态大曲白酒发酵的发酵性能和香味物质 0068 0069 表4表明： 本发明所获得的酿酒酵母重组菌与初始的原菌相比， 模拟高粱原料固态 白酒发酵实验时， 酒精度、 失重和残糖含量均没有太大变化。 0070 表5玉米原料液态白酒发酵的风味物质 0071 0072 表5表明： 本发明所获得的酿酒酵母工程菌与初始的原菌相比， 模拟高粱原料固态 白酒发酵实验时， 异丁醇含量比对照降低了34.66， 异戊醇降低了49.52， 苯乙醇降低了 64.89。

29、， 乙酸乙酯含量降低了27.20， 乙酸的含量提高了1.40倍， 乙醛的含量降低了 81.44。 0073 实施例4： 5-A6啤酒发酵实验 0074 (1)麦芽汁的制备 0075 采用全麦芽工艺， 将粉碎的大麦芽按照1:4(w:w)的料水比与52的热水混合 40min， 然后65条件下糖化约1h， 升温至72， 保持15min， 再升温至78， 保持10min。 糖化 液用纱布过滤， 然后将滤液煮沸约1h， 期间添加0.4的酒花， 煮沸结束后过滤， 控制麦汁浓 度为18 Brix。 0076 (2)种子培养 0077 菌种活化： 保存菌种转接至YEPD斜面试管28活化培养2d。 0078 一。

30、级种子培养： 取斜面菌种一环， 接种于装有5mL的18 Brix麦汁培养基的试管 中， 在28、 180rpm条件下培养24h。 0079 二级种子培养： 一级种子液按10的接种量接入盛有50mL的18 Brix麦汁的 说明书 6/10 页 8 CN 105505807 A 8 150mL三角瓶内， 16静置培养72h。 0080 (3)高浓啤酒发酵 0081 二级种子液经过离心得到酵母泥， 酵母泥按0.5的接种量接入盛有300mL的18 Brix麦汁的500mL三角瓶内， 10静置发酵。 发酵期间每隔12h振荡并称重， 记录失重； 发酵 结束后， 停止培养并称重； 测定发酵液的残糖浓度、 酒。

31、精体积分数以及主要香气成分含量。 以发酵能力、 残糖浓度和产物生成量表征其综合性能， 结果见表6、 7。 0082 表6高浓啤酒发酵的发酵性能 0083 0084 由表6可知， 本发明所获得的酿酒酵母工程菌 5-A6与初始的原菌 5相比， 高浓啤 酒发酵实验时， 酒精度稍有降低， 残糖含量稍有增加。 0085 表7高浓啤酒发酵的风味物质 0086 0087 表7可 知 ， 本发明 所获 得的 低产高 级醇 及乙 酸乙 酯的 酿酒 酵 母工程 菌 (Saccharomycescerevisiae) 5-A6与初始的酿酒酵母菌 5相比： 高浓啤酒发酵结束后， 转 化子菌株与亲本菌株相比， 乙酸的含。

32、量为原菌的1.9倍， 乙醛的含量比对照降低了9.33， 正丙醇的含量比对照菌株降低了60.8， 异丁醇的含量比对照菌株降低了21.7， 异戊醇 的含量比对照菌株降低了25.9， 乙酸乙酯降低了37.3。 0088 实施例5： 5浓醪发酵过程中外源添加乙酸实验 0089 1)发酵工艺路线： 0090 玉米粉浸泡液化糖化冷却接菌发酵蒸酒测定指标 0091 2)工艺条件： 浸泡条件： 60670， 浸渍20min； 液化条件： 85690， 加入耐高温 -淀 粉酶， 液化90min； 糖化条件： 55660， 加入糖化酶和营养盐， 糖化20min； 酸化条件： 45， 加 入酸性蛋白酶， 20min。

33、； 发酵条件： 30， 4天。 蒸酒时取100mL醪液， 加100mL水， 蒸出100mL酒 样。 0092 3)配料： 玉米粉： 60g； 加水210mL； 耐高温 -淀粉酶： 30 L； 糖化酶： 90 L； 酸性蛋白 酶： 1.2mL； 营养盐： 1mL； 接种量： 7.5； 0093 按上述模拟工艺出发菌株 5进行玉米浓醪白酒发酵实验， 在发酵的24h时在发酵 液中加入6.2mg/L的乙酸； 发酵期间每隔12h振荡并称重， 记录失重； 发酵结束后， 停止培养 并称重； 测定发酵液的残糖浓度、 酒精体积分数以及主要香气成分含量。 以发酵能力、 残糖 浓度和产物生成量表征其综合性能， 结果。

34、见表8、 9。 说明书 7/10 页 9 CN 105505807 A 9 0094 表8外源添加乙酸的发酵性能 0095 0096 由表8可知， 在发酵液中加入适量含量的乙酸后， CO2失重， 酒精度及残糖含量几乎 没有差别。 0097 表9外源添加乙酸发酵产生的风味物质 0098 0099 由表9可知， 在发酵液中加入乙酸后， 正丙醇的含量降低了18.61， 异丁醇的含量 与对照相比没有太大差别， 异戊醇的含量降低了41.71， 乙酸乙酯降低了12.36， 乙酸的 含量提高了90.70。 0100 实施例6： 5浓醪发酵过程中外源添加2mg乙酸实验 0101 1)发酵工艺路线： 0102 。

35、玉米粉浸泡液化糖化冷却接菌发酵蒸酒测定指标 0103 2)工艺条件： 浸泡条件： 60670， 浸渍20min； 液化条件： 85690， 加入耐高温 -淀 粉酶， 液化90min； 糖化条件： 55660， 加入糖化酶和营养盐， 糖化20min； 酸化条件： 45， 加 入酸性蛋白酶， 20min； 发酵条件： 30， 4天。 蒸酒时取100mL醪液， 加100mL水， 蒸出100mL酒 样。 0104 3)配料： 玉米粉： 60g； 加水210mL； 耐高温 -淀粉酶： 30 L； 糖化酶： 90 L； 酸性蛋白 酶： 1.2mL； 营养盐： 1mL； 接种量： 7.5； 0105 按上述。

36、模拟工艺出发菌株 5进行玉米浓醪白酒发酵实验， 在发酵的24h时在发酵 液中加入2mg/L的乙酸； 发酵期间每隔12h振荡并称重， 记录失重； 发酵结束后， 停止培养并 称重； 测定发酵液的残糖浓度、 酒精体积分数以及主要香气成分含量。 以发酵能力、 残糖浓 度和产物生成量表征其综合性能， 结果见表10、 11。 0106 表10外源添加乙酸的发酵性能 0107 0108 由表10可知， 在发酵液中加入适量含量的乙酸后， CO2失重， 酒精度及残糖含量几 说明书 8/10 页 10 CN 105505807 A 10 乎没有差别。 0109 表11外源添加乙酸发酵产生的风味物质 0110 01。

37、11 由表11可知， 在发酵液中加入乙酸后， 正丙醇的含量降低了6.65， 异丁醇的含量 与对照相比没有太大差别， 异戊醇的含量降低了13.23， 乙酸乙酯与对照相比没有太大区 别， 乙酸的含量提高了18.68。 0112 实施例7： 5浓醪发酵过程中外源添加20mg乙酸实验 0113 1)发酵工艺路线： 0114 玉米粉浸泡液化糖化冷却接菌发酵蒸酒测定指标 0115 2)工艺条件： 浸泡条件： 60670， 浸渍20min； 液化条件： 85690， 加入耐高温 -淀 粉酶， 液化90min； 糖化条件： 55660， 加入糖化酶和营养盐， 糖化20min； 酸化条件： 45， 加 入酸性蛋。

38、白酶， 20min； 发酵条件： 30， 4天。 蒸酒时取100mL醪液， 加100mL水， 蒸出100mL酒 样。 0116 3)配料： 玉米粉： 60g； 加水210mL； 耐高温 -淀粉酶： 30 L； 糖化酶： 90 L； 酸性蛋白 酶： 1.2mL； 营养盐： 1mL； 接种量： 7.5； 0117 按上述模拟工艺出发菌株 5进行玉米浓醪白酒发酵实验， 在发酵的24h时在发酵 液中加入20mg/L的乙酸； 发酵期间每隔12h振荡并称重， 记录失重； 发酵结束后， 停止培养并 称重； 测定发酵液的残糖浓度、 酒精体积分数以及主要香气成分含量。 以发酵能力、 残糖浓 度和产物生成量表征其。

39、综合性能， 结果见表12、 13。 0118 表12外源添加乙酸的发酵性能 0119 0120 由表12可知， 在发酵液中加入适量含量的乙酸后， CO2失重， 酒精度及残糖含量几 乎没有差别。 0121 表13外源添加乙酸发酵产生的风味物质 0122 说明书 9/10 页 11 CN 105505807 A 11 0123 由表13可知， 在发酵液中加入乙酸后， 正丙醇的含量降低了48.88， 异丁醇的含 量降低了66.46， 异戊醇的含量降低了66.20， 乙酸乙酯降低了57.12， 乙酸的含量提 高了3.10倍。 说明书 10/10 页 12 CN 105505807 A 12 0001 序列表 1/4 页 13 CN 105505807 A 13 0002 序列表 2/4 页 14 CN 105505807 A 14 0003 序列表 3/4 页 15 CN 105505807 A 15 0004 序列表 4/4 页 16 CN 105505807 A 16 图1 图2 图3 图4 图5 说明书附图 1/1 页 17 CN 105505807 A 17 。