来源于拟南芥的GATA2蛋白在调节水稻发育中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102766201 A (43)申请公布日 2012.11.07 CN 102766201 A *CN102766201A* (21)申请号 201210210706.1 (22)申请日 2012.06.20 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院植物研究所 地址 100093 北京市海淀区香山南辛村 20 号 (72)发明人 林文慧 王志勇 黄慧雅 罗小敏 胡雨微 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54)。

2、 发明名称 来源于拟南芥的 GATA2 蛋白在调节水稻发育 中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种来源于拟南芥的 GATA2 蛋 白在调节调节植物生长发育中的应用。本发明所 提供的应用具体为由序列表中序列 2 所示的氨基 酸序列组成的蛋白质在调节单子叶植物生长发育 中的应用。 实验证明， 由序列表中序列2所示的氨 基酸序列组成的蛋白质能够调节单子叶植物的成 株株高和 / 或杨花时间和 / 或分蘖数量 ； AtGATA2 过表达的转基因水稻植株与对照未转基因植株相 比， 生长健旺、 植株高大、 分蘖增多、 杨花提前。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 6 页。

3、 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 6 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质在调节单子叶植物生长发育中 的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述单子叶植物为水稻。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于 ： 所述生长发育体现在成株株高和/或 杨花时间和 / 或分蘖数量上。 4. 一种培育株高变高和 / 或杨花提前和 / 或分蘖增多的转基因水稻的方法， 包括如下 步骤 ： 将由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编。

4、码基因导入目的水稻中， 得到转基因水稻 ； 所述转基因水稻与所述目的水稻相比株高变高和 / 或杨花提前和 / 或分 蘖增多。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述蛋白质的编码基因为如下 1） 或 2） 的 DNA 分子 ： 1） 其编码序列如序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ； 2） 序列表中序列 3 所示的 DNA 分子。 6. 根据权利要求 4 或 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述蛋白质的编码基因通过含有所 述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的水稻。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述重组表达载体中启动所述编码基因 转录的启。

5、动子为 35S 启动子。 8. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述转基因水稻为表达所述编码基因的 转基因水稻。 权 利 要 求 书 CN 102766201 A 2 1/8 页 3 来源于拟南芥的 GATA2 蛋白在调节水稻发育中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种来源于拟南芥的 GATA2 蛋白在调节植物生长发育中的应用， 具体 涉及由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质在调节水稻生长发育中的应用。 背景技术 0002 拟南芥是植物遗传学和分子生物学研究的重要模式材料， 具有植株小、 生命周期 短、 结子多、 生活力强、 基因组小、 序列信息全、 易产生或诱。

6、发突变、 研究基础好等众多优点。 通过对拟南芥基因功能的研究， 科学家们寻找到了很多有利于作物增产增收的植物发育调 控机制。 0003 光能对于植物生长发育及其重要， 它不仅可以提供植物生长必须的能量， 而且还 是促进植物正常形态建成的信号， 研究植物光反应的机制， 提高植物的光反应和光能利用 效率， 是作物增产的重要途径。 0004 油菜素甾醇类物质 (Brassinosteroids， BRs) 是一类重要的植物激素。已证明 BR 在植物的种子休眠与萌发、 器官分化、 维管组织发育、 开花和衰老、 以及向性建成等生长发 育的重要过程中起到重要调控作用。BR 与其它信号分子例如光之间存在密切。

7、联系， 与其他 激素存在相互作用及调节。已有研究表明， BR 可以诱导一系列细胞内反应， 如茎的延长， 花 粉管的延长， 叶片的弯曲和偏上性生长。BR 在一定浓度下会抑制根的生长， 诱导乙烯的合 成， 促使质子泵活化， 以及调节相关基因表达。 BR对我国最重要的农作物水稻具有特异性的 作用， BR 的浓度与水稻叶夹角直接相关， 叶夹角的大小是株型的主要指标之一， 减小叶夹角 可以增大水稻合理密植的程度， 涉及重大农业性状改良， 具有高度的科研和生产价值。 0005 近年来在双子叶模式植物拟南芥中对于 BR 信号转导途径的研究已经取得了突破 性的进展。BR 广泛调节植物的生长发育以及对外界环境因。

8、子变化的反应， 在作物上的应用 也已引起人们的广泛兴趣。对于 BR 的合成和活性水平， 目前的研究主要集中在少量的突变 体上， 如拟南芥的 det2、 cpd 和 dwarf， 它们共同的表型是矮小、 卷叶、 叶深绿、 育性下降等 ； 还有水稻的 d61， brd 等， 它们的共同表型是矮小、 叶夹角减小、 育性下降等。对于 BR 信号的 感受和转导， 植物中的 BR 是通过识别细胞表面的受体来进行信号传递的。植物 BR 信号转 导的研究由突变体的分析开始， 对 BR 不敏感的突变体及它们的抑制子的遗传学研究已经 鉴定到好几个 BR 信号传导途径的关键组分， BR 的信号转导过程已经清晰。 0。

9、006 光对生物的作用不只是提供光合作用的能量， 对植物和微生物来说还是一个重要 的光形态建成信号。det2， cpd， dwf4 等 BR 合成相关突变体暗中生长时表现出去黄化的特 征， 可能是由于突变导致暗中诱导了部分光控基因的表达， 预示 BR 信号转导与光反应有着 密切的联系， BR和光信号在信号传递过程中可以相互作用。 研究表明光信号可以调控BR的 合成途径， BR 的信号转导参与调节不同光照条件下的向性反应。拟南芥 BR 合成突变体表 现出明显的光生长形态的异常， 并且这些表型可以为外源 BR 恢复。 0007 通过 BZR1 染色体免疫沉淀结合芯片分析的实验， 更多功能基因和信号。

10、途径被证 明参与了 BR 信号途径， GATA 转录因子家族就是其中之一。GATA 是一类重要的转录因子， 文 说 明 书 CN 102766201 A 3 2/8 页 4 献表明它与光调控、 生物钟以及氮转运相关。GATA 家族成员的转录水平受到不同激素 （BR 等） 其它环境因子 （光等） 的调控， 同时显示出多种生理功能， 暗示着 GATA 家族广泛参与了 植物发育和形态建成过程。 0008 GATA 转录因子家族在真核生物 （真菌、 动物和植物） 中非常保守， 它具有特征性的 WGATAR（W=T 或 A， R=G 或 A） 序列和碱性区， 植物中的大部分 GATA 具有因子 CX2C。

11、X18CX2C 样的 DNA 结合域， 同时也发现某些 GATA 具有超过 18 个的锌指环或者拥有两个锌指结构域。 拟南芥基因组中存在29个可能的GATA因子编码序列， 全部编码具有一个锌指结构的蛋白， 可以根据进化关系和结构分析分成四个亚家族。已报道的 GATA 类因子可以调控拟南芥苗 的生长点和花的发育、 参与光反应以及影响氮代谢。 发明内容 0009 本发明的一个目的是提供一种来源于拟南芥的 GATA2 蛋白的新用途。 0010 本发明所提供的新用途为来源于拟南芥的 GATA2 蛋白在调节单子叶植物生长发 育中的应用。 0011 在本发明的实施例中， 所述单子叶植物具体为水稻。所述生长。

12、发育体现在成株株 高和 / 或杨花时间和 / 或分蘖数量上。 0012 本发明的另一个目的是提供一种培育株高变高和/或杨花提前和/或分蘖增加的 转基因水稻的方法。 0013 该方法包括如下步骤 ： 将由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编 码基因导入目的水稻中， 得到转基因水稻 ； 所述转基因水稻与所述目的水稻相比株高变高 和 / 或杨花提前和 / 或分蘖增加。 0014 所述蛋白质的编码基因 （命名为 AtGATA2） 为如下 1） 或 2） 的 DNA 分子 ： 0015 1） 其编码序列如序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ； 0016 2） 序列表中序列 3 所示的 。

13、DNA 分子。 0017 其中， 序列表中序列 1 由 795 个核苷酸组成， 为 AtGATA2 基因的编码序列， 编码得 到序列 2 所示氨基酸组成的蛋白质， 序列 2 由 264 个氨基酸组成。序列 3 由 1152 个核苷酸 组成， 第 253-1140 位为 AtGATA2 基因的编码区序列， 其中的第 469-561 位为内含子序列， 序 列 3 编码也得到序列 2 所示的氨基酸组成的蛋白质。 0018 上述方法中， 所述蛋白质的编码基因可通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表 达载体导入所述目的水稻中。 0019 所述重组表达载体可为本领域已知的多种载体， 如市售的载体， 包括质粒。

14、， 粘粒 等。所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子可为 35S 启动子， 其核苷酸序列 如序列表中序列 4 所示。在本发明的一个实施例中， 所述重组表达载体具体为将所述蛋白 质的编码基因插入质粒 pSN1301 的多克隆位点得到的重组表达载体。 0020 所述转基因水稻为表达所述编码基因的转基因水稻。 0021 在本发明的实施例中， 所述水稻具体为水稻品种日本晴。 0022 实验证明， 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质能够调节单子叶植 物的成株株高和 / 或杨花时间和 / 或分蘖数量。AtGATA2 过表达的转基因水稻植株与对照 未转基因植株相比， 生长健旺、 植株高。

15、大、 分蘖增多、 杨花提前。 说 明 书 CN 102766201 A 4 3/8 页 5 附图说明 0023 图 1 为 GATA2-ox 载体转化农杆菌 EHA105 的 PCR 鉴定结果。其中， 泳道 1 表示的 是 DNA 条带的大小标记 , 两条带从上到下分别代表 750bp,500bp ； 泳道 2-13 分别为 12 个 GATA2-ox 载体转化后的重组农杆菌的 PCR 鉴定结果， 泳道 4 和 13 表示 GATA2-ox 载体未能 成功转化的农杆菌， 其余泳道均为阳性克隆。 0024 图 2 为转 AtGATA2 基因的水稻日本晴 T0代株系的表型。其中， A 为水稻植株整。

16、体 ； B 为水稻植株的稻穗。A 和 B 中， 1 均为 T0代株系 1， 2 均为未转基因的水稻日本晴对照。 0025 图 3 为转 AtGATA2 基因的水稻日本晴 T0代株系 AtGATA2 基因表达量的 RT-PCR 检 测结果。 0026 图 4 为转 AtGATA2 基因的水稻日本晴 T1代株系的表型。其中， A 为水稻植株整体 ； B 为水稻植株的稻穗 ； C 为水稻植株的花。A、 B 和 C 中， 1 均为 T1代株系 1， 2 均为未转基因 的水稻日本晴对照。 0027 图 5 为转 AtGATA2 基因的水稻日本晴 T1代株系 AtGATA2 基因表达量的 RT-PCR 检。

17、 测结果。 具体实施方式 0028 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0029 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0030 下述实施例中所用的培养基 ： 0031 (1)MS 母液 ： 0032 母液1 ： 20大量元素(500ml) ： 取38g的KNO3； 33g的NH4NO3， 7.4g的MgSO4 7H2O， 用水定容至 500ml。 0033 母液 2 ： 20 钙盐 (1L) ： 取 8.8g 的 CaCl22H2O， 用水定容至 500ml。 0034 母液 3 ： 20 钾盐 (1L) ： 取 3.4g 的 KH。

18、2PO4， 用水定容至 1L。 0035 母液 4 ： 100 微量元素 (1L) ： 取 2230mg 的 MnSO44H2O ； 860mg 的 ZnSO47H2O ； 620mg 的 H3BO3； 83mg 的 KI ； 25mg 的 Na2MoO42H2O ； 2.5mg 的 CuSO45H2O ； 2.5mg 的 CoCl26H2O， 用水定容至 1L。 0036 母液5 ： 100维生素(500ml) ： 取200mg甘氨酸 ； 40mg盐酸硫胺素 ； 50mg盐酸吡哆 素 ； 50mg 烟酸 ； 10000mg 肌醇， 用水定容至 500ml。 0037 母液 6 ： 200 铁。

19、盐 (500ml) ： 取 3730mg 的 Na2-EDTA ； 2780mg 的 FeSO47H2O， 用水 定容至 500ml。 0038 配制 1L MS 培养基时分别加入母液 1、 2、 3 各 50ml， 母液 410ml， 母液 5、 6 各 5ml， pH5.8。 0039 (2)AAM-AS 液体培养基 0040 10AA 大 量 元 素 ： KH2PO4终 浓 度 为 1.7g/L ； MgSO47H2O 终 浓 度 为 3.7g/L ； CaCl22H2O 终浓度为 4.4g/L。 0041 100AA 微量元素 I ： MnSO4H2O 终浓度为 1.69g/L ； Z。

20、nSO47H2O 终浓度为 0.86g/ L ； H3BO3终浓度为 0.62g/L ； KI 终浓度为 0.083g/L。 说 明 书 CN 102766201 A 5 4/8 页 6 0042 1000AA 微量元素 II ： CuSO45H2O 终浓度为 0.025g/L ； NaMoO42H2O 终浓度为 0.25g/L ； CoCl26H2O 终浓度为 0.025g/L。 0043 10AA 氨基酸 ： 谷氨酰胺终浓度为 8.77g/L ； 天冬氨酸终浓度为 2.66g/L ； 精氨酸 终浓度为 2.88g/L ； 甘氨酸终浓度为 0.75g/L。 0044 200 铁盐 (500m。

21、l) ： 取 3730mg 的 Na2-EDTA ； 2780mg 的 FeSO47H2O， 用水定容至 500ml。 0045 100MS 维生素 ： 烟酸终浓度为 0.05g/L ； 盐酸硫胺素终浓度为 0.1/L ； 盐酸吡哆 醇终浓度为 0.05g/L。 0046 配制 1L AAM-AS 液体培养基加入 10AA 大量元素 100ml， 100AA 微量元素 I10ml， 1000AA 微量元素 II 1ml， 10AA 氨基酸 100ml， 200 铁盐 5ml， 100MS 维生 素 10ml ； 另外再加入终浓度为 2.94/L 的 KCL ； 终浓度为 500mg/L 的水解。

22、酪蛋白 ； 终浓度为 68.5g/L 的蔗糖 ； 终浓度为 36g/L 的葡萄糖 ； 终浓度为 0.1g/L 的肌醇 ； 调节 pH 值至 5.2， 高 压灭菌。用时加入 AS（乙酰丁香酮） 200/L。 0047 (3) 预分化培养基 0048 配制 1L 预分化培养基加入适量的 MS 母液 （母液 1、 2、 3 各 50ml， 母液 410ml， 母液 5、 6 各 5ml） ； 外加终浓度为 800mg/L 的干酪素 ； 终浓度为 2mg/L 的 6-BA ； 终浓度为 0.5mg/L 的激动素 （KT） ； 终浓度为 1mg/L 的 NAA ； 终浓度为 30g/L 的蔗糖 ； 调节。

23、 pH 值至 5.8， 高压灭 菌。使用前加 ABA5mg/L。 0049 (4) 分化培养基 0050 配制 1L 分化培养基加入适量的 MS 母液 （母液 1、 2、 3 各 50ml， 母液 410ml， 母液 5、 6 各 5ml） ； 外加终浓度为 500mg/L 的干酪素 ； 终浓度为 2mg/L 的 6-BA ； 终浓度为 0.5mg/L 的 激动素 （KT） ； 终浓度为 0.5mg/L 的 NAA ； 终浓度为 30g/L 的蔗糖 ； 终浓度为 15g/L 的山梨醇 ； 调节 pH 值至 5.8， 高压灭菌。 0051 (5)NBD2(2,4D 浓度 2mg/L) 培养基 0。

24、052 N6 大量母液 1 ： 20 大量元素 (1L) ： 取 56.6g 的 KNO3； 9.26g 的 (NH4)2SO4； 8g 的 KH2PO4， 用水定容至 1L。 0053 N6 大量母液 2 ： 40 大量元素 (500ml) ： 取 3.32g 的 CaCl22H2O， 用水定容至 500ml。 0054 N6大量母液3 ： 40大量元素(500ml) ： 取3.7g的MgSO4 7H2O， 用水定容至500ml。 0055 B5 微量元素 I ： 100 微量元素 （1L） ： 0056 溶液 A ： 取 781mg 的 MnSO4H2O ； 200mg 的 ZnSO47H。

25、2O， 溶于 400ml 无菌水。 0057 溶液 B ： 取 300mg 的 H3BO3； 75mg 的 KI， 溶于 400ml 无菌水。 0058 然后缓慢将溶液 A 和溶液 B 混合， 再用水定容至 1L。 0059 B5 微量元素 II ： 1000 微量元素 （500ml） ： 取 125mg 的 Na2MoO42H2O ； 12.5mg 的 CuSO45H2O ； 12.5mg 的 CoCl26H2O， 用水定容至 500ml。 0060 B5 维生素 I ： 100 维生素 （500ml） ： 取 500mg 的盐酸硫胺素 ； 50mg 的盐酸吡哆醇 ； 50mg 的烟酸， 用。

26、水定容至 500ml。 0061 B5 维生素 II ： 100 维生素 （500ml） ： 取 100mg 的甘氨酸， 用水定容至 500ml。 0062 2,4D ： 1002,4D（1L） ： 取 200mg 的 2,4D， 先溶于 1ml 无水乙醇中， 再定容到 1L。 说 明 书 CN 102766201 A 6 5/8 页 7 0063 200 铁盐 (500ml) ： 取 3730mg 的 Na2-EDTA ； 2780mg 的 FeSO47H2O， 用水定容至 500ml。 0064 配制 1L NBD2(2,4D 浓度 2mg/L) 培养基时分别加入 N6 大量母液 150m。

27、l， N6 大量母 液 2、 3 各 25ml， B5 微量元素 I 10ml， B5 微量元素 II 1ml， B5 维生素 I、 II 各 10ml、 200 铁盐5ml， 1002,4D(1L)10ml， 另加入30g的蔗糖 ； 0.1g的肌醇 ； 0.5g的L-脯氨酸 ； 0.5g的 L- 谷氨酰胺 ； 0.5g 的水解酪蛋白， 调节 pH 值至 5.8， 高压灭菌。( 固体培养基加 0.7% 的琼 脂粉 ) 0065 (6)NBD2-AS 培养基 0066 配制 1L NBD2-AS 培养基时按照 NB-2,4D 培养基配方加入适量的 9 个母液 （N6 大 量母液 150ml， N。

28、6 大量母液 2、 3 各 25ml， B5 微量元素 I 10ml， B5 微量元素 II 1ml， B5 维生 素 I、 II 各 10ml、 200 铁盐 5ml， 2,4D 10ml） ； 另外再加入 1g 的水解酪蛋白 ； 0.1g 的肌醇 ； 30g 的蔗糖 ； 10g 的葡萄糖 ； 调节 pH 值至 5.2， 高压灭菌 ( 固体培养基加 0.2% 的琼脂粉 )。 倒平板时加入 AS（乙酰丁香酮） 100/L。 0067 (7) 生根壮苗培养基 0068 配制1L生根壮苗培养基加入适量的MS母液 （母液1、 2、 3各50ml， 母液410ml， 母液 5、 6 各 5ml） ； 。

29、外加终浓度为 250mg/L 的干酪素 ； 终浓度为 0.5mg/L 的 NAA ； 终浓度为 0.5mg/ L 的 IBA ； 终浓度为 50mg/L 的潮霉素 ； 终浓度为 200mg/L 的头孢 ； 终浓度为 2g/L 的琼脂粉 ； 终浓度为 30g/L 的蔗糖， 调节 pH 值至 5.8， 高压灭菌。抗生素临用前再加。 0069 实施例 1、 AtGATA2 转化日本晴得到转基因水稻 0070 一、 重组表达载体的构建 0071 1、 拟南芥基因组 DNA 的提取 0072 取 新 鲜 的 拟 南 芥 （A.thaliana） Col-0（Columbia-0） （Xi-Ying Fa。

30、n,Yu Sun,Dong-Mei Cao,et al.BZS1,a B-box Protein,Promotes Photomorphogenesis Downstream of Both Brassinosteroid and Light Signaling Pathways.Molecular Plant,2012(3):591-600） 野生型的叶片， 剪碎， 用液氮研磨成粉状， 用CTAB法提取Col-0的 基因组 DNA。 0073 2、 PCR 扩增得到 AtGATA2 基因 0074 利 用 如 下 引 物 对 ： 5 -CTCTTCTTCTTATAGATAAAAG-3 （序 。

31、列 3 的 前 22 位）和 5 -GAAAAGTGAAAACTAAAACGG-3 （序列 3 的后 21 位的反向互补序列） ， 以上述步骤 1 获得的 拟南芥基因组 DNA 为模板， PCR 扩增得到大小为 1152bp 的扩增产物， 对其进行测序， 测序结 果如序列表中序列 3 所示。其中序列 3 的第 253-1140 位为 AtGATA2 基因的编码区序列， 而 第 469-561 位为内含子序列， 序列 3 编码得到序列 2 所示的氨基酸组成的蛋白质。 0075 3、 GATA2-ox 过量表达载体的构建 0076 以步骤 2 获得的 AtGATA2 基因 （序列 3） 为模板， 。

32、利用如下引物对通过 PCR 扩增获 得 5 端带有 BamH I 酶切位点， 3 端带有 Kpn I 酶切位点的 AtGATA2 基因片段。 0077 上游引物 ： 5 -CGGGATCCCTCTTCTTCTTATAGATAAAAG-3 （下划线处为 BamHI 酶切位 点序列， 其后的序列为序列 3 的前 22 位） 0078 下游引物 ： 5 -GGGGTACCGAAAAGTGAAAACTAAAACGG-3 （下划线处为 Kpn I 酶切位点 序列， 其后的序列为序列 3 的后 21 位的反向互补序列） 说 明 书 CN 102766201 A 7 6/8 页 8 0079 然后利用限制性。

33、内切酶 BamH I 和 Kpn I 双酶切上述 PCR 产物， 连接到经相同 酶切的双元载体 pSN1301（Xi-Ying Fan,Yu Sun,Dong-Mei Cao,et al.BZS1,a B-box Protein,Promotes Photomorphogenesis Downstream of Both Brassinosteroid and Light Signaling Pathways.Molecular Plant,2012(3):591-600） 上， 得到过量表达 GATA2 的过表达载体 GATA2-ox， 这个载体可用于培育 AtGATA2 基因过表达转基因植。

34、株。 0080 二、 AtGATA2 转化日本晴得到转基因水稻 0081 1、 幼胚愈伤组织的诱导 0082 水稻品种日本晴 （Oryza sativa） （Sheng-Wei Zhang,Chen-Hui Li,Jia Cao,et al.Altered Architecture and Enhanced Drought Tolerance in Rice via the Down-Regulation of Indole-3-Acetic Acid by TLD1/OsGH3.13 Activation.Plant Physiology， 2009(151):1889-1901） 种子去壳。

35、后， 浸泡在 70% 的乙醇中 1 分钟， 再加入 2% 的 次氯酸钠溶液振荡消毒 60 分钟以上， 用无菌水冲洗 2-3 遍， 然后用无菌滤纸吸干水分。在 无菌条件下用手术刀和镊子解剖幼胚， 将幼胚直接转入 NBD2（2,4-D 浓度为 2mg/L） 培养基 平板中， 于 28暗培养， 每 2 周继代一次。 0083 2、 重组表达载体转化根癌农杆菌 0084 取 50L 感受态农杆菌 EHA105（Lei Wang,Yun-yuan,Jia Li,et al.Transgenic rice palnts ectopically expressing AtBAK1 are semi-dwar。

36、fed and hypersensitive to24-epibrassinolide.JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY,2007(164):655-664） ， 加入 0.1g 质粒 （步骤一构建的 GATA2-ox） ， 轻轻混匀， 冰上放置 ； 2500V， 50ms 电击转化质粒， 然 后加入 1mL 的 YEB 液体培养基， 28 C 振荡培养 1h 复苏 ； 取适量菌液涂布于 20ml 含卡那 霉素的 YEB 固体培养基上， 28 C 黑暗下培养 2-3 天。同时设置转入双元载体 pSN1301 的 空载体对照。待固体培养基上长出单菌落后， 挑取单菌落作为 P。

37、CR 的模板， 利用一条来自于 pSN1301 载体序列的引物 5 -CTGACGTAAGGGATGACGC-3 和一条来自 AtGATA2 基因组序列的 引物 5 -TCCTCCTAATGGATTCGCCG-3 （序列 3 的第 626-645 位） 进行 PCR 鉴定。 0085 鉴定结果如图 1 所示， 将经鉴定表明转入 GATA2-ox 载体 （PCR 产物大小约为 730bp）的农杆菌名为 GATA2-ox/EHA105。同时将转入空载体 pSN1301 的农杆菌命名为 pSN1301/EHA105。 0086 3、 农杆菌转化愈伤组织 0087 农杆菌菌液 5000rpm 离心 1。

38、0 分钟， 在 AAM-AS（AS 浓度 200M/L） 液体培养基中重 悬沉淀至浓度 OD600 为 0.6-0.8， 得到菌悬液。 0088 挑选新鲜的步骤 1 所得的胚性愈伤组织浸泡在上述所得菌悬液中 20 分钟， 用无 菌滤纸吸干后转移至 NBD-AS(AS 浓度为 100M/L) 培养基上 （在培养基表面铺一张无菌滤 纸） ， 25暗培养3天 ； 将共培养后的愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍， 无菌滤纸吸干后转至 NBD2(2,4D 浓度 2mg/L) 培养基上， 筛选一代 ； 两周后， 转移至 NBD2 培 养基上筛选二代 （2 周 / 代） ； 取出经过 3。

39、 代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织， 转移至预分化培 养基上， 在分化培养箱 （12 小时光周期， 白天 28， 夜晚 25） 中培养 7 天 ； 然后转移至分 化培养基上， 在分化培养箱中培养至产生再生苗 ； 再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮 苗 ； 待小苗长至 10 厘米左右时， 打开容器封口膜， 炼苗 2-3 天， 然后将小苗移入人工气候室 栽培。 说 明 书 CN 102766201 A 8 7/8 页 9 0089 而后摘取叶片， 常规方法提取微量总 DNA， 用如下引物对进行 PCR 扩增， 一条来 自 pSN1301 载体序列的引物 ： 5 -CTGACGTAAGGGATGACGC。

40、-3 ， 一条来自 AtGATA2 基因组序 列的引物 ： 5 -TCCTCCTAATGGATTCGCCG-3 （序列 3 的第 626-645 位） 。扩增得到大小约 为 730bp 的目的条带的样品所对应的水稻植株为转入 AtGATA2 基因的阳性植株。对经上 述方法鉴定为阳性植株的水稻， 摘取叶片， 常规方法提取微量总 RNA， 反转录得到 cDNA， 用如下引物对进行 PCR 扩增 ： 5 -TTCCTCCACGACATTTGC-3 （序列 1 的第 193-210 位）和 5 -AGTGAAGCTGCTGATGCTC-3（序列 1 的第 412-430 位的反向互补序列） ， 再次检。

41、测 AtGATA2 基因是否在阳性苗中表达。扩增得到大小约为 238bp 的目的条带的样品所对应的水稻植株 为转入 AtGATA2 基因的阳性植株。 0090 经鉴定， 最终得到了转入 AtGATA2 过表达载体 GATA2-ox， 并过表达 AtGATA2 的 T0 代日本晴株系 1， 命名为 AtGATA2/ 日本晴株系 1， 简称株系 1。 0091 实施例 2、 AtGATA2 转基因水稻植株的表型观察及对 AtGATA2 表达量的检测 0092 1、 T0代植株的表型分析及 AtGATA2 表达量的检测 0093 将实施例 1 鉴定为转 AtGATA2 基因阳性的 T0代的株系 1 。

42、植株在大田中 (16 小时 左右光照 ,8 小时左右黑暗 , 温度 30 摄氏度左右 ) 进行培养， 大约 90 天后， 对表型观察和 分析。表型涉及植株高度、 杨花时间、 分蘖数量等表型。同时设置未转基因的水稻品种日本 晴的对照。 0094 经过仔细观察发现， T0代株系 1 与野生型的日本晴植株相比， 具有株高增加、 分蘖 增加、 生长健旺、 杨花提前的表型， 如图 2 所示。 0095 采用 RT-PCR 的方法对 T0代株系 1 中 AtGATA2 的表达量进行检测。具体操 作如下 ： 摘取 T0代株系 1 的叶片， 常规方法各自提取微量总 RNA， 反转录得到 cDNA， 用 5 -。

43、TTCCTCCACGACATTTGC-3 （序列 1 的第 193-210 位） 和 5 -AGTGAAGCTGCTGATGCTC-3 （序 列 1 的第 412-430 位的反向互补序列） 这一引物对进行 PCR 扩增， 具体按照 Promega 反转录 试剂盒 （产品目录号是 M1701） 说明书进行操作。同时设置未转基因的水稻品种日本晴的对 照。实验重复三次， 结果取平均值。 0096 结果如图 3 和表 1 所示， T0代 AtGATA2 转基因株系中的 AtGATA2 的表达量高于未 转基因的水稻品种日本晴对照 ； 株系1中AtGATA2基因的表达量最高， 是对照日本晴品种的 31.。

44、64 倍。这与表型结果相一致， 具有剂量效应。 0097 表 1 三次重复实验 T0代株系 1 中 AtGATA2 的相对表达量的结果 0098 株系 1 重复 1 31.22 重复 2 31.65 重复 3 32.05 平均值 31.64 0099 注 ： 将作为对照的未转基因的水稻品种日本晴中 AtGATA2 的表达量设为 1。 说 明 书 CN 102766201 A 9 8/8 页 10 0100 2、 T1代植株的表型分析及 AtGATA2 表达量的检测 0101 将实施例 1 鉴定为转 AtGATA2 基因阳性的 T0代株系 1 收种， 晒干， 妥善保存。取 20 个种子加水萌发，。

45、 长出第三片真叶以后剪取叶片， 按照上述步骤 1 所述方法对 T1代植株 进行 AtGATA2 基因的分子鉴定。结果表明 T1代株系 1 得到四分之三比例 （15 株） 的阳性苗， 这证明这一个株系是单插入的转基因株系。 0102 对鉴定阳性的 T1代株系 1， 15 株在大田中 （16 小时左右光照 ,8 小时左右黑暗 , 温 度 30 摄氏度左右） 进行培养， 大约 90 天后， 对表型观察和分析。表型涉及植株高度、 杨花时 间、 分蘖数量等表型。同时设置未转基因的水稻品种日本晴的对照。 0103 经过详细观察分析发现， T1代株系1的植株表型明显， 生长比野生型日本晴对照要 健壮 （高度。

46、平均增加 47%） ， 分蘖增多， 杨花提前 （平均提前 10 天） 。以上结果见图 4。 0104 采用 RT-PCR 的方法对 T1代株系 1 中 AtGATA2 的表达量进行检测。具体操 作如下 ： 摘取 T1 代株系 1 的叶片， 常规方法各自提取微量总 RNA， 反转录得到 cDNA， 用 5 -TTCCTCCACGACATTTGC-3 （序列 1 的第 193-210 位） 和 5 -AGTGAAGCTGCTGATGCTC-3 （序 列 1 的第 412-430 位的反向互补序列） 这一引物对进行 PCR 扩增， 具体按照 Promega 反转录 试剂盒说明书进行操作。同时设置未转。

47、基因的水稻品种日本晴的对照。实验重复三次， 结 果取平均值。 0105 结果如图 5 和表 2 所示， T1代株系 1 中 AtGATA2 基因的表达量是对照日本晴品种 的 5.63 倍。这与表型结果相一致， 具有剂量效应。 0106 表 2 三次重复实验 T1代株系 1 中 AtGATA2 的相对表达量的结果 0107 株系 1 重复 1 5.33 重复 2 5.82 重复 3 5.74 平均值 5.63 0108 0109 注 ： 将作为对照的未转基因的水稻品种日本晴中 AtGATA2 的表达量设为 1。 0110 以上结果表明 AtGATA2 基因在水稻不同代次中均能够稳定表达。从而得出。

48、结论， 水稻 （日本晴品种） 中过表达 AtGATA2 基因可以导致水稻生长健旺， 植株高大， 杨花提前， 分 蘖增多， 且这些表型因 AtGATA2 基因在水稻不同代次间的稳定表达而稳定。 说 明 书 CN 102766201 A 10 1/6 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102766201 A 11 2/6 页 12 0003 序 列 表 CN 102766201 A 12 3/6 页 13 0004 序 列 表 CN 102766201 A 13 4/6 页 14 0005 序 列 表 CN 102766201 A 14 5/6 页 15 0006 序 列 表 CN 102766201 A 15 6/6 页 16 序 列 表 CN 102766201 A 16 1/2 页 17 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102766201 A 17 2/2 页 18 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102766201 A 18 。