一种精子核酸完整性的检测试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610064877.6 (22)申请日 2016.02.01 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 上海中优生物高科技有限责任公司 地址 200433 上海市杨浦区四平路 1779 号 三楼 302 室 (72)发明人 何骏奇 张奕 王校 毛丹丹 邹创 潘峰 乐涵骏 (54) 发明名称 一种精子核酸完整性的检测试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种精子核酸完整性， 其特征 在于， 通过磁性微珠螯合序列捕获目标核酸， 并通 过检测分析雄性个人的 XRCC1 基因和 XPD 基因的。

2、 位点基因携带型为给出精子核酸完整性的评估。 可应用于检测精子的核酸完整性， 而核酸完整性 是雄性不育的主要的原因之一。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表4页 附图2页 CN 105543384 A 2016.05.04 CN 105543384 A 1.一种精子核酸完整性的检测试剂盒， 其特征在于包括以下部分：（1） 核酸抽提部分， （2） 核酸扩增部分。 2.根据权利1所述的一种精子核酸完整性的检测试剂盒， 其特征在于， 所述的核酸抽提 部分使用螯合目标序列的磁性微珠来对目标核酸进行抽提。 3.根据权利1。

3、所述的一种精子核酸完整性的检测试剂盒， 其特征在于， 所述的核酸扩增 部分的特征在要求包括反应体系、 反应过程。 4.根据权利3所述的一种精子核酸完整性的检测试剂盒， 其特征在于， 所述的的反应体 系包括： 1） 反应缓冲液 （10Buffer） ； 2） 引物组； 3） DNA低温聚合酶； 4） 质控品； 5） 基因组DNA。 5.根据权利3所述的一种精子核酸完整性的检测试剂盒， 其特征在于反应体系中使用 的DNA低温聚合酶为具有5 端至3 端DNA聚合酶活性， 但不具有5 端至3 端外切核酸酶活 性的DNA聚合酶； 根据权利3所述的一种精子核酸完整性的检测试剂盒， 其特征在于， 所述的的反。

4、应过程 的温度在30至50。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543384 A 2 一种精子核酸完整性的检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物测定技术领域， 尤其是涉及一种体外检测精浆中含有核酸完整性 的试剂盒。 背景技术 0002 经国内外的学者研究发现， 雄性不育患者的精子核酸完整性会明显缺失， 精子核 酸的完整性是判断精子质量的有效依据。 精子核酸完整性不仅会严重影响到精子的受精能 力、 受精后原核的形成， 而且可能导致流产、 后代先天畸形或者患有某些遗传性疾病。 精子 核酸的完整性对宫腔内人工授精助孕的实施来说， 是极大影响助孕成功的不利因素之一。 因此， 检测精子核酸。

5、的完整性对不育患者精子质量的评估具有极大的价值。 0003 研究发展XRCC1和XPD基因与精子的形成以及完整性有些密切的关系。 0004 XRCC1是碱基切除修复系统的重要组成部分， 而XPD是核苷酸切除修复系统的重要 组成部分， 他们在维持基因组稳定性过程中起着关键的作用。 XRCC1基因多态Arg194Trp、 Arg399Gln和XPD基因多态Lys751Gln是原发性无精现象的遗传易感因素。 0005 相比于传统的血清学检测方案， 基于核酸检测的PCR技术可以在更早的阶段对病 原体做出精确的诊断。 但是， PCR检测技术需要昂贵的设备和试剂， 荧光定量PCR更是需要昂 贵的探针和复杂。

6、的操作步骤， 对人员的操作水平也有较高的要求。 鉴于以上的问题， 一种可 操作性更强的检测方法的发明是一种趋势的。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种快速、 准确、 简便、 实用的检测试剂盒， 该试剂盒可对 精浆中含有核酸完整性进行综合评价。 0007 本发明的技术方案为： 盒体包括两个部分， 核酸抽提、 核酸检测。 0008 核酸抽提部分包括： 抽提使用磁性乳酸微珠、 裂解液、 有机相清洗液、 无机相清洗 液、 洗脱保存液； 核酸检测部分包括： 质控品、 反应混合物、 引物组。 0009 本发明的测试原理： 1） 针对XRCC1和XPD两个基因的序列设计用于富集目标基因序列的结合磁。

7、性乳酸微珠 上的捕捉序列 所述抽提富集结合序列为： SEQNO.1： 5 -CGACCTGTCACCGCCCTCGGTCCCGGG-3 SEQNO.2： 5 -CGCTGCGGGTGTAAACATAGGAGGTGG-3 SEQNO.3： 5 -CGCTGCGGGTGTAAACACGGGCGAGAG-3 2） 针对XRCC1和XPD的三个位点设计引物序列 针对XRCC1的Arg194Trp和Arg399Gln的位点， 以及XPD的Lys751Gln的位点设计扩增引 说明书 1/5 页 3 CN 105543384 A 3 物， 用于对这三个位点进行信号放大和检测。 0010 所述XRCC1Arg。

8、194Trp的引物序列为： SEQNO.4F： 5 -GCCAGGGCCCTCCTCTCAAA-3 SEQNO.5R： 5 -TACCTCCAGACCCACGAGT-3 所述XRCC1Arg399Gln的引物序列为： SEQNO.6F： 5 -TCCTCCACCTTGTGCTTTCT-3 SEQNO.7R： 5 -AGTAGTCTGCTGGCTCTGGG-3 所述XPDLys751Gln的序列引物序列为： SEQNO.8F： 5 -GCCCGCTCTGGATTATACG-3 SEQNO.9R： 5 -CTATCATCTCCTGGCCCTAT-3 3） XRCC1和XPD质控品的设计: 为了对整。

9、个扩增过程实施质量， 在扩增反应中加入质控品用于对扩增系统进行质控， 也便于出现错误时， 追溯错误的原因。 以引物的对应序列作为序列的5 端和3 端， 中间选用 与检测精子核酸没有同源性的天然序列。 0011 SEQNO.10： 5 -CGGTCCCGGGAGGAGAGTTTTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCTTTTGATTTGTTAAAACACC TTGCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAAGAAATCAAAAGTCTGTGGCAACCGCTTAATGACACTCGTTTGCTGG CTGAATCTCCGGCAGCATTCATACGAATCTCCGG。

10、CAGCATTCACACCCAGCAACATATGGAGGTCTGGGTGCTCA- 3 SEQNO.11： 5 -TCCTCCACCTTGTGCTTTCTTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCTTTTGATTTGTTAAAACACCT TGCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAAGAAATCAAAAGTCTGTGGCAAGCCGCTTAATGACACTCGTTTGCTGG CTTCATTCATCAGACGACCGAGACCC-3 SEQNO.12： 5 -CGGGCGAGACCTAATATGCTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCTTT。

11、TGATTTGTTAAAACACCTT GCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAAGATGATAGTAGAGGACCGGGATA-3 4） 抽提的原理： 通过磁性乳酸微珠上结合的序列对基因组中的目标核酸片段进行捕捉， 并通过对捕捉 的目标核酸片段用有机相清洗液和无机相清洗液去除附着的有机相和无机相， 并通过洗脱 保存液洗脱并保存。 0012 所述抽提步骤如下： 4.1样本的处理： 将适合量的样本放入离心管中， 并加入裂解液， 震荡混匀后备用； 4.2磁性乳酸微珠的处理： 充分摇匀磁性微珠， 用移液器取合适的量置于离心管中， 磁 性分离1min， 弃上清； 吸取适量的磁性微珠加入。

12、裂解混合液中， 吹吸混匀； 4.3将离心管置于磁性管架上， 静置2min， 弃上清； 4.4将离心管磁性管架上取下， 将适量的有机相清洗液加入离心管中， 吹吸混匀， 将离 心管放置回磁性管架上， 静置2min， 弃上清； 4.5将离心管磁性管架上取下， 将适量的无机相清洗液加入离心管中， 吹吸混匀， 将离 心管放置回磁性管架上， 静置2min， 弃上清； 说明书 2/5 页 4 CN 105543384 A 4 4.6将离心管磁性管架上取下， 将适量的洗脱保存液加入离心管中， 吹吸混匀， 将离心 管置于60水浴5min； 4.7将离心管放置回磁性管架上， 静置至上清澄清， 上清即为纯化的基因组。

13、DNA， 将上清 转移至另一离心管中， 可直接于-20低温保存。 0013 4） 扩增反应的原理 所述反应液包括： 10扩增反应缓冲液、 引物组、 BstDNA聚合酶。 0014 所述反应体系如下： 10扩增反应缓冲液2.5 ul 引物组 （0.2 mM）9.0 ul DNA 低温聚合酶 （8 U/ml）1.0 ul 无菌水8.5 ul 质控品核酸 （100 ng/ul） ）2.0 ul 模板核酸 （100 ng/ul） ）2.0 ul 总体积25.0 ul 所述按以下程序进行扩增： 6090min。 0015 5） 扩增反应的分析 通过凝胶电泳或毛细电泳将不同大小的特定基因型的扩增产物片段进。

14、行分离， 分离后 使用紫外检测扩增产物片段的大小， 以此来确定目的基因的基因型。 0016 本发明的有益效果是： 此技术在同一个反应体系中同时扩增多条不同的产物， 定性鉴定样本精子的核酸完整 性。 而且扩增片段长度适中， 扩增条件温度要求低， 使用仪器简单。 0017 附图说明 0018 图1为本发明所述试剂盒核酸抽提部分； 其中1-磁性乳酸微珠、 2-裂解液、 3-有机相清洗液、 4-无机相清洗液、 5-洗脱液、 6-保存 液； 图2为本发明所述试剂盒核酸检测部分； 其中1-反应液、 2-质控品、 3-XRCC1的Arg194Trp引物、 4-XRCC1的Arg399Gln引物、 5-XPD。

15、 的Lys751Gln引物； 图3为本发明不同结果的电泳示意图。 0019 具体实施方式 0020 以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明， 但不作为对本发明的限定。 0021 本发明试剂盒分为两个部分： 核酸抽提部分和核酸检测部分； 如图1所示， 核酸抽提部分： 磁性乳酸微珠 （1） 、 裂解液 （2） 、 有机相清洗液 （3） 、 无机相清 洗液 （4） 、 洗脱液 （5） 、 保存液 （6） ； 说明书 3/5 页 5 CN 105543384 A 5 如图2所示， 核酸检测部分： 反应液 （1） 、 质控品 （2） 、 XRCC1的Arg194Trp引物 （3） 、 XRCC1 的A。

16、rg399Gln引物 （4） 、 XPD的Lys751Gln引物 （5） 。 0022 具体处理步骤如下 1、 样本3份， 都已经使用 “核酸提取-扩增-分析” 的技术方法对XRCC1和XPD的三个位点 检测， 四个待检样本分别为： 1号样本： XRCC1的Arg194Trp的位点结果为Arg型、 XRCC1的Arg399Gln的位点结果为Gln 型、 XPD的Lys751Gln的位点结果为Lys型； 2号样本： XRCC1的Arg194Trp的位点结果为Trp型、 XRCC1的Arg399Gln的位点结果为Arg 型、 XPD的Lys751Gln的位点结果为Lys型； 3号样本： 没有任何D。

17、NA残留的阴性样本 2、 抽提步骤： 2.1样本的处理： 将适合量的样本放入离心管中， 并加入裂解液， 震荡混匀后备用； 2.2磁性乳酸微珠的处理： 充分摇匀磁性微珠， 用移液器取合适的量置于离心管中， 磁 性分离1min， 弃上清； 吸取适量的磁性微珠加入裂解混合液中， 吹吸混匀； 2.3将离心管置于磁性管架上， 静置2min， 弃上清； 2.4将离心管磁性管架上取下， 将适量的有机相清洗液加入离心管中， 吹吸混匀， 将离 心管放置回磁性管架上， 静置2min， 弃上清； 2.5将离心管磁性管架上取下， 将适量的无机相清洗液加入离心管中， 吹吸混匀， 将离 心管放置回磁性管架上， 静置2mi。

18、n， 弃上清； 2.6将离心管磁性管架上取下， 将适量的洗脱保存液加入离心管中， 吹吸混匀， 将离心 管置于60水浴5min； 2.7将离心管放置回磁性管架上， 静置至上清澄清， 上清即为纯化的基因组DNA， 将上清 转移至另一离心管中， 可直接于-20低温保存。 0023 3、 扩增反应 所述反应体系如下： 10扩增反应缓冲液2.5 ul 引物组 （0.2 mM）9.0 ul Bst DNA 聚合酶 （8 U/ml）1.0 ul 无菌水8.5 ul 质控品核酸 （100 ng/ul） ）2.0 ul 样品核酸 （100 ng/ul） ）2.0 ul 总体积25.0 ul 所述按以下程序进行扩。

19、增： 6090min。 0024 4、 分析扩增产物结果步骤如下： 配1.5琼脂糖凝胶， 取9 L扩增的产物与10倍浓度上样缓冲液混匀后上样， 同时在相 邻泳道中加入DNA标记， 120V电泳30min， 紫外判断扩增结果。 0025 （1） 在同一泳道出现六条条带， 有三条在DNA标记100bp处至300bp处之间， 一条在 DNA标记300bp处， 一条在DNA标记400bp与500bp之间靠近500bp处， 一条在DNA标记500bp与 说明书 4/5 页 6 CN 105543384 A 6 600bp之间靠近500bp处， 位于100bp处至300bp处之间的条带为内参的结果条带， 。

20、位于DNA标 记300bp处的为XPD的Lys型的结果条带， 位于DNA标记400bp与500bp之间靠近500bp处为 XRCC1的Arg型的结果条带， 位于DNA标记500bp与600bp之间靠近500bp处为XRCC1的Gln型的 结果条带； （2） 在同一泳道出现六条条带， 有三条在DNA标记100bp处至300bp处之间， 一条在DNA标 记300bp处， 两条在DNA标记300bp与400bp之间靠近400bp处， 位于100bp处至300bp处之间的 条带为内参的结果条带， 位于DNA标记300bp处的为XPD的Lys型的结果条带， 位于DNA标记 300bp与400bp之间靠近。

21、400bp处中分子量较大的为XRCC1的Trp型的结果条带， 位于DNA标记 300bp与400bp之间靠近400bp处中分子量较小的为XRCC1的Arg型的结果条带； ； （3） 非阴性样本的扩增产品在同一泳道未任何条带出现时， 表明DNA提取出现问题， 需 要重新进行试验。 0026 5、 结论 本发明分型结果清晰可判读， 如图3所示。 0027 1号样本： 在同一泳道出现六条条带， 有三条在DNA标记100bp处至300bp处之间， 一 条在DNA标记300bp处， 一条在DNA标记400bp与500bp之间靠近500bp处， 一条在DNA标记 500bp与600bp之间靠近500bp处。

22、， 位于100bp处至300bp处之间的条带为内参的结果条带， 位 于DNA标记300bp处的为XPD的Lys型的结果条带， 位于DNA标记400bp与500bp之间靠近500bp 处为XRCC1的Arg型的结果条带， 位于DNA标记500bp与600bp之间靠近500bp处为XRCC1的Gln 型的结果条带； 2号样本： 在同一泳道出现六条条带， 有三条在DNA标记100bp处至300bp处之间， 一条在 DNA标记300bp处， 两条在DNA标记300bp与400bp之间靠近400bp处， 位于100bp处至300bp处 之间的条带为内参的结果条带， 位于DNA标记300bp处的为XPD的。

23、Lys型的结果条带， 位于DNA 标记300bp与400bp之间靠近400bp处中分子量较大的为XRCC1的Trp型的结果条带， 位于DNA 标记300bp与400bp之间靠近400bp处中分子量较小的为XRCC1的Arg型的结果条带； ； 3号样本： 非阴性样本的扩增产品在同一泳道未任何条带出现时， 表明DNA提取出现问 题， 需要重新进行试验。 0028 与测序方法相比较： 对同一来源的样本的相同基因分型结果是一致的。 说明书 5/5 页 7 CN 105543384 A 7 上海中优生物高科技有限责任公司 12 1 27 DNA 人工序列 引物 1 CGACCTGTCACCGCCCTCG。

24、GTCCCGGG27 2 27 DNA 人工序列 引物 2 CGCTGCGGGTGTAAACATAGGAGGTGG27 3 27 DNA 人工序列 引物 3 CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC27 4 序列表 1/4 页 8 CN 105543384 A 8 20 DNA 人工序列 引物 4 GCCAGGGCCCTCCTCTCAAA20 5 1+ DNA 人工序列 引物 5 TACCTCCAGACCCACGAGT19 6 20 DNA 人工序列 引物 6 TCCTCCACCTTGTGCTTTCT20 7 20 DNA 人工序列 引物 序列表 2/4 页 9 CN 10554。

25、3384 A 9 7 AGTAGTCTGCTGGCTCTGGG20 8 19 DNA 人工序列 引物 8 GCCCGCTCTGGATTATACG19 9 20 DNA 人工序列 引物 9 CTATCATCTCCTGGCCCTAT20 10 223 DNA 人工序列 内参序列 10 CGGTCCCGGGAGGAGAGTTTTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCT50 TTTGATTTGTTAAAACACCTTGCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAAG100 AAATCAAAAGTCTGTGGCAAGCCGCTTAATGACACTCGTTTGCTGGCT150。

26、 GAATCTCCGGCAGCATTCATACGAATCTCCGGCAGCATTCACACCCAGCA200 序列表 3/4 页 10 CN 105543384 A 10 ACATATGGAGGTCTGGGTGCTCA223 11 173 DNA 人工序列 内参序列 11 TCCTCCACCTTGTGCTTTCTTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCT50 TTTGATTTGTTAAAACACCTTGCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAA100 GAAATCAAAAGTCTGTGGCAAGCCGCTTAATGACACTCGTTTGCTGGCTT150 CATTCATCAGACGACCGAGACCC173 12 122 DNA 人工序列 内参序列 12 CGGGCGAGACCTAATATGCTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCTT50 TTGATTTGTTAAAACACCTTGCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAAG100 ATGATAGTAGAGGACCGGGATA122 序列表 4/4 页 11 CN 105543384 A 11 图1 图2 说明书附图 1/2 页 12 CN 105543384 A 12 图3 说明书附图 2/2 页 13 CN 105543384 A 13 。