技术领域：
本发明提供了一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系，可用于制备无伪狂犬病毒感染的细胞 或动物模型，同时提供了相应的制备方法，属于细胞生物学技术领域。
背景技术：
伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）是发生于家猪和野猪的病毒病，在世界上的大 部分地区呈地方性流行。牛、羊、猫、狗等家畜和野生哺乳动物都是易感染动物。另外，有文 献报道，该病毒还可以感染人类。
PRV属于疱诊病毒科，与感染人类的单纯疱疹病毒（HSV）亲缘关系较近。该病毒的 UL30基因编码DNA复制酶亚基，且其基因序列在疱诊病毒科的病毒中保守性较强。因此， UL30基因可以作为疱诊病毒科病毒的预防及治疗的靶基因。另外，目前国内外关于猪伪狂 犬病毒的抑制细胞系的研究尚没有报道。
发明内容：
本发明公开了一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系，该细胞可以显著抑制伪狂犬病毒的感 染，可用于制备无伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型；
本发明还提供了猪伪狂犬病毒的抑制细胞系的制备方法，适用于人工制备该细胞系；
本发明提供的一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系，其特征在于：
该细胞含有Cas9核酸内切酶系统和靶向PRV的UL30基因的sgRNA；该细胞感染PRV后，该 sgRNA可以特异结合到UL30基因的特定位点上，并准确地引导细胞内的Cas9核酸内切酶系 统将UL30基因特异切断，导致UL30基因不能表达，从而达到抑制病毒复制的目的；
本发明公开了一种真核表达载体PX459-PRV，用于构建上述的猪伪狂犬病毒抑制细胞 系；
本发明构建的真核表达载体PX459-PRV是在PX459载体的基础上，插入人工合成的DNA 片段而成；
本发明公开的PX459-PRV上插入的人工合成的DNA片段可以在细胞内转录为sgRNA，且 该sgRNA可以特异地与PRV的UL30基因的特定位点结合；
本发明公开的人工合成的DNA序列为：
sgPRV-F3：5-caccgtgccgccgcagtagaccgt-3,
sgPRV-R3：5-aaacacggtctactgcggcggcac-3；
本发明所述猪伪狂犬病毒的抑制细胞系的制备方法，包括以下步骤：
1.人工合成DNA片段
sgPRV-F3：5-caccgtgccgccgcagtagaccgt-3,
sgPRV-R3：5-aaacacggtctactgcggcggcac-3；
2.真核表达载体PX459-PRV的构建
将上述合成的DNA片段经过退火后，连接到真核表达载体PX459的相应酶切位点上，构 建成真核表达载体PX459-PRV；
3.猪伪狂犬病毒抑制细胞系的建立
将上述构建的真核表达载体PX459-PRV用FspI酶切线性化，转染到PK-15细胞中，对经 抗性筛选获得的阳性细胞进行鉴定，对鉴定正确的阳性细胞进行冻存；
3.1载体线性化：提取PX459-PRV质粒，用FspI酶切，然后乙醇沉淀，用无菌ddH2O溶 解；
3.2转染：将线性化的载体按照TurboFect?transfectionreagent(Thermo FisherScientific,USA)说明书转染PK-15细胞，5%CO2，37℃培养；
3.3细胞系的获得：上述转染后的细胞用Puro筛选8-10天后，获得抗性细胞；
4.猪伪狂犬病毒抑制细胞系的鉴定
对上述Puro筛选获得的阳性细胞，用IFA方法进行鉴定，即得到猪伪狂犬病毒的抑制细 胞系，并命名为PX459-PRV-i细胞。
IFA实验过程为：将PK-15细胞铺于24孔细胞培养皿中；细胞长满单层以后，将细胞培养液弃掉，各孔分别用200PBS清洗3遍；之后，各孔分别加入20080%冷丙酮，放置-20℃固定过夜；然后，将冷丙酮弃掉，各孔分别用200PBS清洗3遍，将FlagtagAntibodyRabbitpolyclonal（武汉三鹰）进行1：500稀释（稀释液为PBS+10%FBS）后，各孔分别加入200，于37℃恒温箱中孵育2.5h；弃掉一抗，各孔分别用200PBS清洗4遍，然后各孔分别加入200FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)（1:1000稀释，稀释液为PBS+10%FBS），于37℃恒温培养箱中孵育1h；弃掉二抗，各孔分别用200PBS清洗4遍，最后用荧光显微镜观察。
本发明的积极效果在于：制备的猪伪狂犬病毒的抑制细胞系含有Cas9核酸内切酶 系统和靶向PRV的UL30基因的sgRNA。该细胞对PRV的感染具有显著的抑制作用。可用于制备 无伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型，在临床、实验室研究上具有广阔的应用前景。
附图说明：
图1.真核表达载体PX459-PRV制备流程图；
图2.猪伪狂犬病毒的抑制细胞的荧光结果图；
图3.猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV基因组拷贝数效果图；
图4.猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV的TCIC50效果图；
图5.猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV感染的IFA效果图。
具体实施方式
以下实施例证明本发明的效果，下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是 以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域 普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
真核表达载体PX459-PRV的构建
1合成DNA片段
sgPRV-F3：5-caccgtgccgccgcagtagaccgt-3,
sgPRV-R3：5-aaacacggtctactgcggcggcac-3。
2实验过程（参照图1）
1）PX459-PRV的构建：用BbsI酶切PX459载体，回收载体片段；将上述人工合成的DNA 片段退火后与回收的PX459载体片段连接。
2）转化将上述连接后的载体转化大肠杆菌DH5a，获得阳性菌株。
3结果测序鉴定，成功构建了PX459-PRV。
4结论成功构建了用于制备猪伪狂犬病毒的抑制细胞的表达质粒PX459-PRV。
实施例2
猪伪狂犬病毒的抑制细胞的制备
1质粒PX459-PRV。
2细胞PK-15细胞。
3实验过程
1）载体线性化：提取PX459-PRV质粒，用FspI酶切，然后乙醇沉淀，用无菌ddH2O溶解。
2）转染：将线性化的载体按照TurboFect?transfectionreagent(Thermo FisherScientific,USA)说明书转染PK-15细胞，5%CO2，37℃培养。
3）细胞系的获得：上述转染后的细胞用Puro筛选8-10天后，获得抗性细胞；采用 IFA法进行鉴定。
4)阳性细胞的鉴定：对上述Puro筛选获得的阳性细胞，用IFA方法进行鉴定，得到 猪伪狂犬病毒的抑制细胞系，并命名为PX459-PRV-i细胞。
IFA实验过程为：将PK-15细胞铺于24孔细胞培养皿中；细胞长满单层以后，将细胞培养液弃掉，各孔分别用200PBS清洗3遍；之后，各孔分别加入20080%冷丙酮，放置-20℃固定过夜；然后，将冷丙酮弃掉，各孔分别用200PBS清洗3遍，将FlagtagAntibodyRabbitpolyclonal（武汉三鹰）进行1：500稀释（稀释液为PBS+10%FBS）后，各孔分别加入200，于37℃恒温箱中孵育2.5h；弃掉一抗，各孔分别用200PBS清洗4遍，然后各孔分别加入200FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)（1:1000稀释，稀释液为PBS+10%FBS），于37℃恒温培养箱中孵育1h；弃掉二抗，各孔分别用200PBS清洗4遍，最后用荧光显微镜观察。
4结果在荧光显微镜下观察到，转染PX459-PRV质粒的细胞发出明显的绿色荧 光，与对照PK-15细胞有显著差异（参照图2），达到了预期效果。
5结论获得猪伪狂犬病毒的抑制细胞系PX459-PRV-i细胞。
实施例3
猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV基因组复制的实验
1细胞PK-15细胞和PX459-PRV-i细胞。
2病毒PRV。
2实验过程PK-15细胞和PX459-PRV-i细胞密度达到70%时，分别感染PRV（6 TCID50），继续培养，并在感染后10小时提取病毒基因组，用实时荧光定量PCR方法检测PRV的 基因组拷贝数。
PRV实时荧光定量PCR扩增引物为：
PRVRealtimeF2：5-GGTTCAACGAGGGCCAGTACCG-3，
PRVRealtimeR：5-GCGTCAGGAATCGCATCACGT-3。
3结果与对照PK-15细胞相比，在感染PRV10小时后，PRV基因组拷贝数在猪伪狂 犬病毒的抑制细胞中的含量显著下降（参照图3）。
4结论猪伪狂犬病毒的抑制细胞可以显著抑制PRV的基因组复制。
实施例4
猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV滴度的实验
1细胞PK-15细胞和PX459-PRV-i细胞。
2病毒PRV。
3实验过程用DMEM+5%FBS的细胞培养液将病毒液从10-2-10-9作连续10倍的稀释； 将稀释好的病毒分别接种到培养PK-15细胞和PX459-PRV-i细胞的96孔细胞培养板中，每一 稀释度接种8孔，每孔接种20mL病毒，37℃细胞培养箱中孵育1h；弃掉病毒液，每孔用100 mLPBS清洗3遍，然后加入200mL细胞培养液（DMEM+5%FBS），放入37℃细胞培养箱培养； 在接种病毒72h后观察细胞病变并记录结果；按Reed-Muench两氏法计算各孔细胞中病毒 的TCID50。
4结果与对照PK-15细胞相比，PX459-PRV-i细胞中的PRV的TCID50显著下降（参 照图4）。
5结论猪伪狂犬病毒的抑制细胞可以显著抑制PRV的增殖。
实施例5
猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV增殖的IFA检测实验
1细胞PK-15细胞和PX459-PRV-i细胞。
2病毒PRV。
3实验过程将PK-15细胞和PX459-PRV-i细胞计数后铺于24孔细胞培养板中；待细胞 长至~70%密度后，将细胞培养液弃掉，分别用200mLPBS清洗2遍后，然后分别加入150mL 的PRV病毒（1:50稀释）培养液；37℃细胞培养箱中孵育1h后，弃掉培养液，用200mLPBS清 洗3遍后，加入500mL正常细胞培养液，放置37℃细胞培养箱中培养10h；将细胞培养液弃 掉，用200mLPBS清洗2遍后，用150mL80%冷丙酮，放置-20℃固定过夜；之后，将冷丙酮 弃掉，用200mLPBS清洗3遍，加入200mLAnti-PseudorabiesVirusantibody（1:500稀 释），于37℃恒温箱中孵育2.5h；用200mLPBS清洗4遍后，加入200mLFITC标记山羊抗兔 IgG(H+L)（1:500稀释），于37℃恒温培养箱中孵育1h；弃掉二抗，用200mLPBS清洗4遍，利 用荧光显微镜进行观察。
4结果与对照PK-15细胞相比，PX459-PRV-i细胞中的PRV产量显著下降（参照图 5）。
5结论猪伪狂犬病毒的抑制细胞可以显著抑制PRV的增殖。
SEQNo.1
<110>吉林大学
<120>一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系
<140>
<160>6
<210>1
<211>150
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
caccgtgccgccgcagtagaccgt
SEQNo.2
<110>吉林大学
<120>一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系
<140>
<160>6
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aaacacggtctactgcggcggcac