一种绿色木霉突变株的发酵方法及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610049068.8 (22)申请日 2016.01.26 C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (71)申请人 李晓白 地址 230088 安徽省合肥市高新区海关路 10 号望园别墅 22 栋 (72)发明人 李晓白 蒋立科 (54) 发明名称 一种绿色木霉突变株的发酵方法及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种绿色木霉突变株的发酵方 法及应用， 所述方法包括 ： 菌株的活。

2、化 ； 活化后菌 株的孢子悬浮液培养 ； 固体发酵培养基料准备 ； 固体发酵得到绿色木霉突变株的发酵产物， 该发 酵产物可用于制备防治土传病的药剂。本发明通 过筛选出几丁质和微晶羧甲基纤维素作为诱导物 进行促进该真菌对几丁质酶和纤维素酶的合成并 依该菌的嗜甘蔗糖的特性， 以禾本科作物秸秆、 畜 禽屠宰血为氮源为基料进行发酵， 达到既对作物 抗病又促进生长， 还可实现充分对农牧业宰杀废 弃物进行综合利用， 减少环境污染， 促进经济、 社 会、 生态三个效益协同发展。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 CN 105505。

3、799 A 2016.04.20 CN 105505799 A 1.一种绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)液体发酵， 包括以下步骤： 11)菌株的活化： 将经秋水仙碱化学诱变的绿色木霉突变株接种到PDA培养基上培养5 7天， 使其菌物活化并适应发酵的新环境； 12)活化后菌株的孢子悬浮液培养： 取活化后的菌株， 接种培养于可在显微镜下显示孢 子成熟， 用10ml无菌水冲洗活化后的孢子至150ml无菌三角瓶中， 然后在恒温摇床上以 120r/min振荡20min， 使孢子团充分分散后， 用血球计数器计数， 再以1108个/ml的接种量 接种于一定体积并装有液体培养基。

4、的发酵罐中发酵57天， 得到活化后菌株的孢子悬浮 液； 在发酵过程中， 用0.100.25molNaOH调节pH于4.36.5之间； (2)固体发酵， 包括以下步骤： 21)固体发酵培养基料准备： 按照质量百分比计， 由碳素38、 氮素4、 磷酸盐矿质元 素1、 石碳粉22、 水25和菌物10组成； 所述的碳素源自含水率均10的甘蔗渣、 作 物秸秆粉、 麦麸、 玉米壳粉、 碎米糠中的一种或两种以上的混合物； 所述的氮素包括无机氮 源和有机氮源， 无机氮源为尿素、 (NH4)NO3、 NaNO3、 亚硝酸钠和硫酸铵中的一种或两种以上 的混合物， 有机氮源为蛋白胨、 鱼粉和血粉中的一种或两种以上的。

5、混合物； 所述的磷酸盐矿 质元素为KH2PO4、 K2HPO4、 Na2HPO4、 NaH2PO4、 (NH4)2HPO4和(NH4)H2PO4中的一种或两种以上的混 合物； 所述的菌物源自步骤(1)中的活化后菌株的孢子悬浮液； 所述的血粉的配制： 收购集 贸市场宰杀后的动物血， 倒入蒸煮锅的沸水中， 3min即捞出沉淀， 粉碎风干或烘干再打成粉 末， 即为血粉； 22)固体发酵： 将碳素、 氮素、 磷酸盐矿质元素、 石碳粉按上述比例组合， 经充分搅拌， 于 蒸煮锅或消毒罐在1.13个大气压下高温消毒30min， 出料， 冷至室温后， 按比例加入步骤(1) 中活化后菌株的孢子悬浮液， 经充分拌。

6、匀后， 转入大型发酵罐控温发酵57天， 发酵温度在 280.5， 冷风吹干包装， 即得绿色木霉突变株的发酵产物。 2.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 所述步骤12)中， 还 按照每升体积溶液加入80单位青霉素200 L的量， 添加80单位青霉素； 发酵罐内需持续通过 供氧装置保持供氧， 同时， 还需保持发酵罐内留有1/32/5的空间。 3.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 所述步骤12)中， 在 发酵过程中， 用0.100.25molNaOH调节pH于5.36.2之间。 4.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 。

7、所述步骤12)中， 还 包括采用旋转蒸发或真空浓缩的方法将得到的活化后菌株的孢子悬浮液浓缩至35倍。 5.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 所述的作物秸秆粉 包括甘蔗杆粉、 玉米杆粉、 稻秆粉和豆类秸秆粉。 6.根据权利要求5所述的绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 所述的碳素为麦麸 +甘蔗杆粉、 玉米壳粉+麦麸、 甘蔗杆粉+玉米壳粉、 麦麸+碎米糠、 碎米糠+玉米壳粉、 玉米壳 粉中的一种。 7.根据权利要求6所述的绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 所述的碳素为玉米 壳粉+麦麸， 麦麸+甘蔗杆粉， 或者碎米糠+玉米壳粉； 所述的无机氮源为硝酸铵和尿素。

8、； 所述 的有机氮源为蛋白胨和血粉； 所述的磷酸盐矿质元素为质量比为KH2PO4， 或者等质量的 KH2PO4+(NH4)2HPO4。 权利要求书 1/2 页 2 CN 105505799 A 2 8.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中， 液 体培养基的配制： 去皮马铃薯600g， 先切成薄片再粉碎煮沸20min， 用尾布过滤并拧干弃渣 留汁， 加入45g麦麸或玉米壳粉或碎米糠作为B族维生素供体， 煮沸半小时以上， 趁热过滤弃 渣； 加蔗糖60g、 蜂蜜90g， 用注射器从发酵罐加样孔注入80万单位青霉素， 酵母粉15g， 浓度 为10g/L的胶态几。

9、丁质3ml， 再加水直至5L发酵罐内仅余下2L的空间， 灭菌； 所述的胶态几丁 质的配制： 称取几丁质10g， 加入100ml于4预冷的85磷酸溶液， 充分混合， 并置于4保 温2个昼夜， 再加入过量pH值为6.0的磷酸缓冲液调整几丁质浓度为10g/L， 放入玻璃瓶中， 加入直径3mm的玻璃珠， 再于摇床上以180r/min的速度振荡2h， 即可得到浓度为10g/L的胶 态几丁质。 9.根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的发酵方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中， 固 体发酵所用培养基的组分及配比为： 去皮马铃薯150200g/L； 蔗糖101.5g/L； 磷酸钠3.5- 5.0； FeSO。

10、40.10.3g； KH2PO40.22.0g； MgSO40.50.35g； CaSO40.50.10g； ZnSO4 0.10.2g； 重蒸水1.0L； pH自然状态。 10.如权利要求19任一所述的发酵方法制得的绿色木霉突变株的发酵产物在制备防 治土传病的药剂中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105505799 A 3 一种绿色木霉突变株的发酵方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物培养技术领域， 具体是一种绿色木霉突变株的发酵方法及应 用。 背景技术 0002 绿色木霉在木霉属中是一种较为理想的抗土传病的半知菌， 不仅效果快， 且抗菌 的广谱性强， 还具有一定的促作。

11、物生长之作用。 尤其是对防治土壤中的立枯病和赤霉病均 有快而显著的作用， 当上述病害发生时， 既可以迅速控制病情， 也可在作物种子播撒时拌入 种子起到防疫作用。 此外还可以对作物的营养利用、 环境温度及光等环境因子适应方面发 挥良好作用。 因此， 在了解它的生物学作用的基础上， 筛选出适合于它生长并合成发挥生物 学抑菌作用的产物， 应用于减少作物病害、 促进作物生长、 为人畜提供安全健康的食物具有 重要意义。 0003 近年来(2007年2014年)黑龙江林业职业研究院孙永琴通过绿色木霉对栽培黑 木耳的危害研究产生的生物学特性及防治， 王春等人从向日葵菌核病筛选出对菌核病菌生 长及其菌核病萌发。

12、有关抑制力的生防绿色木霉菌株， 对有关病菌孢子萌发抑制和离体叶片 的防效分别达90以上、 80以上， 并发现培养该生防绿色木霉菌株具有良好的生产性状 和生防效果。 其机制即在于将所筛选分离的野生绿色木霉经诱变筛选的第二次纯化菌物经 进一步扩大培养(即发酵)， 形成大量孢子体或菌丝体， 再适当加入添加剂制成颗粒剂、 粉 剂， 使之便于拌入种子一起播入土壤中， 当下雨或土壤湿度适当时即萌发， 通过分解土壤有 机质(如作物秸秆)， 其菌丝沿异源菌体缠绕并分泌细胞产物将异源菌物杀死， 或抑制其他 杂菌生长， 保护农作物。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种成本低、 效率高、 无污染的绿色木霉。

13、突变株的发酵方 法及应用。 0005 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0006 一种绿色木霉突变株的发酵方法， 包括以下步骤： 0007 (1)液体发酵， 包括以下步骤： 0008 11)菌株的活化： 将经秋水仙碱化学诱变的绿色木霉突变株接种到PDA培养基上培 养57天， 使其菌物活化并适应发酵的新环境； 0009 12)活化后菌株的孢子悬浮液培养： 取活化后的菌株， 接种培养于可在显微镜下显 示孢子成熟， 用10ml无菌水冲洗活化后的孢子至150ml无菌三角瓶中， 然后在恒温摇床上以 120r/min振荡20min， 使孢子团充分分散后， 用血球计数器计数， 再以1108个/ml。

14、的接种量 接种于一定体积并装有液体培养基的发酵罐中发酵57天， 得到活化后菌株的孢子悬浮 液； 在发酵过程中， 用0.100.25molNaOH调节pH于4.36.5之间； 0010 (2)固体发酵， 包括以下步骤： 说明书 1/6 页 4 CN 105505799 A 4 0011 21)固体发酵培养基料准备： 按照质量百分比计， 由碳素38、 氮素4、 磷酸盐矿 质元素1、 石碳粉22、 水25和菌物10组成； 所述的碳素源自含水率均10的甘蔗 渣、 作物秸秆粉、 麦麸、 玉米壳粉、 碎米糠中的一种或两种以上的混合物； 所述的氮素包括无 机氮源和有机氮源， 无机氮源为尿素、 (NH4)NO。

15、3、 NaNO3、 亚硝酸钠和硫酸铵中的一种或两种 以上的混合物， 有机氮源为蛋白胨、 鱼粉和血粉中的一种或两种以上的混合物； 所述的磷酸 盐矿质元素为KH2PO4、 K2HPO4、 Na2HPO4、 NaH2PO4、 (NH4)2HPO4和(NH4)H2PO4中的一种或两种以上 的混合物； 所述的菌物源自步骤(1)中的活化后菌株的孢子悬浮液； 所述的血粉的配制： 收 购集贸市场宰杀后的动物血， 倒入蒸煮锅的沸水中， 3min即捞出沉淀， 粉碎风干或烘干再打 成粉末， 即为血粉； 0012 22)固体发酵： 将碳素、 氮素、 磷酸盐矿质元素、 石碳粉按上述比例组合， 经充分搅 拌， 于蒸煮锅或。

16、消毒罐在1.13个大气压下高温消毒30min， 出料， 冷至室温后， 按比例加入步 骤(1)中活化后菌株的孢子悬浮液， 经充分拌匀后， 转入大型发酵罐控温发酵57天， 发酵 温度在280.5， 冷风吹干包装， 即得绿色木霉突变株的发酵产物。 0013 作为本发明进一步的方案： 所述步骤12)中， 还按照每升体积溶液加入80单位青霉 素200 L的量， 添加80单位青霉素； 发酵罐内需持续通过供氧装置保持供氧， 同时， 还需保持 发酵罐内留有1/32/5的空间。 0014 作为本发明进一步的方案： 所述步骤12)中， 在发酵过程中， 用0.100.25mol NaOH调节pH于5.36.2之间。。

17、 0015 作为本发明进一步的方案： 所述步骤12)中， 还包括采用旋转蒸发或真空浓缩的方 法将得到的活化后菌株的孢子悬浮液浓缩至35倍。 0016 作为本发明进一步的方案： 所述的作物秸秆粉包括甘蔗杆粉、 玉米杆粉、 稻秆粉和 豆类秸秆粉。 0017 作为本发明进一步的方案： 所述的碳素为麦麸+甘蔗杆粉、 玉米壳粉+麦麸、 甘蔗杆 粉+玉米壳粉、 麦麸+碎米糠、 碎米糠+玉米壳粉、 玉米壳粉中的一种。 0018 作为本发明进一步的方案： 所述的碳素为玉米壳粉+麦麸， 麦麸+甘蔗杆粉， 或者碎 米糠+玉米壳粉； 所述的无机氮源为硝酸铵和尿素； 所述的有机氮源为蛋白胨和血粉； 所述 的磷酸盐矿质。

18、元素为质量比为KH2PO4， 或者等质量的KH2PO4+(NH4)2HPO4。 0019 作为本发明进一步的方案： 所述步骤(1)中， 液体培养基的配制： 去皮马铃薯600g， 先切成薄片再粉碎煮沸20min， 用尾布过滤并拧干弃渣留汁， 加入45g麦麸或玉米壳粉或碎 米糠作为B族维生素供体， 煮沸半小时以上， 趁热过滤弃渣； 加蔗糖60g、 蜂蜜90g， 用注射器 从发酵罐加样孔注入80万单位青霉素， 酵母粉15g， 浓度为10g/L的胶态几丁质3ml， 再加水 直至5L发酵罐内仅余下2L的空间， 灭菌； 所述的胶态几丁质的配制： 称取几丁质10g， 加入 100ml于4预冷的85磷酸溶液，。

19、 充分混合， 并置于4保温2个昼夜， 再加入过量pH值为 6.0的磷酸缓冲液调整几丁质浓度为10g/L， 放入玻璃瓶中， 加入直径3mm的玻璃珠， 再于摇 床上以180r/min的速度振荡2h， 即可得到浓度为10g/L的胶态几丁质。 0020 作为本发明进一步的方案： 所述步骤(2)中， 固体发酵所用培养基的组分及配比 为： 去皮马铃薯150200g/L； 蔗糖101.5g/L； 磷酸钠3.5-5.0； FeSO40.10.3g； KH2PO4 0.22.0g； MgSO40.50.35g； CaSO40.50.10g； ZnSO40.10.2g； 重蒸水1.0L； pH自然 状态。 说明书。

20、 2/6 页 5 CN 105505799 A 5 0021 所述的发酵方法制得的绿色木霉突变株的发酵产物在制备防治土传病的药剂中 的应用。 0022 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0023 本发明所采用的绿色木霉突变株是从残腐木材上分离纯化出来的野生菌株经化 学诱变而获得高效抗小麦赤霉病等类土传病的突变菌株， 其是一种有遗传缺陷的突变株， 只需要合适的培养基， 它就能较好生长并合成较野生菌株更高产量和抗菌性较好的生物活 性产物， 以提高目标产物的使用价值， 降低生产成本， 达到较好经济效益。 该绿色木霉突变 株的抗菌目标产物几丁质酶、 纤维素酶的活性较野生型分别由340U提高至71。

21、0U， 14U上升至 58U， 可以用于防止土壤中的有害病原菌物， 一方面， 可以避免其危害农作物导致的减产， 另 一方面， 还可以避免其通过食物链影响人畜健康。 0024 本发明通过筛选出几丁质和微晶羧甲基纤维素作为诱导物进行促进该真菌对几 丁质酶和纤维素酶的合成并依该菌的嗜甘蔗糖的特性， 以禾本科作物秸秆、 畜禽屠宰血为 氮源为基料进行发酵， 达到既对作物抗病又促进生长， 还可实现充分对农牧业宰杀废弃物 进行综合利用， 减少环境污染， 促进经济、 社会、 生态三个效益协同发展。 本发明方法成本 低、 效率高、 无污染。 具体实施方式 0025 下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技。

22、术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的 实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都 属于本发明保护的范围。 0026 实施例1 0027 本发明实施例中， 一种绿色木霉突变株的发酵方法， 包括以下步骤： 0028 (1)液体发酵， 包括以下步骤： 0029 11)菌株的活化： 将经分离筛选诱变的绿色木霉突变株接种到PDA培养基上培养5 7天， 使其菌物活化并适应发酵的新环境； 0030 其中绿色木霉突变株的诱变过程为： 先从野外植物腐烂残体的水溶液取样， 于26 接种于PDA。

23、固体培养基上培养35天， 对照国家微生物菌库所公布图样M1、 M2进行筛选鉴 定后， 经二代连续培养出纯化绿色木霉菌株； 将纯化绿色木霉菌株再经液态PDA培养基(该 液体PDA培养基按照重量百分比由以下物质配置而成： 马铃薯23； 鱼蛋白粉0.5 3.3； FeSO40.010.03； KH2PO40.020.20； MgSO40.050.35； Na2B2O710H2O 0.0250.05； Na2SeO30.0250.05， ZnSO40.010.02， 余量为水； pH值调至5.8 6.5， 培养温度为271.0， 培养时间为5天)中扩大培养， 离心去清液(保留冰箱4)， 测定 活性， 。

24、再用二级纯水洗涤， 以8000r/min离心15min， 取沉淀并重复一次扩大培养， 离心去清 液(保留冰箱4)， 测定活性， 再用二级纯水洗涤， 以8000r/min离心15min， 取沉淀吹干后保 存于冰箱暗处， 以保障菌物优良特征改变较小； 将离心后的清液放入PDA培养基中， 以几丁 质或者结晶羧酸纤维素钠为反应底物(其中几丁质的添加量是单独按照发酵物体积容量配 制(10g/L)加入发酵容器内， 结晶羧酸纤维素钠的加入也是单独按照发酵物体积容量配制 (10g/L)加入发酵容器内)， 以化学诱变剂秋水仙碱作为诱变剂， 进行诱变， 其中诱变剂 说明书 3/6 页 6 CN 105505799。

25、 A 6 的浓度为0.0050.08wt； 诱变时间为6120h， 诱变终止后， 经离心取沉淀物， 即为绿色 木霉突变株， 置于暗处稳定46h， 避免遇光恢复突变而导致失败。 0031 12)活化后菌株的孢子悬浮液培养： 取活化后的菌株， 接种培养于可在显微镜下显 示孢子成熟， 用10ml无菌水冲洗活化后的孢子至150ml无菌三角瓶中， 然后在恒温摇床上以 120r/min振荡20min， 使孢子团充分分散后， 用血球计数器计数， 再以1108个/ml的接种量 接种于一定体积并装有液体培养基的发酵装置罐(V： 30L-5吨)中发酵57天， 得到活化后 菌株的孢子悬浮液； 0032 其中发酵罐有。

26、效体积的设定为： 该类真菌的发酵为有氧发酵， 为保障发酵有效性， 需持续通过一定供氧装置保持供氧， 除不停搅拌充氧外， 还使发酵罐内保持1/32/5空间 无液体培养基沾壁及罐底， 防止杂菌污染。 0033 发酵体系的防杂菌污染： 绿色木霉虽抗土传病的病原体， 但在发酵过程中仍受同 类不同菌株污染而影响抗菌性， 在发酵过程中， 每升体积溶液需加80单位青霉素200 L。 0034 发酵罐内反应体系pH控制： 发酵的启动、 延续与周围环境pH紧密相关， 关键启动后 延续时间和产物的产量高低， 及时检测， 用0.100.25mol或0.100.25molNaOH调节pH于 4.36.5之间， 以5.。

27、36.2较好。 0035 发酵物主要产物的活力测定： 活力的测定表示产品质量的高低、 抗菌作用的有效 性。 以所产几丁质酶和纤维素酶活性大小最重要， 前者用DN5法测定(李江遐， 蒋立科； 木霉 在坪用黑麦草上应用效果初报J)草业科学， 2008， 23(1)： 103-105)； 后者用滤纸糖-DNA法 测定孔雷等， 滤纸糖-DNA比色法测定纤维素酶酶活力J印染， 1999， 25(1)： 3638。 0036 发酵液的浓缩与储存， 液体发酵产物的活性大小与发酵液有效物含量相关， 欲保 持较高活性需通过浓缩达到一定浓度， 一般常温下需浓缩至35倍， 方可达到6个月后， 浓 缩液活性物质的活性。

28、(即酶活)不低于原活性的50以下。 故常采用旋转蒸发或真空浓缩， 前者较理想。 0037 (2)固体发酵， 包括以下步骤： 0038 21)固体发酵培养基料准备： 0039 固体发酵的糖类基料： 收集制作压榨后的甘蔗渣(或玉米杆、 稻草、 豆类秸秆等)晒 干粉碎成0.100.50mm， 经自然风干或红外烘干， 使含水量10， 储存； 麦麸、 玉米壳及碎 米糠(同样干燥)； 普通自来水； 0040 固体发酵的其他非糖类基料： 收购集贸市场宰杀后的动物血， 倒入蒸煮锅的沸水 中， 3min即捞出沉淀， 粉碎风干或烘干再打成粉末， 即为血粉， 用瓶装储放。 0041 固体发酵所需无机元素： KH2P。

29、O4； Na2HPO4； NaH2PO4； (NH4)NO3， 尿素， (NH4)2SO4， MgSO4。 0042 发酵诱导物： 由于发酵的菌株是嗜几丁质缺陷型， 需要供给几丁质或能供给含几 丁质的中间体， 促进菌株繁育， 合成高产高效几丁质抗菌酶的几丁质， 葡萄糖、 蔗糖、 麦芽 糖、 蛋白胨。 0043 固体发酵基料配比组合： 0044 1、 外加碳源 0045 A.名称： 麦麸、 甘蔗杆粉、 玉米杆粉、 碎米糠、 玉米壳粉。 0046 B.碳源组合： 麦麸+甘蔗杆粉； 玉米壳粉+麦麸； 甘蔗杆粉+玉米壳粉； 麦麸 说明书 4/6 页 7 CN 105505799 A 7 +碎米糠； 碎。

30、米糠+玉米壳粉； 玉米壳粉。 0047 上述6组均合适， 其中以和较好， 既含有绿色木霉所嗜好的糖， 又有代谢合成 所需的维生素和矿物质。 0048 2、 外加氮源 0049 其较合适的氮源： 无机氮源(尿素， (NH4)NO3， NaNO3， 亚硝酸钠， 硫酸铵)； 有机氮源 (蛋白胨， 鱼粉， 血粉)。 其中无机氮中以硝酸铵和尿素较好， 来源容易而广泛， 易于操作； 有 机氮中以蛋白胨和血粉较好， 来源容易， 成本低， 且发酵快。 0050 磷酸盐矿质元素： KH2PO4， K2HPO4， Na2HPO4， (NH4)H2PO4， 其中以11的KH2PO4+(NH4) 2HPO4或单独的K。

31、H2PO4为好， 用量各为1wt。 0051 固体培养基组合： 质量比为14的玉米壳粉+麦麸， 或质量比为32的麦麸+甘蔗杆 粉， 将碳素设为A， 氮素设为B， 磷酸盐矿质元素为C， 石碳粉设为D， 水为E， 菌物为F， 所成比为 A38B4C1D22E25F10每个字母右下角为发酵系统的质量百份数。 0052 22)固体发酵： 将A、 B、 C、 D按上述比例组合， 经充分搅拌， 于蒸煮锅或消毒罐高温消 毒(1.13个大气压下)消毒30min， 出料， 冷至室温后， 依设定份额加入步骤(1)中活化后菌株 的孢子悬浮液， 经充分拌匀后， 转入大型发酵罐控温(280.5)发酵57天， 冷风吹干包。

32、 装， 即得绿色木霉突变株的发酵产物。 发酵中需定时(68h)抽样检测pH。 0053 具体地， 本发明实施例中， 按固液两种产物设计重量比， 配制培养基： 0054 固体制种培养基： 去皮马铃薯150200g/L； 蔗糖101.5g/L； 磷酸钠3.5-5.0； FeSO40.10.3g； KH2PO40.22.0g； MgSO40.50.35g； CaSO40.50.10g； ZnSO40.1 0.2g； 重蒸水1.0L； pH自然状态； 0055 诱导补偿物的配制： 称取诱导物几丁质(亦称甲壳素)(若本地有化剂公司可从当 地购取)10g， 加入100ml于4预冷的85磷酸溶液， 充分混合。

33、， 并置于4保温2个昼夜； 再 加入过量pH值为6.0的磷酸缓冲液调整几丁质浓度为10g/L， 放入厚壁玻璃瓶中， 加入直径 3mm的玻璃珠， 再于摇床上以180r/min的速度振荡2h， 即可得到浓度为10g/L的胶态几丁质， 用于诱导缺陷型绿色木霉突变株产抗病菌的几丁质酶和纤维素酶， 提高抗病害效果。 若无 上述诱导物几丁质， 则可参照蒋立科方法自制(ZL200510039128.X)。 0056 蒋立科制几丁质的方法： 将经剔除残余(剩)腐肉后的贝壳、 蟹壳、 虾皮等洗净烘 干， 粉碎成粉末， 0.2molcp级盐酸浸提1个昼夜， 并不停搅拌(或用电磁振荡器搅拌80次/ min)， 过滤。

34、或离心所得沉淀物用自来水洗涤至中性， 再用蒸馏水洗去氯离子， 干燥粉碎即 可。 0057 液体培养基： 去皮马铃薯600g， 先切成薄片再粉碎煮沸20min， 用尾布过滤并拧干 弃渣(留作饲料)留汁， 加入45g麦麸(或等重的玉米壳粉， 或等重的碎米糠)作为B族维生素 供体， 煮沸半小时以上， 趁热过滤弃渣； 加蔗糖60g、 蜂蜜90g， 用注射器从发酵罐加样孔注入 80万单位青霉素， 酵母粉15g， 浓度为10g/L的胶态几丁质3ml， 再加水直至5L发酵罐内相当 于3L的体积， 灭菌。 0058 本发明所采用的绿色木霉突变株是从残腐木材上分离纯化出来的野生菌株经化 学诱变而获得高效抗小麦赤。

35、霉病等类土传病的突变菌株， 其是一种有遗传缺陷的突变株， 只需要合适的培养基， 它就能较好生长并合成较野生菌株更高产量和抗菌性较好的生物活 性产物， 以提高目标产物的使用价值， 降低生产成本， 达到较好经济效益。 该绿色木霉突变 说明书 5/6 页 8 CN 105505799 A 8 株的抗菌目标产物几丁质酶、 纤维素酶的活性较野生型分别由340U提高至710U， 14U上升至 58U， 可以用于防止土壤中的有害病原菌物， 一方面， 可以避免其危害农作物导致的减产， 另 一方面， 还可以避免其通过食物链影响人畜健康。 0059 本发明通过筛选出几丁质和微晶羧甲基纤维素作为诱导物进行促进该真菌。

36、对几 丁质酶和纤维素酶的合成并依该菌的嗜甘蔗糖的特性， 以禾本科作物秸秆、 畜禽屠宰血为 氮源为基料进行发酵， 达到既对作物抗病又促进生长， 还可实现充分对农牧业宰杀废弃物 进行综合利用， 减少环境污染， 促进经济、 社会、 生态三个效益协同发展。 0060 对于本领域技术人员而言， 显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下， 能够以其他的具体形式实现本发明。 因此， 无论 从哪一点来看， 均应将实施例看作是示范性的， 而且是非限制性的， 本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定， 因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。 0061 此外， 应当理解， 虽然本说明书按照实施方式加以描述， 但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案， 说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体， 各实施例中的技术方案也可以经适当组合， 形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。 说明书 6/6 页 9 CN 105505799 A 9 。