《一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物及其方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物及其方法.pdf（13页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511010075.9 (22)申请日 2015.12.30 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 广州金域检测科技股份有限公司 地址 510000 广东省广州市国际生物岛螺旋 四路 1 号标准产业单元一期生产区第 三层 304 单元 (72)发明人 赵薇薇 胡昌明 梁耀铭 于世辉 燕启江 郭周萍 (74)专利代理机构 北京精金石专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 11470 代理人 刘晔 (54) 发明名称 一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引 物及其方法 (57) 。
2、摘要 本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一 种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物及其 方法。 本发明提供的 IL28B 和 ITPA 基因多态性的 引物， 包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。 本 发明提供的IL28B和ITPA基因多态性的引物具有 特异性强， 检测灵敏度好， 准确性高的优点， 实现 了 IL28B 和 ITPA 基因多态性的检测， 可用于指导 利巴韦林的用量调整， 以提高抗病毒治疗的反应， 同时也可以为临床预测丙型肝炎抗病毒个体化治 疗效果提供依据， 具有重大的社会意义。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专。
3、利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 105506100 A 2016.04.20 CN 105506100 A 1.一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物， 其特征在于： 包括PCR扩增引物和 SNaPshotPCR引物 ； 所述PCR扩增引物包括 ： 针对IL28B9917的上游引物5 - AGTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTG-3 和下游引物5 -AAAGCCAGCTACCAAACTGTAT-3 ， 针对 I L 2 8 B 9 8 6 0的 上 游 引物 5 - G T C G TG C C TG T C G TG T A C T - 3。
4、 和下 游 引物 5 - TCAGGGTCAATCACAGAAGGG-3 ， 针对ITPA的上游引物5 -GGAGATGGGCAGCAGAGTTA-3 和下游 引物5 -CAGGTCACAGGAAGACAGAGA-3 ； 所述SNaPshotPCR引物包括： 针对IL28B9917的 SNaPshotPCR引物5 -CATGGTTCCAATTTGGGTGA-3 ， 针对IL28B9860的SNaPshotPCR引物5 - AAAAAAAAAAAAAATGCGGAGTGCAATTCAACCCTGGTTC-3 ， 针对ITPA0101的SNaPshotPCR引物5 - AAAAAAAAAAAAGA。
5、TCGATCGAGAAATCCAACCATCTTTTAAAAA-3 ， 针对ITPA7354的SNaPshotPCR引 物5 -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTTTCTGTGCCACCAAAGTGCATG-3 。 2.根据权利要求1所述的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物， 其特征在于： 所述 PCR扩增引物中IL28B9917、 IL28B9860和ITPA的引物浓度比为1:1:1， 所述SNaPshotPCR引 物中IL28B9917、 IL28B9860、 ITPA0101和ITPA7354的引物浓度比为1:1:1:1。 3.一种同时检测。
6、IL28B和ITPA基因多态性的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板， 采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR 扩增， 并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板， 采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物 进行SNaPshotPCR扩增， 并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测， 对检测结果进行分析， 确定SNP位点及其基因型。 4.根据权利要求3所述的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的方法， 其特征在于： 所述 步骤S1中的DNA样品为EDTA。
7、抗凝外周血的DNA样品。 5.根据权利要求3所述的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的方法， 其特征在于： 所述 步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括： 阶段1： 983min； 阶段2： 9810s； 阶段3： 58 30s； 阶段4： 721min； 阶段5： 返回到阶段2， 29个循环； 阶段6： 725min； 阶段7： 25保 温。 6.根据权利要求3所述的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的方法， 其特征在于： 所述 步骤S3中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括： 阶段1： 9610s； 阶段2： 555s； 阶段3： 60 30s； 阶段4： 返回到阶段1， 25。
8、个循环； 阶段5： 4保温。 7.根据权利要求3所述的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的方法， 其特征在于： 所述 步骤S4中采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。 8.根据权利要求1所述的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物在制备检测IL28B和 ITPA基因多态性试剂中的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506100 A 2 一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物及其方法 技术领域 0001 本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性 的引物及其方法。 背景技术 0002 丙型病毒性肝炎， 简。
9、称为丙型肝炎， 是一种由丙型肝炎病毒 （HepatitisCvirus, HCV） 感染引起的病毒性肝炎， 主要通过血液传播。 由于大部分感染丙肝病毒的患者在感染 的急性期无明显症状， 因此常常被人们忽视， 一般待丙型肝炎转化为慢性丙型肝炎或肝硬 化等顽固疾病时才有所察觉， 这样往往会错过丙型肝炎的最佳治疗期。 据世界卫生组织统 计， 全球约有1.4-1.7亿HCV感染者， 我国HCV感染率约为3.2%， 约有3800万HCV感染者， 而且 每年呈上升的趋势， 严重危害人类的健康。 0003 2009年， 杜克大学的Ge等在 自然 上发表了一篇与HCV感染相关的全基因组相关 性 （genome。
10、wideassociationstudy,GWAS） 研究论著， 报道了IL28B基因位于第19号染色体 短臂 （19q13） ， 其编码干扰素 3 （IL28B） 上游约3kb附近的单核苷酸多态性rs12979860与聚 已二醇干扰素、 利巴韦林联合治疗的效果显著相关。 在1型HCV感染者中， C/C基因型患者的 SVR是C/T和T/T型患者的两倍。 C/C基因型在人群中的分布呈现明显的种族差异， 在黄色人 种中占90%、 在白色人种中占51%、 在黑色人种中占13%。 rs8099917与标准疗法的NVR最为相 关。 在1型HCV感染者中， G/G基因型患者对标准治疗方案的失败率是G/T或。
11、T/T型患者的2倍。 杜克大学的同一研究组在发现IL28B基因型具有预测抗病毒治疗应答的基础上， 通过 GWAS研究发现， 肌苷腺苷三磷酸酶 （in0sineadenosinetriphatase,ITPA） 基因变异可缓解 RBV引起的溶血性贫血， 如rs1127354AA和rs7270101CC基因型均为贫血的保护性因子。 因 此， 通过检测IL28B和ITPA基因多态性有利于预测HCV患者的疗效。 0004 中国专利申请201510007333.1公开了基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测 试剂盒， 所述试剂盒包括IL28Brs8099917型PCR反应液、 IL28Brs129。
12、79860型PCR反应液， 其通过提取DNA， 加入到基于实时荧光PCR的IL28BSNP检测试剂盒的反应液中， 利用实时荧 光PCR仪进行检测， 通过荧光扩增曲线来判读位点突变类型。 0005 中国专利申请201210353290 .9公开了检测IL28B( rs8099917 )和ITPA (rs1127354)的突变的方法， 其多态性检测用探针包含P1或P1 的寡核苷酸、 P2或P2 的寡核 苷酸以及P3或P3 的寡核苷酸， 其是通过将探针进行PCR扩增后进行Tm分析， 对IL28B基因 多态性的rs8099917和ITPA基因多态性的rs1127354进行分型。 0006 虽然目前的检。
13、测方法可以对IL28B和ITPA进行分型， 但是上述方法存在检测结果 误差较大， 重复性较低， 而且结果判断较复杂的缺陷。 因此， 研究和开发出一种操作简单， 检 测结果误差小， 结果重复性高的IL28B基因和ITPA基因的检测方法仍是目前研究的热点。 发明内容 0007 为了解决现有技术中存在的缺陷， 本发明提供一种同时检测IL28B和ITPA基因多 说明书 1/7 页 3 CN 105506100 A 3 态性的引物及其方法， 该引物主要用于检测IL28B_rs8099917、 IL28B_rs12979860、 ITPA_ rs7270101、 和ITPA_rs1127354四个位点， 。
14、具有特异性好、 灵敏度高、 准确性好等优点， 为 IL28B和ITPA基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。 0008 本发明提供了一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物， 包括PCR扩增引物和 SNaPshotPCR引物 ； 所述PCR扩增引物包括 ： 针对IL28B9917的上游引物5 - A G T A A G T C T T G T A T T T C A C C T C C T G - 3 （ S E Q I D N O .1 ） 和 下 游 引 物 5 - AAAGCCAGCTACCAAACTGTAT-3（SEQIDNO .2） ， 针对IL28B9860的上游引物5 。
15、- GTCGTGCCTGTCGTGTACT-3（SEQIDNO.3） 和下游引物5 -TCAGGGTCAATCACAGAAGGG-3（SEQ IDNO.4） ， 针对ITPA的上游引物5 -GGAGATGGGCAGCAGAGTTA-3（SEQIDNO.5） 和下游引物 5 -CAGGTCACAGGAAGACAGAGA-3（SEQIDNO.6） ； 所述SNaPshotPCR引物包括： 针对 IL28B9917的SNaPshotPCR引物5 -CATGGTTCCAATTTGGGTGA-3（SEQIDNO.7） ， 针对 IL28B9860的SNaPshotPCR引物5 -AAAAAAAAAAAA。
16、AATGCGGAGTGCAATTCAACCCTGGTTC-3 （ S E Q I D N O . 8 ），针 对 I T P A 0 1 0 1 的 S N a P s h o t P C R 引 物 5 - AAAAAAAAAAAAGATCGATCGAGAAATCCAACCATCTTTTAAAAA-3（SEQIDNO.9） ， 针对ITPA7354的 SNaPshotPCR引物5 -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTTTCTGTGCCACCAAAGTGCAT G-3（SEQIDNO.10） 。 0009 进一步地， 所述PCR扩增引物中IL28B9917。
17、、 IL28B9860和ITPA的引物浓度比为1:1: 1， 所述SNaPshotPCR引物中IL28B9917、 IL28B9860、 ITPA0101和ITPA7354的引物浓度比为 1:1:1:1。 0010 另外， 本发明提供了一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的方法， 包括如下步 骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板， 采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR 扩增， 并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板， 采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物 进行SNaPshotPCR扩增， 并对SNaPsho。
18、tPCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测， 对检测结果进行分析， 确定SNP位点及其基因型。 0011 进一步地， 所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。 0012 进一步地， 所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括： 阶段1： 983min； 阶段2： 9810s； 阶段3： 5830s； 阶段4： 721min； 阶段5： 返回到阶段2， 29个循环； 阶段6： 72 5min； 阶段7： 25保温。 0013 进一步地， 所述步骤S3中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括： 阶段1： 9610s； 阶 段2： 555s； 阶段3： 6030。
19、s； 阶段4： 返回到阶段1， 25个循环； 阶段5： 4保温。 0014 进一步地， 所述步骤S4中采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。 0015 除此之外， 本发明提供的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物在制备检测 IL28B和ITPA基因多态性试剂中的用途。 0016 与现有技术相比， 本发明提供的技术方案具有以下优势： 本发明提供的同时检测 IL28B和ITPA基因多态性的引物具有特异性好， 不会发生交叉反应， 准确性高的优点， 实现 了同时检测IL28B和ITPA基因多态性的检测， 可用于指导利巴韦林的用量调整， 以提高抗病 说明书 2/7 页 4 。
20、CN 105506100 A 4 毒治疗的反应， 同时也可以为临床预测丙型肝炎抗病毒个体化治疗效果提供依据， 具有重 大的社会意义。 附图说明 0017 图1为本发明提供的IL28B9917基因引物的扩增片段； 图2为本发明提供的IL28B9860基因引物的扩增片段； 图3为本发明提供的ITPA基因引物的扩增片段； 图4为本发明提供的IL28B和ITPA基因SNaPshotPCR引物的检测结果图。 具体实施方式 0018 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。 0019 实施例一、 引物 本发明提供的IL28B和ITPA基因引物如表1所示， 包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引。
21、 物， 所述PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。 本发明提供的所有引物序列均通过 UCSC数据库比对， 无已知SNP位点。 0020 表1本发明提供的引物 实施例二、 引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting， 结果如下： 1)IL28B和ITPA基因特异引物于UCSC中进行Blast， 所有引物的扩增片段均覆盖了相应 的检测位点， 无其它同源基因， IL28B9917扩增片段位于chr19:39743077+39743211， 长度为 135bp， 扩增序列图如图1； IL28B9860扩增片段位于chr19:39738744+39738889， 长。
22、度为 146bp， 扩增序列图如图2； ITPA扩增片段位于chr20:3193710+3193935， 长度为226bp， 扩增 序列图如图3。 说明书 3/7 页 5 CN 105506100 A 5 0021 2） 使用表1中SNaPshotPCR引物， SNaPshot法进行检测， 结果如图4所示， 各产物峰 的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符。 0022 实施例三、 IL28B和ITPA基因多态性的检测 1） 提取EDTA抗凝外周血的DNA样品， 提取方法参照TIANampBloodDNAKit （购自 Tiagen， 货号DP318） 的说明书， 将DNA样品稀释至100ng。
23、/ L， 备用。 0023 2） 配制引物混合物： 将PCR扩增引物中IL28B9917、 IL28B9860和ITPA的引物浓度比 为1:1:1混合， 震荡混匀； 短暂离心后备用； PCR扩增采用Q5热启动超保真2XMasterMix （购自NEB公司， 货号M0494L） ， 反应体系如表2所示， 震荡混匀， 短暂离心后， 分装18.0 L至标 记好的PCR反应管； 往标记好的PCR反应管加入引物混合物5.0 L， 按照以下程序进行PCR扩 增： 阶段1： 983min； 阶段2： 9810s； 阶段3： 5830s； 阶段4： 721min； 阶段5： 返回到 阶段2， 2:9个循环； 。
24、阶段6： 725min； 阶段7： 25保温。 0024 表2、 PCR试剂配制表格 3） 按SNaPshotPCR引物中IL28B9917、 IL28B9860、 ITPA0101和ITPA7354的引物浓度比 为1:1:1:1混合， SNaPshotPCR产物中加入1.0 LSAP酶， 按照以下程序进行反应： 37， 15min； 80， 15min； 4， 保温。 反应完毕后， 毛细管电泳技术进行检测， 对检测结果采用 GENEMAPPERIDV4.1软件进行分析， 确定SNP位点及其基因型， 结果如图4所示。 0025 实施例四、 检测IL28B和ITPA基因多态性的方法的特异性 本发。
25、明的检测特异性定义为阴性符合率。 本发明共对21例样本进行优化SNaPshot测序 法检测， 检测结果采用ARMS-PCR法进行验证。 SNaPshot测序法检测出的阴性结果与ARMS- PCR法显示的结果相符， 无突变的样本(阴性)共7例， 如表3所示。 本发明的检测特异性为 100%。 0026 表3、 IL28B和ITPA基因检测特异性的试验数据 说明书 4/7 页 6 CN 105506100 A 6 实施例五、 检测IL28B和ITPA基因多态性的方法的灵敏度 本发明的检测灵敏度定义为阳性符合率。 本发明共对21例样本进行优化SNaPshot测序 法检测， 检测结果采用ARMS-PC。
26、R法进行验证。 SNaPshot测序法检测出的阳性结果与ARMS- PCR法显示的结果相符， 突变的样本(阳性)共14例， 如表4所示。 本发明的检测灵敏度为 100%。 0027 表4、 IL28B和ITPA基因检测灵敏度的试验数据 说明书 5/7 页 7 CN 105506100 A 7 实施例六、 检测IL28B和ITPA基因多态性的方法的准确度 本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。 本发明共对21例样本进行SNaPshot 测序法检测， 检测结果均采用ARMS-PCR法进行验证。 不同方法检测结果一致， 如表5所示。 本 发明的准确度为100%。 0028 表5、 IL28B和。
27、ITPA基因2SNPs位点检测准确度的试验数据 说明书 6/7 页 8 CN 105506100 A 8 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱 离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护 范围。 说明书 7/7 页 9 CN 105506100 A 9 SEQUENCELISTING 广州金域检测科技股份有限公司 一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物及其方法 10 10 PatentInversion3.3 1 25 D。
28、NA 人工序列 1 agtaagtcttgtatttcacctcctg25 2 22 DNA 人工序列 2 aaagccagctaccaaactgtat22 3 19 DNA 人工序列 3 gtcgtgcctgtcgtgtact19 4 21 DNA 人工序列 4 tcagggtcaatcacagaaggg21 5 20 DNA 人工序列 5 序列表 1/2 页 10 CN 105506100 A 10 ggagatgggcagcagagtta20 6 21 DNA 人工序列 6 caggtcacaggaagacagaga21 7 20 DNA 人工序列 7 catggttccaatttggg。
29、tga20 8 40 DNA 人工序列 8 aaaaaaaaaaaaaatgcggagtgcaattcaaccctggttc40 9 45 DNA 人工序列 9 aaaaaaaaaaaagatcgatcgagaaatccaaccatcttttaaaaa45 10 58 DNA 人工序列 10 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatattttctgtgccaccaaagtgcatg58 序列表 2/2 页 11 CN 105506100 A 11 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 12 CN 105506100 A 12 图4 说明书附图 2/2 页 13 CN 105506100 A 13 。