促进木质纤维素酶催化水解的方法.pdf

《促进木质纤维素酶催化水解的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《促进木质纤维素酶催化水解的方法.pdf（9页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610090238.7 (22)申请日 2016.02.17 C12P 19/14(2006.01) C12P 19/04(2006.01) (71)申请人 清华大学 地址 100084 北京市海淀区 100084-82 信箱 申请人 东莞深圳清华大学研究院创新中心 (72)发明人 赵雪冰 陈可 刘德华 (74)专利代理机构 北京清亦华知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 11201 代理人 李志东 (54) 发明名称 促进木质纤维素酶催化水解的方法 (57) 摘要 本发明公开了促进木质纤维素酶催化水解的 方法， 该方法包括以下步。

2、骤 ： (1) 将所述木质纤维 素与 pH 调节溶液混合， 以便获得第一液固混合 物， 其中所述木质纤维素预先经过预处理， 所述 pH调节溶液的pH值为4.0-10.0 ； (2)向所述第一 液固混合物中添加金属盐溶液， 并反应预定时间， 以便获得第二液固混合物 ； (3) 从所述第二液固 混合物中分离得到固体 ； (4) 利用纤维素酶使所 述固体进行酶催化水解。利用该方法能够有效降 低木质素对纤维素酶无效吸附， 促进木质纤维素 酶催化水解， 提高纤维素的糖化效率， 并且该方法 成本低廉， 易于推广使用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。

3、要求书1页 说明书7页 CN 105524959 A 2016.04.27 CN 105524959 A 1.一种促进木质纤维素酶催化水解的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)将所述木质纤维素与pH调节溶液混合， 以便获得第一液固混合物， 其中所述木质纤 维素预先经过预处理， 所述pH调节溶液的pH值为4.0-10.0； (2)向所述第一液固混合物中添加金属盐溶液， 并反应预定时间， 以便获得第二液固混 合物； (3)从所述第二液固混合物中分离得到固体； (4)利用纤维素酶使所述固体进行酶催化水解。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(1)中， 所述预处理为稀酸预处理。

4、、 蒸汽爆破预处理、 碱处理或有机溶剂预处理。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(1)中， 所述pH调节溶液的pH值为 4.5-7.0， 任选地， 所述pH调节溶液为硫酸溶液或盐酸溶液， 任选地， 所述木质纤维素与所述pH调节溶液的质量体积比为1:5-1:30。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 所述金属盐溶液中的金属离 子为三价和/或二价金属离子， 任选地， 所述金属离子为选自铝离子、 铁离子、 亚铁离子、 锰离子、 钴离子、 铜离子、 钙离 子、 镁离子、 镍离子和钡离子的至少一种， 优选地， 所述金属离子为选自钙离子、 镁离子、 钴离子和。

5、镍离子的至少一种。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 向所述第一液固混合物中添 加金属盐溶液， 并于20-80下反应0.1-3小时， 任选地， 在步骤(2)中， 所述金属盐溶液的添加量为使所述第二液固混合物中液相金属 盐浓度为0.01-1g/L， 优选0.1g/L。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(3)中， 通过过滤或离心从所述第二 液固混合物中分离得到固体。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(4)中， 于pH4.5-5.5的条件下进行 所述酶催化水解， 任选地， 利用无机酸溶液调节步骤(4)中的酶催化水解体系的pH值至4。

6、.5-5.5， 优选地， 所述无机酸溶液为硫酸溶液或盐酸溶液。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(4)中， 所述纤维素酶的使用量为5- 40FPU/g固体， 优选5-15FPU/g固体。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(4)中， 在梯度升温条件下进行所述 酶催化水解， 任选地， 所述梯度升温为阶梯式升温， 优选地， 所述阶梯式升温为温度每升高5后保温2小时， 直至温度升至50后保持温 度不变。 10.根据权利要求1的方法， 其特征在于， 进一步包括： 向步骤(4)中的酶催化水解体系中补充添加所述金属盐溶液。 权利要求书 1/1 页 2 CN 10552。

7、4959 A 2 促进木质纤维素酶催化水解的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物质化工领域， 特别涉及促进木质纤维素酶催化水解的方法。 背景技术 0002 木质纤维素是自然界含量最丰富的生物质之一， 世界上每年有超过4000万吨木质 纤维素原料产生， 占全球生物质总量的50， 包括农林业废弃物、 废纸、 能源作物等， 其中大 部分未加利用而丢弃。 木质纤维素组成中碳水化合物含量高达75， 可作为可发酵糖的重 要来源用于生产液体燃料和其它化学品。 近年来随着化石能源的不断消耗和环境问题的日 益突出， 生物质转化生产能源和化学品的开发受到了全球各界的广泛关注。 0003 木质纤维素的主要化学组。

8、成包括纤维素(3555wt.)、 半纤维素(2035wt.)和 木质素(530wt.)。 三种主要组分的相对含量随原料的不同而不同。 纤维素是由D-吡喃型 葡萄糖通过 -1,4-糖苷键连接形成的具有结晶结构的多糖聚合物， 含有300-15000个葡萄 糖基。 半纤维素是由不同单糖(木糖、 阿伯糖、 甘露糖和半乳糖等)构成的异质多糖， 半纤维 素支链较多， 分子链中含有游离氢键， 具有亲水性能， 且不存在结晶结构。 木质素是由苯丙 烷单元通过碳碳键、 醚键连接形成的一类复杂的芳香族高分子聚合物。 木质纤维素主要存 在于植物细胞壁中， 是一种在微、 纳米尺度上具有复杂结构的物质。 纤维素首先构成微。

9、细纤 维素， 构筑了细胞壁的骨架结构， 半纤维素和木质素作为 “填充剂” 包裹在纤维素外。 因此， 木质纤维素往往需要预处理来破坏这种结构以提高纤维素的酶催化水解特性。 但预处理后 的木质纤维素基质中仍然存在木质素， 而木质素对纤维素酶的无效吸附会导致纤维素酶解 效率降低。 为降低纤维素在纤维素酶上的无效吸附， 人们发现在酶解过程中添加表面活性 剂能够提高提高木质纤维素酶解的转化率， 降低木质素对酶的无效吸附， 从而降低纤维素 酶的用量。 已有的研究表明， 对酶解促进作用最显著的是非离子型表面活性剂， 而大部分离 子型表面活性剂对酶解没有促进作用。 常用的促进预处理后木质纤维素酶解的非离子型表。

10、 面活性剂为PEG和Tween系列， 但这些非离子型表面活性剂往往价格昂贵， 且对于后续发酵 生产过程中的微生物具有抑制作用。 0004 因此， 有必要寻找降低木质素对纤维素酶无效吸附的廉价方法。 发明内容 0005 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明的一个目的 在于提出一种成本低廉， 能够有效降低木质素对纤维素酶无效吸附， 促进木质纤维素酶催 化水解， 提高纤维素的糖化效率的方法。 0006 根据本发明的一个方面， 本发明提供了一种促进木质纤维素酶催化水解的方法。 根据本发明的实施例， 该方法包括以下步骤： 0007 (1)将所述木质纤维素与pH调节溶液混合， 。

11、以便获得第一液固混合物， 其中所述木 质纤维素预先经过预处理， 所述pH调节溶液的pH值为4.0-10.0； 0008 (2)向所述第一液固混合物中添加金属盐溶液， 并反应预定时间， 以便获得第二液 说明书 1/7 页 3 CN 105524959 A 3 固混合物； 0009 (3)从所述第二液固混合物中分离得到固体； 0010 (4)利用纤维素酶使所述固体进行酶催化水解。 0011 发明人惊奇地发现， 利用该方法能够有效降低木质素对纤维素酶无效吸附， 促进 木质纤维素酶催化水解， 提高纤维素的糖化效率， 并且该方法成本低廉， 易于推广使用。 0012 根据本发明的实施例， 在步骤(1)中，。

12、 所述预处理为稀酸预处理、 蒸汽爆破预处理、 碱处理或有机溶剂预处理。 0013 根据本发明的实施例， 在步骤(1)中， 所述pH调节溶液的pH值为4.5-7.0。 0014 根据本发明的实施例， 所述pH调节溶液为硫酸溶液或盐酸溶液。 0015 根据本发明的实施例， 所述木质纤维素与所述pH调节溶液的质量体积比为1:5-1: 30。 由此， 可提高后续木质纤维素的酶催化水解效率。 0016 根据本发明的实施例， 在步骤(2)中， 所述金属盐溶液中的金属离子为三价和/或 二价金属离子。 0017 根据本发明的实施例， 所述金属离子为选自铝离子、 铁离子、 亚铁离子、 锰离子、 钴 离子、 铜离。

13、子、 钙离子、 镁离子、 镍离子和钡离子的至少一种。 0018 根据本发明的实施例， 所述金属离子为选自钙离子、 镁离子、 钴离子和镍离子的至 少一种。 由此， 可提高后续木质纤维素的酶催化水解效率。 0019 根据本发明的实施例， 在步骤(2)中， 向所述第一液固混合物中添加金属盐溶液， 并于20-80下反应0.1-3小时。 由此， 可提高后续木质纤维素的酶催化水解效率。 0020 根据本发明的实施例， 在步骤(2)中， 所述金属盐溶液的添加量为使所述第二液固 混合物中液相金属盐浓度为0.01-1g/L， 优选0.1g/L。 由此， 可提高后续木质纤维素的酶催 化水解效率。 0021 根据本。

14、发明的实施例， 在步骤(3)中， 通过过滤或离心从所述第二液固混合物中分 离得到固体。 0022 根据本发明的实施例， 在步骤(4)中， 于pH4.5-5.5的条件下进行所述酶催化水 解。 由此， 可提高木质纤维素的酶催化水解效率。 0023 根据本发明的实施例， 利用无机酸溶液调节步骤(4)中的酶催化水解体系的pH值 至4.5-5.5。 由此， 可避免已吸附到木质素上的金属离子发生脱附。 0024 根据本发明的一些优选实施例， 所述无机酸溶液为硫酸溶液或盐酸溶液。 0025 根据本发明的实施例， 在步骤(4)中， 所述纤维素酶的使用量为5-40FPU/g固体， 优 选5-15FPU/g固体。。

15、 0026 根据本发明的实施例， 在步骤(4)中， 在梯度升温条件下进行所述酶催化水解。 由 此， 可避免由于温度快速变化带来的已吸附到木质素上的金属离子发生脱附。 0027 根据本发明的实施例， 所述梯度升温为阶梯式升温。 0028 根据本发明的一些优选实施例， 所述阶梯式升温为温度每升高5后保温2小时， 直至温度升至50后保持温度不变。 由此， 可减少由于温度快速变化带来的已吸附到木质 素上的金属离子发生脱附的现象。 0029 根据本发明的实施例， 进一步包括： 向步骤(4)中的酶催化水解体系中补充添加所 述金属盐溶液。 根据本发明的一些实施例， 所述金属盐溶液与步骤(2)中的金属盐溶液相。

16、 说明书 2/7 页 4 CN 105524959 A 4 同。 0030 需要说明的是， 本发明的方法是依据木质素对金属离子具有吸附作用的原理来实 现的。 预处理后的木质纤维素固体往往还残留木质素， 这部分木质素对纤维素酶具有不可 逆的无效吸附作用。 而采用相对廉价的金属离子来屏蔽木质素对纤维素酶的吸附位点可降 低纤维素酶损失。 因此， 本发明公开的方法主要用以促进预处理后仍然含有木质素的固体 的酶催化水解， 特别是常用的稀酸预处理、 蒸汽爆破预处理， 由于大部分木素仍然残留在固 体中， 因而金属离子的促进作用更为显著。 pH是影响木质素吸附金属离子的一个重要因素。 本发明提供的方法将金属离。

17、子处理与纤维素酶解过程相分离， 即在酶解前进行金属离子处 理， 因而可以根据需要调节pH值。 优选地， 金属离子处理的pH为4.0-10.0， 进一步优选为 4.5-7.0。 在微酸性或中性条件下进行处理， 可以保证木质素表面带有足够的负电荷以与金 属离子进行配位结合。 所采用的金属离子对木质素吸附位点的屏蔽具有重要影响。 虽然木 质素对重金属离子， 例如Pb2+， Gd2+等具有最强的吸附力， 但本发明提供的方法优选使用非 重金属离子， 因为重金属离子往往会造成后续酶解过程中蛋白的失活。 可选的金属离子包 括， 铝离子、 铁离子、 亚铁离子、 锰离子、 钴离子、 铜离子、 钙离子、 镁离子、。

18、 镍离子、 钡离子中 的一种或多种混合； 优选地， 所述优选的金属离子为二价金属离子； 进一步优选地， 所述金 属离子为钙离子、 镁离子、 钴离子和镍离子。 这是由于这些金属离子一方面不会造成纤维素 酶失活， 另一方面， 如这些金属离子在酶解过程中发生解吸释放到酶解液中， 其还可作为后 续微生物发酵过程中微生物生长所需的微量矿物元素。 由于不同金属离子对于木质素吸附 位点的屏蔽能力不同， 因此， 其最优的浓度也不同。 本发明提供的方法中优选金属离子浓度 为0.01-1g/L， 过高的金属离子浓度反而会抑制纤维素的酶解。 0031 进而， 根据本发明的另一些实施例， 在本发明的方法的步骤(4)中。

19、， 进行纤维素酶 催化水解时应避免使用有机酸缓冲液。 这是因为， 通常纤维素的酶解在pH4.8的醋酸或柠檬 酸缓冲液中进行， 但有机酸往往对于金属离子具有一定的螯合能力， 在缓冲液中进行酶解， 会导致已经吸附在木质素上的金属离子发生部分脱附， 从而降低或消除了金属离子对木质 素活性位点的屏蔽作用。 并且， 如前所述， 于pH4.5-5.5的条件下进行所述酶催化水解， 且 所述酶催化水解在非有机酸缓冲溶液中进行； 优选地， 所述pH4.5-5.5是通过硫酸或盐酸 调节的， 由此， 可以避免使用有机酸缓冲溶液带来的负面影响。 0032 需要说明的是， 术语 “第一” 、“第二” 仅用于描述目的， 。

20、而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。 由此， 限定有 “第一” 、“第二” 的特征可以 明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。 进一步地， 在本发明的描述中， 除非另有说 明，“多个” 的含义是两个或两个以上。 0033 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出， 部分将从下面的描述中变 得明显， 或通过本发明的实践了解到。 具体实施方式 0034 下面详细描述本发明的实施例。 下面描述的实施例是示例性的， 仅用于解释本发 明， 而不能理解为对本发明的限制。 0035 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。 本领域技术人员将会理解， 下面的 实施例仅。

21、用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条 说明书 3/7 页 5 CN 105524959 A 5 件的， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪 器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。 0036 实施例1 0037 金属离子筛选 0038 将麦秆经0.5稀硫酸在140下预处理1h后水洗至中性， 以便获得经过预处理的 麦秆(即预处理后的木质纤维素)。 将上述预处理后的麦秆与pH4.8的硫酸溶液混合得到液 固混合物， 且固体含量为5。 分别添加不同金属盐溶液至液固混合物中使得液相中金属盐 浓度为0.05-1g/。

22、L， 随后在室温下、 转速为150rpm的摇床中处理1小时后过滤除去液体， 再用 15FPU/g固体的纤维素酶用量， 初始pH4.8， 50， 150rpm的条件下进行酶解。 其中， 酶解体 系温度从室温上升到50采用梯度升温方式， 即每升高5后保温2小时， 直至温度为升至 50后保持温度不变。 对照组不添加金属盐溶液， 结果， 不同金属离子处理组与对照组相 比， 酶解转化率的增加(+)或降低(-)如表1所示。 从表1可知， 合适的金属盐浓度为0.1g/L， 对应的金属离子摩尔浓度为0.25-1.1mmol/L。 可明显促进120h后纤维素酶转化率的金属离 子有Ca2+、 Ni2+、 Fe3+。

23、、 Ba2+、 Cu2+、 Zn2+、 Mg2+， 酶解转化率提高5-13。 说明书 4/7 页 6 CN 105524959 A 6 0039 0040 实施例2 说明书 5/7 页 7 CN 105524959 A 7 0041 各种金属离子对不同酶用量时纤维素酶解的影响 0042 所用预处理麦秆原料， 金属离子处理和酶解过程温度、 pH参数同实施例1。 采用 0.1g/L金属盐浓度， 以及5-40FPU/g固体的纤维素酶用量。 对照组不添加金属离子， 120h后 纤维素的酶解转化率如表2所示。 0043 表2不同金属离子在不同纤维素酶用量下对120h后纤维素转化率的影响 0044 004。

24、5 由上表可知， 不同纤维素酶用量下金属离子对纤维素转化率均有一定的促进作 用， 而在较低的纤维素酶用量时金属离子， 特别是Mg2+表现出最为显著的促进作用。 0046 实施例3 0047 pH的影响 0048 所用预处理麦秆原料和酶解过程同实施例1。 采用0.1g/LMgCl2浓度， 改变MgCl2溶 液处理稀酸预处理后麦秆时体系的pH值， 处理后的固体采用5FPU/g固体的纤维素酶用量在 相应的pH下进行酶解。 以不添加金属离子的预处理麦秆为对照， 120h后纤维素的酶解转化 率如表3所示。 0049 表3pH对MgCl2处理稀酸预处理麦秆酶解的影响 0050 0051 由上表可知， pH。

25、对Mg2+的促进作用具有显著影响， 较低或较高的pH下处理时金属离 子的促进作用变得不显著， 最优的pH在5.0附近。 0052 实施例4 0053 酶解过程梯度升温的影响 0054 所用预处理麦秆原料同实施例1。 采用0.1g/LMgCl2溶液在pH4.8条件下对经过预 说明书 6/7 页 8 CN 105524959 A 8 处理的麦秆进行处理， 之后采用10FPU/g固体的纤维素酶用量进行酶解。 酶解体系温度从室 温升至50采用两种方案。 方案一： 为非梯度升温， 即温度从室温迅速(5min内)升高至50 。 方案二： 为梯度升温， 温度每升高5后保温2小时， 直至温度为升至50后保持温。

26、度不 变， 即在温度30， 35， 40， 45温度下分别保温2h， 温度升至50的总升温时间(含每 段2h保温时间)为8-8.5h。 结果， 方案一的120h酶解纤维素转化率为75.11.5， 方案二的 酶解转化率为78.20.7。 由此， 表明方案二效果更好。 0055 实施例5 0056 不同预处理原料比较 0057 所述金属离子处理和酶解过程如实施例4的方案二。 金属离子处理不同预处理后 原料的酶解纤维素转化率如表4所示。 0058 其中， 稀酸预处理为0.5稀硫酸溶液在10:1的液固比(L/kg)、 160下处理 30min； 碱处理为采用1氢氧化钠溶液在10:1的液固比(L/kg)。

27、、 160下处理30min； 蒸汽爆 破预处理为将含水量50的原料用蒸汽加热至200后保温5min， 然后突然将压力泄至常 压； 有机溶剂为采用50乙醇在10:1的液固比(L/kg)、 添加0.1硫酸， 160下处理30min。 0059 表40.1g/LMgCl2处理不同预处理原料的酶解纤维素转化率比较 0060 0061 由上表可知， MgCl2对不同预处理后的样品均有促进作用， 但对于稀酸预处理和蒸 汽爆破预处理后样品的促进效果更为明显。 0062 在本说明书的描述中， 参考术语 “一个实施例” 、“一些实施例” 、“示例” 、“具体示 例” 、 或 “一些示例” 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结构、 材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 0063 尽管已经示出和描述了本发明的实施例， 本领域的普通技术人员可以理解： 在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换和变型， 本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。 说明书 7/7 页 9 CN 105524959 A 9 。