一株防治棕榈害虫椰子织蛾的绿僵菌及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510900251.X (22)申请日 2015.12.09 CCTCC NO ： M 2015672 2015.11.09 C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 中国热带农业科学院椰子研究所 地址 570000 海南省文昌市文清大道 496 号 (72)发明人 孙晓东 阎伟 覃伟权 吕朝军 李朝绪 (74)专利代理机构 海口翔翔专利事务有限公司 46001 代理人 莫臻 (54) 发明名称 一株防治。

2、棕榈害虫椰子织蛾的绿僵菌及应用 (57) 摘要 本发明涉及一株防治棕榈害虫椰子织蛾 的绿僵菌及应用， 该菌株命名为金龟子绿僵菌 (Metarhizum anisopliae)LSY-1， 已于2015年11 月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏编号 ： CCTCC M 2015672。本发明所提供的金 龟子绿僵菌 (Metarhizum anisopliae)LSY-1 的 用途是其在防治椰子织蛾中的应用， 通过直接涂 抹给药的试验， 表明金龟子绿僵菌 (Metarhizum anisopliae)LSY-1 对椰子织蛾有很好的杀虫作 用， 可以有效地控制椰子织蛾种群数量，。

3、 是一株在 防治椰子织蛾上具有潜在意义的生防菌株， 为我 国棕榈产业的发展提供帮助。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105543102 A 2016.05.04 CN 105543102 A 1.一株绿僵菌菌株， 命名为金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1， 已于2015 年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号： CCTCCM2015672。 2.权利要求1所述的金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1在防。

4、治椰子织蛾中 的应用。 3.一种防治椰子织蛾的生物制剂， 其活性成分为权利要求1所述的保藏编号为CCTCCM 2015672的金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543102 A 2 一株防治棕榈害虫椰子织蛾的绿僵菌及应用 技术领域 0001 本发明属微生物领域， 涉及一种绿僵菌及其应用， 具体的说， 涉及一株防治棕榈害 虫椰子织蛾的绿僵菌及应用。 背景技术 0002 椰子织蛾OpisinaarenosellaWalker(又称椰子木蛾、 黑头履带虫、 椰柱蛾、 食叶 履带虫)， 属鳞翅目(Lepidoptera)织蛾科。

5、(Qecophoridae)， 英文名coconutblackheaded caterpillar， 主要分布于印度、 泰国、 印度尼西亚、 马来西亚、 斯里兰卡、 孟加拉、 缅甸、 巴基 斯坦等地， 是一种严重危害椰子、 槟榔、 蒲葵、 中东海枣、 大王棕等棕榈作物的外来入侵害 虫， 2014年3月被列为全国林业危险性有害生物。 椰子织蛾幼虫取食叶片， 严重时整个树冠 被入侵啃食从而导致植株发育缓慢、 果实产量大幅减少甚至绝产， 严重影响作物的品质和 产量。 近年来棕榈作物作为经济作物和园林景观植物在我国的南方大面积的种植与从国外 大量的引入， 导致椰子织蛾在我国爆发的威胁越来越大， 目前海。

6、南、 广西、 广东三省已有大 面积危害的报道。 目前针对椰子织蛾的防治除了利用寄生蜂防控外， 主要还是以化学防治 为主， 化学防治虽然在一定程度上可以快速的防治该虫， 但是化学防治引起的残留、 抗性与 再增猖獗等问题严重影响到自然环境与人类的健康； 虽然利用寄生蜂防控椰子织蛾在印 度、 斯里兰卡等地取得了一定的防治效果， 但是国内的优质寄生蜂品种引进与大面积饲养、 释放等技术仍然没有有效开展， 因此如何结合国内现有研究基础寻找一种更加科学有效的 控制椰子织蛾危害的生物防治手段显得尤为重要。 0003 金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)寄主范围广泛， 能寄生直翅目、 膜翅目。

7、、 同翅目、 双翅目、 鳞翅目、 鞘翅目以及半翅目等7个目、 42个科、 约200余种昆虫、 线虫及螨类。 金龟子绿僵菌是在生物防治上使用最为广泛的昆虫病原真菌之一， 在森林、 农作物以及公 共卫生害虫中都用金龟子绿僵菌进行了效果的评估。 利用金龟子绿僵菌生防制剂来防控 蛴螬、 蝗虫、 叶蝉等一些害虫， DAmerasan等人在的一些研究还发现， 金龟子绿僵菌对疟疾的 主要传播昆虫伊蚊有着十分明显的防控效果。 金龟子绿僵菌作为生防真菌中最重要的一 种， 它在使用上有着寄生物种多、 适应性强、 致病周期短、 靶标性强、 对人类和牲畜不会造成 毒害， 以及环境友好型的特点。 经检索， 目前利用绿僵。

8、菌控制椰子织蛾尚未见到相关报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一株防治棕榈害虫椰子织蛾的绿僵菌及应用。 0005 一株绿僵菌菌株， 命名为金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1， 已于 2015年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 地址： 湖北省武汉市武昌区八一 路珞珈山； 保藏编号： CCTCCM2015672。 0006 本发明所提供的金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1菌株， 分离于自然 感染的椰子织蛾僵虫， 经形态学、 培养性状、 常规生理生化和DNA序列鉴定， 该菌株为金龟子 绿僵菌小孢变种， 是。

9、绿僵菌属真菌的一个新菌株， 命名为金龟子绿僵菌(Metarhizum 说明书 1/5 页 3 CN 105543102 A 3 anisopliae)LSY-1。 0007 本发明所提供的金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1的基本生物学特 性为： 0008 菌株在平板PDA培养基上划线培养后菌丝体呈透明状并且有隔膜； 在PDA培养基上 初期为白色或淡黄色向黄色过度， 形状为絮状或绒毛状突起， 后期出现绿色为基础色调的 相邻色谱的颜色； 分生孢子梗呈瓶颈状， 有分叉， 单生或多生交叉生长， 相互缠绕成围栏状。 分生孢子每个大小为4.28.3 m1.92.8 m， 长。

10、椭圆形， 棒状， 两端圆滑脱落的孢子多数 聚集成团块状。 0009 本发明所提供的金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1的用途是其在防 治椰子织蛾中的应用。 0010 以本发明所提供的金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1为活性成分的 生物制剂也属本发明的保护范围。 需要的时候， 该制剂可以包含生物制剂制备的常用载体 和辅料。 0011 本发明通过直接涂抹给药的方法研究金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae) LSY-1对椰子织蛾的杀虫活性， 实验结果表明金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY- 1。

11、对椰子织蛾有很好的杀虫作用。 表明该菌株是一株在防治椰子织蛾上具有潜在意义的生 防菌株。 0012 本发明通过对自然感染的椰子织蛾僵虫中微生物的筛选分离， 获得金龟子绿僵菌 (Metarhizumanisopliae)LSY-1， 经过杀虫试验表明该菌株对椰子织蛾有很好的杀虫作 用， 可以有效地控制椰子织蛾种群数量， 减少损失， 是一株在防治椰子织蛾上具有潜在意义 的生防菌株， 具有杀虫毒力强、 杀虫效果好等特点， 为我国棕榈科产业的发展提供帮助。 附图说明 0013 图1： 金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1的菌株孢子与菌丝形态。 0014 图2： 金龟子绿僵。

12、菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1菌株侵染椰子织蛾幼虫照片。 A： CK； B： LSY-1侵染椰子织蛾第2d； C： LSY-1侵染椰子织蛾第4d； D： LSY-1侵染椰子织蛾第6d。 具体实施方式 0015 下面结合实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。 以下实施例用于 说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常 按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0016 实施例一菌株的筛选及其鉴定 0017 1、 菌株的筛选 0018 取采集好的椰子织蛾僵虫样品， 先用70酒精消毒一分钟， 无菌水清洗后再用 0.。

13、1的氯化汞对感病样品进行表面消毒30s， 无菌水清洗3次， 挑取少许僵虫组织接种于选 择性SDAY培养基(4葡萄糖、 1蛋白胨、 1酵母粉、 2琼脂、 100 g/ml链霉素、 100 g/ml 青霉素、 多菌灵0.8 g/ml)， 倒置于281恒温倒置培养3-4d， 选取单孢子接种于PDA培养 基(去皮马铃薯200g切小块加水至1L煮沸20分钟后双层纱布过滤， 滤液中加葡萄糖20g、 琼 脂20g再加热使之溶化， 加水补足体积至1L)纯化， 每皿3点， 呈三角形排列， 经单孢子纯化 说明书 2/5 页 4 CN 105543102 A 4 后获得具有杀虫作用的菌株， 命名为金龟子绿僵菌(Me。

14、tarhizumanisopliae)LSY-1， 已于 2015年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 地址： 湖北省武汉市武昌区八一 路珞珈山； 保藏编号： CCTCCM2015672。 0019 2、 菌株形态鉴定 0020 将分离纯化得到的菌株在直径为90mm的平板PDA培养基上划线培养， 放入29培 养箱中培养4-5d后， 挑取幼嫩的白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗的 形态； 10-12d后挑取成熟的分生孢子制片并再次对比观察孢子的大小与形状； 14d左右观察 记录菌落的外观形态特征。 菌株在PDA培养基上产生孢子以前为白色或淡黄色向黄色过度， 形状。

15、为絮状或绒毛状突起， 随着时间的推移开始出现绿色为基础色调的相邻色谱的颜色。 菌丝体呈透明状并且有隔膜。 在感染死亡的僵虫身上一般初期成白色绒毛覆盖， 慢慢被深 绿色的孢子所替代； 分生孢子梗呈瓶颈状， 有分叉， 单生或多生交叉生长， 相互缠绕成围栏 状， 紧密的大量聚集成分生孢子座。 分生孢子每个大小为4.28.3 m1.92.8 m长椭圆 形， 棒状， 两端圆滑脱落的孢子多数聚集成团块状。 0021 3、 菌株的ITS序列扩增、 序列测定及分子分类 0022 分别在26、 230rpm/min条件下恒温摇床培养72h， 用纱布抽滤收集菌丝， 使用65 水浴锅预热2CTAB抽提缓冲液。 刮取。

16、少量绿僵菌菌丝(约1g)置于研钵中， 用液氮磨至白 色粉末； 在研磨好的粉末中， 加入700ul的预热好的2CTAB抽提缓冲液， 缓慢搅动； 将混合 液转移到2ml的灭菌离心管中， 注意混合液的体积不要超过离心管的三分之二； 放置于60 的水浴摇床中， 100rpm/min摇动1h后取出备用； 取出后常温冷却2min后， 向离心管内加入氯 仿-异戊醇(24： 1)约0.5ml， 缓慢摇匀使两者混合均匀； 用移液枪吸取上清夜， 转入含有600 l异丙醇的灭菌离心管内， 将离心管缓慢摇动30sec， 不可剧烈晃动， 防治损坏DNA使水层与 异丙醇充分混合， 直至能够见到DNA絮状物悬浮物； 继续1。

17、0000rpm离心1min后， 缓慢吸出清 液体倒掉保留沉淀， 注意白色沉淀为DNA切勿倒出， 将离心管倒立放置于铺开的纸巾上吸取 剩余液体； 1min后， 直立离心管， 加入80 l5M的醋酸钠及加入720 l的70的乙醇， 轻轻晃 动， 用手指弹管底， 使管底与沉淀的DNA悬浮物漂浮于液体中； 放置30min， 使DNA悬浮物的不 纯物逐渐溶解； 再次12000rpm离心5min后， 倒掉上清液， 再加入70的乙醇， 将沉淀物再洗 30min； 12000rpm离心5min后， 立即倒掉上清液， 自然干燥DNA沉淀(超净台吹风)； 将DNA沉淀 溶解于300 l无菌水中， 加入RNA酶(终。

18、浓度50 g/ml)处理溶液， 使DNA充分溶解， -20保存 备用。 0023 采 用 真 菌 核 糖 体 基 因 转 录 间 隔 区 ( I T S ) 通 用 引 物 I T S 4 ( 5 - TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 )ITS5(5 -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 )扩增致病菌的ITS1- 5.8s-ITS2rDNA区段， 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR仪： takara公司。 PCR反 应体系(50 L)： 50ngDNA模板， 10PCRbuffer5 L， 10pmol/L引物ITS4和ITS5各1 L， 10mmol/。

19、LdNTPs1 L， 4U/ LTaqDNA聚合酶1 L， 加ddH2O补足至50 L。 PCR反应条件： 94 5min， 1个循环； 941min， 521min， 721min， 29个循环； 72延伸10min， 1个循环； PCR产 物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。 采用VectorNTI11软件的AlignX进行 rDNA-ITS同源性分析， 并构建系统发育树发育树。 分子生物学鉴定结果显示该菌株的ITS序 列与金龟子绿僵菌属的相似性最高， 为99。 0024 4、 菌株产孢特性 说明书 3/5 页 5 CN 105543102 A 5 0025 将浓度为1108cf。

20、u/ml的LSY-1孢子悬浮液接种在SDAY平板培养基上(100 l/ 皿)， 在不同温度20、 22、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 35的培养条件下培 养15天后测定单位面积上的产孢量， 确定LSY-1菌株在26条件下产孢子量为最佳。 0026 实施例二菌株对椰子织蛾室内杀虫活性测定 0027 取分离纯化培养好的金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1菌株， 将分生 孢子粉装入50ml无菌离心管中， 加入10mL0.1吐温80无菌水后， 用涡旋振荡器振荡15min 混匀， 然后用血球计数板测定每毫升悬浮液中孢子个数， 通过适当调整， 将菌。

21、株配置成孢 子浓度为1.0108个/mL， 保存于10冰箱中保存备用。 将金龟子绿僵菌(Metarhizum anisopliae)LSY-1菌株的孢子以梯度稀释的方法配成5个浓度的水剂， 浓度分别是1.0 108、 5107、 2.5107、 1.25107、 6.25106个/ml。 把新鲜的老叶片截成8cm左右的叶片段， 再把叶片段放入10ml孢子悬浮液中充分涂抹浸润， 装入灭菌后的试管中待用， 每处理接种 试虫30头， 3次重复， 置于26、 相对湿度80人工气候箱中饲养。 处理后每1d观察1次， 记录 死亡虫数， 直至处理后第7d， 并对死虫进行保湿培养， 根据虫尸体表面长出的特征菌。

22、丝确定 试虫是否为真菌侵染致死， 结果见表1。 由室内实验结果可以看出， LSY-1菌株对椰子织蛾具 有致死作用， 其半致死浓度为4.41106cfu/ml。 0028 表1.菌株LSY-1菌株5d后对椰子织蛾幼虫的室内生物活性测定 0029 0030 实施例三菌株室外防治效果 0031 将金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1菌株的水剂带至田间， 稀释至含 分生孢子1108个/mL， 并搅拌均匀， 超低量喷雾。 选取3根危害程度相似的椰子树枝， 用防 虫网围住危害的椰子的树枝端并扎紧防虫网， 通过挑出一些试虫的方法控制到每个处理30 头椰子织蛾幼虫。 2015年1。

23、1月5日开始喷雾防治， 当时天气多云转阴， 气温27， 风力1级， 空 气湿度82， 喷雾时侧风夹角为50 ， 雾滴在叶片上分布较多且均匀， 覆盖密度平均40.5 说明书 4/5 页 6 CN 105543102 A 6 滴/cm3。 每2天检查一次， 结果见表2。 由结果看出在处理4天后， 树干内幼虫的存活率开始显 著下降， 14天后死亡率为96.67， 表明金龟子绿僵菌(Metarhizumanisopliae)LSY-1具有 较强的杀虫毒力， 且杀虫效果好， 可以有效地控制椰子织蛾种群数量， 减少损失， 是一株在 防治椰子织蛾上具有潜在意义的生防菌株。 0032 表2.菌株LSY-1野外对椰子织蛾的生物活性测定 0033 0034 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 105543102 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 105543102 A 8 。