技术领域
本发明属于生物技术和肿瘤学领域，尤其是涉及膀胱癌组织中piRNA生物标志物及其表 达量的检测方法。
背景技术：
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，全球，膀胱癌在男性肿瘤中位列第七，在女 性中位列第十七。在我国泌尿系统肿瘤中，膀胱癌无论是发病率还是死亡率均居首位并且发 病率呈逐年升高趋势，大部分患者年龄介于50-60岁之间。膀胱癌90%以上为移行上皮细胞 癌，按病理分期可分为浅表性膀胱癌(早期）和肌层浸润性膀胱癌（进展期）。膀胱癌的发生 发展，可严重影响患者的生存及生活质量，因此寻找敏感特异的可用于早期诊断的生物学标 志物，以期达到利用其开展预防、筛检及诊断，从而改善膀胱癌患者的生存及生活质量。
RNA的研究近年来备受科学界的广泛关注，尤其是一些非编码的小RNA（non-coding RNA，ncRNA）分子，这些ncRNA分子可以调节细胞生长和发育的重要生理过程。ncRNA 调控细胞的生命过程包括转录水平和转录后水平的基因沉默。一般小ncRNA可以分为三类： siRNAs，microRNAs（miRNAs）和PIWI-interactingRNAs（PIWI蛋白相关非编码RNAs， 简称piRNAs）[2]。其中piRNA的研究比较少，piRNA潜在的功能和生物起源与miRNA和 siRNA存在明显不同。piRNA长度约26nt–31nt，可与PIWI蛋白结合形成piRNA复合物（piRC） 而发挥其生物学功能。不同于miRNA，piRNA不是由含茎环结构的前体剪切产生。piRNA 序列的基因组分布表明，piRNA通常成簇出现，并且有很强的正义链或反义链专一性。
对于piRNA的产生机制，目前尚无直接的生物化学证据。但是一个基于生物信息学分析 提出了“乒乓模型”假说。该模型认为：反义链的piRNA前体经过某些未知核酸酶的加工，生 成了5’端具有U（尿嘧啶）偏爱性的初级piRNA，这些piRNA与Aub或Piwi蛋白结合形成 piRC，piRC在piRNA的引导下，通过碱基互补配对的方式识别并结合正义链的piRNA前体， 然后将正义链piRNA前体进行剪切切割，产生次级piRNA的5’端，而后该次级piRNA被某 种核酸酶切割形成3’端，最后生成成熟的正义链piRNA。正义链piRNA与Ago3（PIWI）结 合形成piRC，通过类似的方式识别并切割反义链的piRNA前体。这样就形成了一个piRNA 生物发生循环，正义链与反义链的相互识别，通过piRC的剪切切割，循环产生piRNA。目 前该“乒乓模型”假说，得到了许多学者的广泛认同。
值得注意的是，在2006年7月的Nature杂志上面，两个独立的课题组同期发表了关于 piRNA的文章，Aravin等运用Northernblot的方法证实只有生殖细胞中才存在piRNA，同时 Girard等也证明了这种存在形式。近来，也有不少研究报道了piRNA与人类肿瘤之间的相关 性，但是机制方面的研究较少。如Lu等采用Solexa测序的方法，发现piRNA在人宫颈癌 HeLa细胞中存在，Chen等也发现piRNA存在于人的多种肿瘤细胞中。另外Chen等在piRNA 的研究中发现，piRNA-651与胃癌的临床分期显著相关，同时观察到其在胃癌、结肠癌、肺 癌以及乳腺癌组织中的表达水平显著高于其对应的癌旁组织，提示该piRNA可以作为肿瘤诊 断潜在的生物标志物。
目前对于膀胱组织中piRNA的提取及检测尚缺乏，另现有技术中均没有涉及到膀胱癌组 织及其对应癌旁正常组织中与哪些piRNA相关。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种用于诊断膀胱癌 的piRNA生物标志物及其应用，建立膀胱癌患者组织piRNA的表达谱，揭示组织中piRNA 对膀胱癌诊断的价值，为临床上膀胱癌早期发现提供基础。
技术方案：一种与膀胱癌相关的piRNA生物标志物，所述生物标志物：piRNA共197 个，其中：
上调的106个，如SEQIDNo.1～106所示：piR-52681、piR-48765、piR-36984、piR-52373、 piR-31112、piR-36360、piR-61291、piR-54826、piR-51747、piR-43148、piR-45726、piR-48368、 piR-58119、piR-57089、piR-39017、piR-43887、piR-37525、piR-39614、piR-39018、piR-35831、 piR-39592、piR-33050、piR-34998、piR-38355、piR-56914、piR-34920、piR-37523、piR-45582、 piR-51256、piR-37524、piR-52680、piR-31111、piR-56252、piR-58255、piR-31101、piR-30597、 piR-32079、piR-54098、piR-34984、piR-31108、piR-34000、piR-31961、piR-33650、piR-57293、 piR-33470、piR-36475、piR-47132、piR-45029、piR-58050、piR-36707、piR-60668、piR-34756、 piR-47161、piR-55637、piR-44190、piR-31013、piR-50437、piR-33543、piR-43217、piR-38376、 piR-50657、piR-61404、piR-51364、piR-48118、piR-30327、piR-54136、piR-45459、piR-44085、 piR-52697、piR-49813、piR-57447、piR-39232、piR-57132、piR-39763、piR-45051、piR-33043、 piR-53177、piR-43105、piR-57140、piR-40110、piR-37972、piR-40982、piR-42947、piR-43876、 piR-38354、piR-57141、piR-57567、piR-44956、piR-33368、piR-56037、piR-57143、piR-43107、 piR-33733、piR-57142、piR-57139、piR-34534、piR-56276、piR-32683、piR-55475、piR-34532、 piR-33730、piR-59160、piR-61324、piR-49600、piR-52323、piR-38240；
下调的91个，如SEQIDNo.107～197所示，：piR-60152、piR-34373、piR-30504、piR-34374、 piR-55023、piR-34375、piR-43452、piR-52155、piR-34380、piR-34379、piR-44265、piR-40154、 piR-34420、piR-48578、piR-35688、piR-56066、piR-37243、piR-47995、piR-49208、piR-34377、 piR-56061、piR-34376、piR-38145、piR-58986、piR-30506、piR-37988、piR-33851、piR-39786、 piR-56470、piR-43801、piR-45852、piR-58572、piR-49842、piR-49039、piR-51517、piR-35536、 piR-35924、piR-33814、piR-47258、piR-32538、piR-30436、piR-52398、piR-36439、piR-34177、 piR-52399、piR-35359、piR-31167、piR-56951、piR-42797、piR-40163、piR-31440、piR-32499、 piR-34422、piR-31133、piR-36614、piR-45571、piR-32406、piR-46447、piR-34348、piR-31252、 piR-45112、piR-54110、piR-58451、piR-49939、piR-49552、piR-39004、piR-30769、piR-40571、 piR-50830、piR-45655、piR-42221、piR-35166、piR-35167、piR-39572、piR-39516、piR-38856、 piR-35717、piR-33417、piR-38060、piR-55800、piR-33401、piR-39593、piR-35762、piR-53013、 piR-35899、piR-34726、piR-33466、piR-34194、piR-54213、piR-58463、piR-34366。
一种与膀胱癌相关的piRNA生物标志物，所述生物标志物为上调的piR-52681和下调的 piR-60152。
所述的piRNA生物标志物在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
与膀胱癌相关的piRNA生物标志物的检测及表达谱建立方法，包括以下步骤：
（1）使用Trizol试剂（Invitrogen）从膀胱癌患者的癌组织及其对应的癌旁组织中提取总 RNA，通过ArrayStar的piRNA芯片筛选出候选差异表达的piRNA；
（2）RNA逆转，采用miScript逆转录试剂盒（Qiagen）对RNA提取液进行逆转录反应， 获得cDNA溶液；
（3）PCR检测，运用miScriptSYBRGreenPCR检测试剂盒对步骤（2）中的cDNA溶 液进行PCR扩增反应，进而完成对候选piRNA的验证，建立膀胱癌piRNA表达谱。
与膀胱癌相关的piRNA生物标志物表达量的检测方法，采用SYBRqRT-PCR的方法检测 膀胱组织中piRNA的表达量：
（1）逆转录：采用miScript逆转录试剂盒（Qiagen）对提取出的总RNA进行逆转录反 应，具体操作依据该试剂盒的说明书进行，首先在0.5mL离心管中加入5μLDEPC双蒸水、 继而加入1μL逆转录混合试剂和4μLRT缓冲液，最后加入10μL0.1μg/μL的总RNA，总反 应体系20μL，该方法的反应条件为：37℃反应1小时，95℃反应5分钟，得到cDNA溶液；
（2）piR-52681实时荧光定量PCR检测：采用miScriptSYBRGreenPCR检测试剂盒对 步骤（1）中获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增引物为piR-52681扩增上游引物和 PCR检测的小RNA通用的下游引物，再用ABI7900HTReal-TimePCR仪检测，具体操作依 据该试剂盒与荧光定量PCR仪说明书进行，反应体系包括：1μLpiR-52681扩增上游引物和1μL PCR检测的小RNA通用的下游引物，5μLSYBRGreenPCR反应缓冲液，2μLDEPC双蒸水 以及1μL0.1μg/μLcDNA稀释液，该方法的反应条件：95℃预变性15分钟，94℃变性15秒， 60℃退火30秒，70℃延伸30秒，94℃-70℃的阶段共40个循环；
（3）piR-60152实时荧光定量PCR检测：与步骤（2）中的方法相同，所不同的只是扩 增的上游引物由piR-52681特异性扩增上游引物代替piR-60152，检测得到膀胱癌组织及癌旁 组织中piR-60152的表达水平；
（4）U6实时荧光定量PCR检测：与步骤（2）中的方法相同，所不同的只是扩增的上 游引物有piR-52681特异性扩增上游引物代替U6，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中U6的 表达水平；在本方案中U6作为piR-52681与piR-60152的内参。
有益效果：本发明首次发现piRNA在膀胱癌临床早期鉴别诊断中，可作为一种重要的生 物学检测指标，为今后膀胱癌piRNA的研究提供了理论依据，并为分子水平诊断膀胱癌提供 了新的思路，具有重大的理论意义和潜在的使用价值。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测piR-52681在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达；
图2为实时荧光定量PCR检测piR-60152在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案的前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述实施例。下面的实施 例中未注明的条件和方法等均按照常规进行。
实施例1：样本的收集及组织中RNA的提取
收集到19对新发的膀胱癌及其对应癌旁正常组织。组织来源于2010年1月至2012年6 月，且经过医院病理诊断确认，所有研究对象均签署知情同意书。
使用Trizol法提取组织中的总RNA：称取100mg的膀胱癌组织或者癌旁正常组织放于玻 璃研磨器中，继而加入液氮研磨至组织变成干粉状，而后将干粉用刮子转移至1.5mL去RNA 酶的离心管中（管中提前加好1mLTrizol溶液），颠倒混匀10下，室温静置5分钟；每1mLTrizol 中加入0.2mL氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5 分钟后12000g离心15分钟；将上层水相转入新的1.5mL去RNA酶的离心管中（上清量约 0.4-0.5mL），加入0.5mL异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，然后12000g离心10分钟；小 心倒掉上清液，留取离心管底部的沉淀，加1mL现配的75%wt的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA 沉淀一次，最后7500g离心5分钟；小心倒掉上清，而后将带有沉淀的离心管置于超净工作 台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）；在离心管中加20μL的DEPC水溶解， 可在55-60℃下孵育10分钟助溶。提取好的总RNA保存于-70℃的超低温冰箱中，或立即用 于逆转录。总RNA质量分析：通过对RNAA230、A260及A280的检测（A260/A280=1.8-2.1, A260/A230>1.80;），以及对总RNA采用琼脂糖凝胶电泳，根据28SrRNA与18SrRNA的比 值分析总RNA的质量。
样本流行病学及临床资料的调查
所有患者的膀胱组织都经过两名病理医生的病理诊断，纳入本研究前未患其它肿瘤，且 未经放射或化学药物治疗。调查内容包括一般人口学特征、临床资料、吸烟史、饮酒史、饮 食、个人史和家族史等。吸烟者定义为每天吸烟超过1支并持续一年以上，累计吸烟量“包年” 按(每日吸烟量/20)×吸烟年数来计算。饮酒者定义为每周至少3次，持续一年以上。
piRNA表达谱用于筛选膀胱癌及其对应癌旁正常组织中差异表达的候选piRNA
随机抽取3对癌及癌旁正常组织，采用人piRNA芯片检测了23677个piRNAs。统计学 分析结果显示：差异表达2倍以上且P值小于0.05的piRNA基因数为197个，其中上调的 106个，下调的91个（表1）。我们列出了差异表达上调、下调最显著的前十个piRNAs（表 2）。
膀胱癌组织及其癌旁正常组织中piRNA表达量的检测方法
采用SYBRqRT-PCR的方法检测膀胱组织中piRNA的表达量
（1）逆转录：采用miScript逆转录试剂盒（Qiagen）对提取出的总RNA进行逆转录反 应，具体操作依据该试剂盒的说明书进行。首先在0.5mL离心管中加入5μLDEPC双蒸水、 继而加入1μL逆转录混合试剂和4μLRT缓冲液，最后加入10μL0.1μg/μL的总RNA，总反 应体系20μL。该方法的反应条件为：37℃反应1小时，95℃反应5分钟，得到cDNA溶液。
（2）piR-52681实时荧光定量PCR检测：采用miScriptSYBRGreenPCR检测试剂盒对 （1）中获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增引物为piR-52681扩增上游引物和PCR 检测的小RNA通用的下游引物，再用ABI7900HTReal-TimePCR仪检测，具体操作依据该 试剂盒与荧光定量PCR仪说明书进行。反应体系包括：1μLpiR-52681扩增上游引物和1μL PCR检测的小RNA通用的下游引物，5μLSYBRGreenPCR反应缓冲液，2μLDEPC双蒸水 以及1μLcDNA稀释液（0.1μg/μL）。该方法的反应条件：95℃预变性15分钟，94℃变性15 秒，60℃退火30秒，70℃延伸30秒，94℃-70℃的阶段共40个循环。
（3）piR-60152实时荧光定量PCR检测：与（2）中的方法基本相同，所不同的只是扩 增的上游引物由piR-52681特异性扩增上游引物代替piR-60152，检测得到膀胱癌组织及癌旁 组织中piR-60152的表达水平。
（4）U6实时荧光定量PCR检测：与（2）中的方法基本相同，所不同的只是扩增的上 游引物有piR-52681特异性扩增上游引物代替U6，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中U6的 表达水平。在本实验中U6作为piR-52681与piR-60152的内参。
分析piR-52681（DQ585569）和piR-60152（DQ594040）对膀胱癌的诊断价值
实例中piRNA的表达是以CT值来表示。CT值代表一种目的piRNA分子达到实验设计 阈值所需要的PCR循环的次数。在目的piR-52681、piR-60152和内参U6扩增效率相同的情 况下，可以直接得到目的piR-52681、piR-60152相当于内参的定量ΔCT=CT目的-CT内参。采用 2-ΔCT表示目的piRNA表达相对于内参U6表达变化的倍数。所有的统计检验均为双侧概率检 验，P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS13.0软件做进一步的统计分析。
统计分析结果发现，piR-52681在膀胱癌组织中的表达显著高于其对应的癌旁正常组织 （癌组织与癌旁正常组织相比：7.58±7.49versus2.91±1.33,P=0.026）（图1）。piR-60152在 膀胱癌组织中的表达显著低于其对应的癌旁正常组织（癌组织与癌旁正常组织相比：3.95±2.05 versus8.82±7.81,P=0.027）（图2）。
表1.膀胱癌及癌旁正常组织中差异piRNA表达谱
续上表
续上表
续上表
续上表
aNCBI数据库
表2.差异表达上调、下调最显著的前十个piRNAs
aNCBI数据库
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了 解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所 做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>南京医科大学
<120>与膀胱癌相关的piRNA生物标志物及其应用
<130>
<160>197
<170>PatentInversion3.3
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