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1、(10)授权公告号 CN 202401070 U (45)授权公告日 2012.08.29 CN 202401070 U *CN202401070U* (21)申请号 201120569477.3 (22)申请日 2011.12.31 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 浙江爱易生物医学科技有限公司 地址 316000 浙江省舟山市定海区兴舟大道 157 号 101 室 (72)发明人 任峻 张华忠 (54) 实用新型名称 老年性痴呆相关基因位点检测试剂盒 (57) 摘要 本实用新型提供了一种检测老年性痴呆相关 基因位点是否发生突变从。
2、而评估个体患老年性痴 呆症风险性的试剂盒， 由包装盒体 1、 衬垫 2、 装有 检测两个 SNP 位点的荧光定量 PCR 反应液的两个 试管 3、 装有阳性对照品的一个试管 4、 装有阴性 对照品的一个试管 5 组成， 衬垫上设有容器孔， 分 别放置两管荧光定量 PCR 反应液 3、 阳性对照品 4 和阴性对照品 5。本实用新型试剂盒运用荧光定 量 PCR 技术实现了同时检测两个老年性痴呆症相 关基因 SNP 位点基因型的目的， 相对于现有的荧 光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点， 本实用新 型试剂盒将与同一疾病的两个 SNP 位点检测整合 在一个试剂盒内， 使用更方便而且成本更低， 对个。
3、 体患老年性痴呆症风险性的评估也更便捷。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种老年性痴呆相关基因位点检测试剂盒， 其特征是由包装盒体 （1） 、 衬垫 （2） 、 装 有检测两个 SNP 位点的荧光定量 PCR 反应液的两个试管 （3） 、 装有阳性对照品的一个试管 （4） 、 装有阴性对照品的一个试管 （5） 组成， 衬垫 （2） 上设有容器孔， 分别放置两管荧光定量 PCR 反应液 （3） 、 阳性对照品 （4） 和阴。
4、性对照品 （5） 。 权 利 要 求 书 CN 202401070 U 2 1/4 页 3 老年性痴呆相关基因位点检测试剂盒 技术领域 0001 本实用新型涉及分子生物学和医学领域， 具体涉及检测老年性痴呆相关基因位点 是否发生突变的试剂盒， 通过同时检测与老年性痴呆密切相关的载脂蛋白 E（APOE） 和脊髓 灰质炎病毒受体相关 2（PVRL2） 的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体患老年性痴呆症 的风险。 背景技术 0002 阿尔茨海默病所谓的老年痴呆症。是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病， 临床表现为认知和记忆功能不断恶化， 日常生活能力进行性减退， 并有各种神经精神症状 和行为障碍。。
5、患病率研究显示， 美国在 2000 年的阿尔茨海默病例数为 450 万例。年龄每增 加 5 岁， 阿尔茨海默病人的百分数将上升 2 倍， 也就是说， 60 岁人群的患病率为 1%， 而 85 岁 人群的患病率为 30%。 0003 载脂蛋白 E（Apolipoprotein E， APOE） 是血浆脂蛋白的一个重要组成部分。APOE 基因位于 19 号染色体。目前以有研究者们以聚合酶链式反应、 限制性片段长度多态性 （PCR-RFLP） 方法对 APOE 进行分型， 以聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 分析结果。由此从分子 水平阐明 APOE 基因多态性与老年性痴呆 （Alzheimer s 。
6、disease， AD） 的关系， 尤其是 4 的多态性， 对研究 AD 的发病机理、 预防、 诊断及早期防治有重大意义。 0004 人类APOE存在基因多态性， 其遗传多态性主要受位于同一基因位点上的3个等位 基因 （2、 3、 4） 所控制， 分别编码血浆中 3 种异构体， 即 APOE2、 APOE3、 APOE4， 构成 6 种不同的基因型， 3 种纯合子 （2/2， 3/3， 4/4） ， 3 钟杂合子 （2/3， 2/4， 3/4） 。APOE 基因 PCR-RFLP 原理为用特异性引物扩增， 包括 2 位点 DNA 序列， 扩增产物 进一步用 Hhal 酶切， 产生不同的限制性片。
7、段长度多态性 2、 3、 4， 由此产生 6 种不 同的电泳图谱。 0005 APOE3是人群中最常见的形式。 有学者报道APOE-4增加AD的危险性， APOE-2 减少 AD 的危险性。APOE 基因与晚发家族性 AD， 晚发散发型 AD 与早发散发性 AD 均有关联。 晚发性 AD 与 APOE4 等位基因的联系已被证实。AD 患者携带 4 等位基因者占 46.2%， 而 对照只占 13.2%。 0006 根据研究者的研究结果表明， AD 患者的年龄分布和对照组之间无差别 （u=0.97， P 0.05） 。等位基因在 AD 组与正常对照组之间有非常显著的差异 （P 0.01） 。其中 。
8、2、 3 等位基因在 AD 组与对照组之间的比较无明显差异 （u=1.79， P 0.05） ， 4 等位基因 在对照组和研究者们的结果与国外报道一致。并且在 AD 组中， 携带 4 基因型与对照组之 间也有明显差异 （P 0.01） ， 而携带 3 等位基因， 无明显差异。4 等位基因与对照组比 较差异明显 （P 0.05） 。 0007 1994年有报道百岁老人普遍携带APOE2等位基因。 因此2等位基因似乎不仅可 以保护人们免患AD， 而且还与长寿有关。 这一关系可能是由于2等位基因通过减少LDL 胆固醇浓度而达到保护机体的作用。 说 明 书 CN 202401070 U 3 2/4 页。
9、 4 0008 AD 组与正常对照组中 APOE 基因型差异显著。AD 患者 3 的频率与对照组相似。 对照组 2 的频率较高， 但均无统计学差异。而患者 4 的频率明显高于对照， 说明 4 对 AD 的发展及结果确实有一定的影响。这可能是 AD 患者特殊的脑损伤由 APOE 多态性所致。 许多人倾向认为 A 是首要的并且首先发生淀粉样蛋白沉积。特别 APOE4 比 APOE3 结合 A 的速度快， pH 范围狭窄。AOPE4 还可以同 A 结合形成新的单纤维， 沉寂后形成高密度 的结构。最近有学者认为， 淀粉蛋白形成是 AD 的第一步， 淀粉蛋白斑的形成可能先于通 常见到的导致 AD 脑细胞。
10、凋亡的 “神经元纤维缠结” 的产生。另一种与 AD 损伤有关的重复 蛋白是微管蛋白 Tau。APOE-Tau 相互作用可能是防止 Tau 磷酸化的保护机制。对于携带一 个或两个 4 等位基因的患者， 游离的 Tau 可能被磷酸化， 从而影响了神经纤维的结构。 0009 综上所述， APOE 特别是 APOE4 在多种神经退化过程的发展中起作用。研究者们研 究 AD 患者的遗传与 APOE 基因多态性的相关性， 实验结果阐明 4 与 AD 的发病有着一定的 相关作用， 而 APOE3 或 APOE2 与病理改变无明确的牵连。 0010 脊髓灰质炎病毒受体相关 2（polivovirus rece。
11、ptor related 2， PVRL2） 属于免 疫球蛋白超家族中的 Nectin 家族， 基因全长约 43kb， 亦定位于 19q13， 有 9 个外显子和两种 亚型， 在氨基酸水平上与 PVR 有 55% 的同源性。PVRL2 编码型穿膜糖蛋白， 结构中也有两 个免疫球蛋白样C2型区域和一个免疫球蛋白样V型区域。 其分子定位于内皮细胞的细胞间 连接处， 它的两种亚型互相作用， 通过 亚型向细胞内传递信息， 发挥粘附作用。葛晓东等 研究认为 PVRL2 是单纯疱疹病毒 （HSV） 和假狂犬病病毒的受体， 介导这些病毒株入侵细胞， 而且与这些病毒在细胞间的扩散有关， 大多数研究亦认为 PV。
12、RL2 的基因遗传多态性现象对 多发性硬化症的严重程度有所影响， 认为病毒与多发性硬化症的临床病程相关。 Takahashi 等的研究更进一步证实 PVRL2 是一种 Ca2+ 非依赖性的粘附分子 （cellular adhesion molecule， CAM） ， 在细胞粘附、 迁移和极化中起重要作用。 发明内容 0011 本实用新型针对目的是提供一种采用荧光定量 PCR 技术同时检测两个老年性痴 呆相关基因 SNP 位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、 衬垫、 装有检测两个 SNP 位点的荧光 定量 PCR 反应液的两个试管、 装有阳性对照品的一个试管、 装有阴性对照品的一个试管组 成， 。
13、衬垫上设有容器孔， 分别放置两管荧光定量 PCR 反应液、 阳性对照品和阴性对照品。 0012 其中荧光定量 PCR 反应液的成分包含 ： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTPs、 SNP 位点检测用 上游引物、 SNP 位点检测用下游引物、 SNP 位点基因型一荧光探针、 SNP 位点基因型二荧光探 针、 Taq DNA 聚合酶。 0013 其中， 0014 载脂蛋白 E（APOE） 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0015 上游引物序列 ： 5 - GAGATGAGAGTTGGT -3 0016 下游引物序列 ： 5 - GAAGAGAAACGCTGT -3 0017 基因型一。
14、荧光探针序列 ： 5 -FAM GGGTTGGaGTGGAG TAMRA -3 0018 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC- GGGTTGGgGTGGAG TAMRA -3 0019 脊髓灰质炎病毒受体相关 2（PVRL2） 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0020 上游引物序列 ： 5 - CTTGGGACTTGGAGG -3 说 明 书 CN 202401070 U 4 3/4 页 5 0021 下游引物序列 ： 5 - TAGAGACGGGAGAAG -3 0022 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM GGTGGAACaGCACACT - TAMRA -3 0023 基。
15、因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC GGTGGAACgGCACACT TAMRA -3 0024 对照品分为阳性对照品和阴性对照品， 阴性对照品为无菌双蒸水样品， 阳性对照 品为口腔粘膜细胞 DNA 样品。 0025 本试剂盒保存于 -20， 尽量减少反复冻融。 0026 本实用新型试剂盒使用方法 ： 0027 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。 0028 扩增检测在荧光定量 PCR 仪上进行， 分为 6 个反应管， 每一个 SNP 位点检测使用 3 个反应管， 其中 1 个反应管为被检测样品， 阳性对照和阴性对照各使用 1 个反应管， 每管中 总体积 10l， 其中 8l PCR 反应液。
16、， 2l 检测样品 （基因组 DNA、 阳性对照或阴性对照） 。 反应条件为 50、 2 分钟， 95、 10 分钟， 再进行 60 个循环的 95、 30 秒， 60、 1 分钟。反 应完成后在荧光定量 PCR 仪上进行终点荧光读取， 根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线 读取被检测样品的 SNP 位点基因型。 0029 本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测老年性痴呆相关基因 SNP 位点， 从而告 知被检者患病风险数值， 提前预防和控制， 指导医师选择正确的临床治疗方案， 有利于患者 进行针对性治疗。 0030 本实用新型的特点是 ： 该试剂盒运用荧光定量 PCR 技术实现了同时检测两个老年。
17、 性痴呆相关基因SNP位点基因型的目的， 相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP 位点， 本实用新型试剂盒将同一疾病的所有 SNP 位点检测整合在一个试剂盒内， 使用更方 便而且成本更低， 对个体患老年性痴呆症风险性的评估也更便捷。 附图说明 0031 图 1 为本实用新型的结构示意图。 具体实施方式 0032 本实用新型结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解， 这些实施例仅用于 说明目的， 而不用于限制本实用新型范围。 0033 实施例 1 0034 参见图 1， 本实用新型试剂盒由包装盒体 1、 衬垫 2、 装有检测两个 SNP 位点的荧光 定量 PCR 反应液的两个试管 3。
18、、 装有阳性对照品的一个试管 4、 装有阴性对照品的一个试管 5 组成， 衬垫上设有容器孔、 分别放置两管荧光定量 PCR 反应液 3、 阳性对照品 4 和阴性对照 品 5。 0035 其中荧光定量 PCR 反应液的成分包含 ： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTPs、 SNP 位点检测用 上游引物、 SNP 位点检测用下游引物、 SNP 位点基因型一荧光探针、 SNP 位点基因型二荧光探 针、 Taq DNA 聚合酶。 0036 本试剂盒保存于 -20， 尽量减少反复冻融。 0037 实施例 2 0038 1 材料 ： 说 明 书 CN 202401070 U 5 4/4 页 6 003。
19、9 血样总 DNA 提取试剂盒购于美国 Qiagen 公司， Taq DNA 聚合酶、 dNTPs 等 PCR 相关 试剂购于美国 Promega 公司， 7900 型荧光定量 PCR 仪为美国 ABI 公司产品。 0040 2 引物及探针 ： 0041 基于载脂蛋白 E（APOE） 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0042 上游引物序列 ： 5 - GAGATGAGAGTTGGT -3 0043 下游引物序列 ： 5 - GAAGAGAAACGCTGT -3 0044 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM GGGTTGGaGTGGAG TAMRA -3 0045 基因型二荧光探针序。
20、列 ： 5 -VIC- GGGTTGGgGTGGAG TAMRA -3 0046 脊髓灰质炎病毒受体相关 2（PVRL2） 上的 SNP 位点检测引物和探针为 ： 0047 上游引物序列 ： 5 - CTTGGGACTTGGAGG -3 0048 下游引物序列 ： 5 - TAGAGACGGGAGAAG -3 0049 基因型一荧光探针序列 ： 5 -FAM GGTGGAACaGCACACT - TAMRA -3 0050 基因型二荧光探针序列 ： 5 -VIC GGTGGAACgGCACACT TAMRA -3 0051 3 样本检测 ： 0052 选取30例血液样本， 其中已确定患老年性痴。
21、呆症的为18例。 样本用血样总DNA提 取试剂盒提取总 DNA。每一例检测为 12 个反应管， 每管中总体积 10l， 其中 8l PCR 反 应液， 每一个 SNP 位点检测使用 3 个反应管， 1 个反应管中加入 2l 被检测 DNA， 另外 2 个 反应管中加入 2l 阳性对照和阴性对照， 在 ABI7900 荧光定量 PCR 仪上进行扩增。反应条 件为 50、 2 分钟， 95、 10 分钟， 再进行 60 个循环的 95、 30 秒， 60、 1 分钟。反应完成 后在荧光定量 PCR 仪上进行终点荧光读取。 说 明 书 CN 202401070 U 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 202401070 U 7 。