一种羧基麦芽糖铁注射液及其医药用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610335324.X (22)申请日 2016.05.18 (71)申请人 江苏神龙药业有限公司 地址 224200 江苏省盐城市东台市何垛北 路18号 (72)发明人 秦勇赵维于学珍李瑞徐成 周自桂陈建芳 (74)专利代理机构 江苏银创律师事务所 32242 代理人 何震花 (51)Int.Cl. C07J 63/00(2006.01) A61K 31/7135(2006.01) A61K 31/56(2006.01) A61K 9/08(2006.01) A61P 3。

2、1/18(2006.01) (54)发明名称 一种羧基麦芽糖铁注射液及其医药用途 (57)摘要 本发明公开了一种羧基麦芽糖铁注射液及 其医药用途， 本发明提供的羧基麦芽糖铁注射液 中含有羧基麦芽糖铁和一种结构新颖的天然产 物化合物()， 羧基麦芽糖铁、 化合物()单独作 用时， 可以提高CD4+细胞数及改善免疫功能调整 免疫平衡， 对艾滋病具有治疗作用； 羧基麦芽糖 铁和化合物()联合作用时， 治疗效果进一步提 高， 可以开发成治疗艾滋病的注射液， 与现有技 术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。 权利要求书1页 说明书5页 CN 105906683 A 2016.08.31 CN 1059。

3、06683 A 1.一种具有下述结构式的化合物()， 2.一种羧基麦芽糖铁注射液， 其特征在于： 包括羧基麦芽糖铁、 如权利要求1所述的化 合物()和药学上可以接受的载体。 3.权利要求1所述的化合物()的制备方法， 其特征在于， 包含以下操作步骤： (a)将灯 心草粉碎， 用7585乙醇热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味， 依次用石油醚、 乙酸乙 酯和水饱和的正丁醇萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b) 步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂， 先用25乙醇洗脱8个柱体积， 再用70乙醇洗脱 12个柱体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物；。

4、 (c)步骤(b)中70乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离， 依次用体积比为85:1、 45:1、 25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为20:1、 15:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离， 用体积百分浓度为72的甲醇水溶液等度洗脱， 收集1016个柱体积洗脱 液， 洗脱液减压浓缩得到化合物()。 4.根据权利要求3所述的化合物()的制备方法， 其特征在于： 步骤(a)用80乙醇热回 流提取， 合并提取液。 5.根据权利要求3所述的化合物。

5、()的制备方法， 其特征在于： 所述大孔树脂为D101型 大孔吸附树脂。 6.根据权利要求3所述的化合物()的制备方法， 其特征在于： 步骤(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯进行萃取， 得到二氯甲烷萃取物。 7.权利要求1所述的化合物()在制备治疗艾滋病的药物中的应用。 8.权利要求2所述的羧基麦芽糖铁注射液在制备治疗艾滋病的药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105906683 A 2 一种羧基麦芽糖铁注射液及其医药用途 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 具体涉及一种羧基麦芽糖铁注射液及其医药用途。 背景技术 0002 羧基麦芽糖铁是一种新型的铁络合物， 用麦芽糊精将。

6、铁离子稳定地络合在其中， 控制铁的释出， 铁离子能与铁转运蛋白和铁蛋白结合以发挥作用， 并防止释放大量的游离 铁， 减少有毒氧化物形成。 羧基麦芽糖铁能有效提高轻到中度缺铁性贫血患者Hb和血清铁 蛋白浓度。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种羧基麦芽糖铁注射液及其医药用途。 0004 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 0005 一种具有下述结构式的化合物()， 0006 0007 一种羧基麦芽糖铁注射液， 包括羧基麦芽糖铁、 如权利要求1所述的化合物()和 药学上可以接受的载体。 0008 上述化合物()的制备方法， 包含以下操作步骤： (a)将灯心草粉碎， 用758。

7、5乙 醇热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味， 依次用石油醚、 乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃 取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中正丁醇取物用 大孔树脂除杂， 先用25乙醇洗脱8个柱体积， 再用70乙醇洗脱12个柱体积， 收集70洗 脱液， 减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分 离， 依次用体积比为85:1、 45:1、 25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步 骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为20:1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脱得到3个组。

8、分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积 百分浓度为72的甲醇水溶液等度洗脱， 收集1016个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得 到化合物()。 0009 进一步地， 化合物()的制备方法中， 步骤(a)用80乙醇热回流提取， 合并提取 说明书 1/5 页 3 CN 105906683 A 3 液。 0010 进一步地， 化合物()的制备方法中， 所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。 0011 进一步地， 化合物()的制备方法中， 步骤(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯进行萃 取， 得到二氯甲烷萃取物。 0012 上述化合物()在制备治疗艾滋病的药物中的应用。 00。

9、13 上述羧基麦芽糖铁注射液在制备治疗艾滋病的药物中的应用。 0014 本发明的优点： 0015 本发明提供的羧基麦芽糖铁注射液中含有羧基麦芽糖铁和一种结构新颖的天然 产物， 羧基麦芽糖铁和该天然产物单独作用时， 对艾滋病具有治疗作用； 二者联合作用时， 对艾滋病的治疗效果进一步提高， 可以开发成治疗艾滋病的药物。 具体实施方式 0016 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明保护范 围。 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 0017 实施例1。

10、： 化合物()分离制备及结构确证 0018 分离方法： (a)将灯心草(2kg)粉碎， 用80乙醇热回流提取(15L3次)， 合并提取 液， 浓缩至无醇味(3L)， 依次用石油醚(3L3次)、 乙酸乙酯(3L3次)和水饱和的正丁醇 (3L3次)萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂， 先用25乙醇洗脱8个柱体积， 再用70乙醇洗脱 12个柱体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离， 依次用体积比为85:1(10个柱体积)、 45:1(8个柱体。

11、积)、 25:1(10 个柱体积)和15:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组分 4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为20:1(10个柱体积)、 15:1(8个柱体积)和1:1(6个 柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为72的甲醇水溶液等度洗脱， 收集1016个柱体积洗 脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物()(HPLC归一化纯度大于98)。 0019 结构确证： HR-ESI-MS显示M+H+为m/z469.3282， 结合核磁特征可得分子式为 C30H44O4，。

12、 不饱和度为9。 核磁共振氢谱数据 H(ppm， CDCl3， 600MHz)： H-1(1.62， dd， J12.4， 8.9Hz)， H-1(2.11， dd， J12.4， 3.6Hz)， H-2(5.82， ddd， J10.9， 8.9， 3.6Hz)， H-3(5.68， d， J10.9Hz)， H-5(0.99， m)， H-6(1.52， m)， H-6(1.63， m)， H-7(1.78， m)， H-7(1.91， m)， H-9 (2.55， s)， H-16(2.47， d， J13.1Hz)， H-16(2.81， d， J13.1Hz)， H-18(2.86，。

13、 d， J 11.5Hz)， H-19(1.73， m)， H-21(1.34， m)， H-21(1.57， m)， H-22(1.66， m)， H-22(1.74， m)， H-23 (1.09， s)， H-24(1.06， s)， H-25(1.28， s)， H-26(1.26， s)， H-27(1.36， s)， H-28(0.89， s)， H- 29(0.85， d， J6.3Hz)， H-30(1.23， s)， 12-OH(6.38， s)； 核磁共振碳谱数据 C(ppm， CDCl3， 125MHz)： 39.6(CH2， 1-C)， 124.3(CH， 2-C)， 。

14、139.2(CH， 3-C)， 35.4(C， 4-C)， 57.2(CH， 5-C)， 19.7(CH2， 6-C)， 36.4(CH2， 7-C)， 46.5(C， 8-C)， 58.7(CH， 9-C)， 46.4(C， 10-C)， 196.2(C， 11- C)， 144.8(C， 12-C)， 143.2(C， 13-C)， 58.6(C， 14-C)， 209.4(C， 15-C)， 54.3(CH2， 16-C)， 53.4 (C， 17-C)， 42.3(CH， 18-C)， 41.7(CH， 19-C)， 70.5(C， 20-C)， 35.8(CH2， 21-C)， 35。

15、.8(CH2， 22- 说明书 2/5 页 4 CN 105906683 A 4 C)， 26.6(CH3， 23-C)， 21.7(CH3， 24-C)， 15.7(CH3， 25-C)， 19.7(CH3， 26-C)， 14.8(CH3， 27-C)， 19.3(CH3， 28-C)， 11.2(CH3， 29-C)， 29.4(CH3， 30-C)。 红外波谱表明该化合物含有 , -不饱 和羰基(1705cm-1)， 羟基(3425cm-1)， 羰基(1760cm-1)， 双键(1663cm-1)和偕二甲基(1380cm -1)基团。13C-NMR、 DEPT和HSQC谱中显示有30个。

16、碳信号， 包括八个甲基， 六个亚甲基， 六个次 甲基(两个烯烃碳)， 以及十个季碳(一个连氧碳， 两个羰基， 一对四取代烯烃碳)， 以上功能 结构再结合不饱和数表明该化合物为五环三萜结构。 1H-NMR谱结合HSQC谱显示的七个单峰 甲基质子信号 H1.09(3H， s)， 1.06(3H， s)， 1.28(3H， s)， 1.26(3H， s)， 1.36(3H， s)， 0.89 (3H， s)和1.23(3H， s)， 一个双峰甲基质子信号 H0.85(3H， d， J6.3Hz)以及1H-NMR数据表 明该化合物为乌苏烷型三萜类化合物。 在该乌苏烷型化合物中， C-11和C-15位形。

17、成酮基， C- 2与C-3、 C-12与C-13形成双键结构。 HMBC谱中H2-16和H3-27与C-15的相关性以及它们的碳化 学位移也进一步确证C-15形成酮基。 另HMBC谱中H-9和H-18与C-12， H-18和H3-27与C-13， 12-OH与C-12相关信号以及它们的碳化学位移表明该化合物存在烯醇式结构， 羟基连接在 C-12位与C-12和C-13形成的双键构成烯醇式结构。 HMBC谱中12-OH和H-9与C-11的相关信号 以及碳化学位移确认C-11位为羰基。 此外， HMBC谱中H-18、 H-19、 H3-29和H3-30与C-20的相关 信号以及C-20碳化学位移可以。

18、确定C-20位连有一个羟基。 NOESY谱中H3-28和H3-29与H-18存 在相关信号， 但H3-30与H-18没有相关信号， 表明C-20位的羟基为 构型。 综合氢谱、 碳谱、 HMBC谱和NOESY谱， 以及文献关于相关类型核磁数据， 可基本确定该化合物如下所示， 立体 构型进一步通过ECD试验确定， 理论值与实验值基本一致。 0020 该化合物化学式及碳原子编号如下： 0021 0022 实施例2： 药理作用 0023 1、 材料与方法 0024 1.1动物 0025 恒河猴57kg， 雄性健康， 感染前经PCR检测无SIV阳性， 血常规正常， 由中国医学 科学院实验动物研究所提供。。

19、 0026 1.2试剂与样品 0027 羧基麦芽糖铁购自中国药品生物制品检定所。 化合物()自制， 制备方法见实施例 说明书 3/5 页 5 CN 105906683 A 5 1。 单克隆抗体， 购自军事医学科学院生物制剂发展中心。 AZT(叠氮胸苷)购自Burroughs。 0028 1.3仪器 0029 FACS420型流式细胞仪测定(美国B.D公司)。 TMRMC型酶标仪。 0030 1.4猴分组及模型制备 0031 SIVmac感染成功动物随机分组， 分别为正常对照组、 模型对照组、 阳性对照组(AZT 组50mgkg-1)、 羧基麦芽糖铁组(80mgkg-1)、 化合物()组(80m。

20、gkg-1)、 羧基麦芽糖铁与 化合物()组合物组 【40mgkg-1羧基麦芽糖铁+40mgkg-1化合物()】 。 感染后2周给药， 药 物组每日按照上述剂量给药； 正常对照组， 每日给生理盐水等量。 每组每日给药一次， 静脉 注射。 给药时间为18周， 然后解剖进行病理观察。 0032 1.5T淋巴细胞亚群测定实验 0033 以单克隆抗体直接标记动物外周血CD4+， CD8+细胞， 按产品说明书操作， 采用 FACS420型流式细胞仪测定。 微机处理分析阳性率， 并计算CD4+/CD8细胞比值。 0034 1.6MTT法观察T、 B淋巴细胞增殖实验 0035 无菌取猴静脉血2ml， 肝素抗。

21、凝， 分离单个核细胞， 调整细胞数1105/ml。 将 调整细胞悬液种植在96孔培养板内， 200 l/孔， 并分别加入不同有丝分裂原诱导淋巴细胞 分化， ConA5 g/ml， LPS30 g/ml浓度， 培养48h后加入MTT(5mg/ml)继续培养4h， 加入酸化异 丙醇(0.04mol/L)， 利用TMRMC型酶标仪检测， 波长570630nm。 0036 1.7统计学方法 0037 实验数据用均数标准差(xs)表示， 应用SPSS18.0版统计软件进行单因素方差 分析和t检验， 以P0.05为差异有统计学意义。 0038 2、 实验结果 0039 2.1对SIV感染动物CD4+细胞的。

22、影响 0040 应用单克隆抗体直接荧光标记CD4+， CD8+细胞， 流式细胞仪检测， 结果表明SIVmac 感染4周时模型对照组CD4+及CD4+/CD8+比值下降(P0.01)； 与模型对照组比， 羧基麦芽糖铁 与化合物()组合物组和阳性对照组CD4+及CD4+/CD8+比值显著上升(P0.01)； 与模型组比， 羧基麦芽糖铁组、 化合物()组CD4+及CD4+/CD8+比值上升(P0.05)。 见下表。 0041 2.2对SIV模型动物T淋巴细胞分化增殖的影响 0042 与正常对照组比， 模型组在感染4周时， T细胞对ConA诱导分化增殖反应明显下降， 与感染前相比有明显差异(P0.01。

23、)。 与模型组比较， 羧基麦芽糖铁与化合物()组合物组和 阳性对照组T细胞对有丝分裂原刺激的反应能力显著提高， T细胞明显回升(P0.01)； 与模 型组比， 羧基麦芽糖铁组、 化合物()组T细胞回升(P0.05)。 结果见下表。 0043 2.3对SIV模型动物B淋巴细胞分化增殖的影响 0044 与正常对照组比较， 模型对照组在感染4周时， 与感染前相比B细胞功能受损， 增殖 反应低于感染前(P0.01)。 与模型对照组比较， 羧基麦芽糖铁与化合物()组合物组和阳性 对照组B细胞增殖显著上升(P0.01)； 与模型对照组比较， 羧基麦芽糖铁组、 化合物()组B 细胞增殖上升(P0.05)。 。

24、结果见下表。 说明书 4/5 页 6 CN 105906683 A 6 0045 0046 艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症， 由艾滋病毒感染所致， 目前国际上采用哈特 疗法(HAART)， 即几种优势互补西药联合应用， 是公认的高效抗逆转录病毒治疗药物， 但还 是不能使病毒彻底杀灭， 而且副作用多， 使患者生活质量下降。 猴免疫缺陷病毒(SIV)诱发 猴艾滋病(SAIDS)感染实验动物模型， 是1989年经WHO专家推荐抗艾滋病药物治疗动物模 型， 它在病原学， 临床、 病理、 免疫学及发病机理等方面与人感染艾滋病极为相似， 国外已较 多用于评价抗艾滋病药物的效果。 0047 CD4+细胞是维。

25、护机体免疫功能的重要细胞， 也是SIV破坏的主要细胞， 因此CD4+阳 性细胞数降低对免疫缺陷进展有直接关系。 它的数量及功能变化是评价疾病发展和药物疗 效的重要指标。 正常人体CD4+细胞与CD8+细胞相对制约维持机体的免疫平衡， 由于HIVAIDS 患者CD4+细胞数量不断减少及功能受损至使CD4+CD8+细胞比例倒置， CD8+细胞较CD4+细胞相 对占优势， 增强免疫抑制作用， 造成免疫功能失调， 如HIV进一步侵犯机体其它免疫细胞， 即 会导致机体免疫功能缺陷。 由于病毒在体内持续不断的复制， 破坏机体免疫细胞， 致使SIV 模型动物外周血CD4+细胞数量明显降低。 CD4+细胞被破。

26、坏， 数量减少， 淋巴细胞正常功能受 到抑制， 致使T淋细胞对有丝分裂原诱导反应能力降低， 感染SIV动物B细胞对细菌脂多糖 LPS反应能力也下降， 但不及T细胞明显， 呈迟缓下降趋势。 0048 上述结果表明， 羧基麦芽糖铁、 化合物()单独作用时， 可以提高CD4+细胞数及改 善免疫功能调整免疫平衡， 对艾滋病具有治疗作用； 羧基麦芽糖铁和化合物()联合作用 时， 治疗效果进一步提高， 可以开发成治疗艾滋病的注射液。 0049 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明的保护 范围。 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 105906683 A 7 。