假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310586259.4 (22)申请日 2013.11.21 CGMCC NO.7935 2013.07.17 C12N 1/20(2006.01) C12P 7/02(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 中国医药集团总公司四川抗菌素 工业研究所 地址 610052 四川省成都市成华区龙潭工业 园华冠路 168 号 专利权人 太原市威尔潞威动物保健品有限 公司 (72)发明人 曾志刚 梁彦明 翟龙飞 徐欣 许之晖 (74)专利代理机构 成都立信专利事务所有限公 司 51100 代理人 冯忠亮 C。

2、N 102296039 A,2011.12.28, CN 102321678 A,2012.01.18, CN 102660618 A,2012.09.12, (54) 发明名称 假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法 (57) 摘要 本发明为假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二 醇的方法， 解决巳有菌株发酵获得骨化二醇过程 中底物投料量低， 不适于工业化生产的问题。本 发明的假诺卡氏菌， 自编号为 SIIA2243， 其拉丁 文 名Pseudonocardia autotrophica，保 藏 单 位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心， 保藏日期 ： 2013 年 07 月 17 日，。

3、 保藏编号 CGMCCNo.7935。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 宋智刚 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书7页 CN 103898004 B 2016.04.13 CN 103898004 B 1.假诺卡氏菌 ， 其特征在于其分类命名： 自养假诺卡氏菌 （Pseudonocardia autotrophica） ， 保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心， 保藏日 期： 2013年07月17日， 保藏编号CGMCCNo.7935。 2.根据权利要求1所述的假诺卡氏菌发酵生产骨化二醇的。

4、方法， 其特征在于生产过程 包括： （1） 自养假诺卡氏菌株依次经过三角烧瓶， 种子罐， 发酵罐进行深层培养发酵， （2） 向自养假诺卡氏菌株的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素 D3， 继续发酵得发酵液， （3） 将步骤(2)的发酵液， 用有机溶剂进行萃取， 浓缩， 柱层析及结晶后得到骨化二醇成 品。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于步骤(1)中自养假诺卡氏菌株的种子罐及发 酵罐培养基含有蛋白胨、 玉米浆、 葡萄糖、 黄豆粉、 氯化钠、 磷酸二氢钾。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于步骤(2)中自养假诺卡氏菌株的发酵液在补 入一种或者多种环糊精化合物的溶液。

5、和维生素D3后， 继续发酵的时间为110天。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于步骤(2)中自养假诺卡氏菌株的发酵液在补 入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D3后的24hr内， 通过增加搅拌轴转速， 或者 增加空气流量来提高发酵液的溶氧水平， 搅拌轴转速200500r/min， 空气流量10.81 2.5v/v/m。 6.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于步骤(3)中的柱层析是指分离柱直径为5cm 100cm制备型高效液相层析系统。 7.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于步骤如下： （1） 自养假诺卡氏菌株依次经过三角烧瓶， 种子罐， 发酵罐进行深层培养发酵， 以下各 组。

6、分的含量均为重量体积百分比， 即g/l00ml， 斜面培养： 三角烧瓶内配制含葡萄糖110%， 蛋白胨110%， 玉米浆0.12%， 氯化钠 0.11%， 琼脂12.5%， 其余为水， pH6.57.5的培养基， 121， 30分钟灭菌， 灭菌后冷却、 制成斜面、 接种， 2035培养510天， 种子培养及发酵： 在种子罐、 发酵罐内配制种子培养基， 种子培养基含蛋白胨0.22%， 玉米浆0.22%， 葡萄糖0.55%， 黄豆粉0.11.5%， 氯化钠0.11.5%， 磷酸二氢钾0.1 1.5%， 其余为水， pH7.08.0， 将种子培养基装入500ml摇瓶中， 冷却后将培养好的斜面菌株 挖。

7、块接入到装有种子培养基的摇瓶中， 摇瓶转速100300r/min， 温度2035， 培养25 天， 得摇瓶种子液, 按照摇瓶种子培养基的配比配置种子培养基30升， 移入到50升一级种子罐内， 121， 30分钟灭菌， 冷却后， 将培养好的摇瓶种子液按照重量体积百分比510%接种量在无菌条 件下移入一级种子罐内， 2035搅拌轴转速100400r/min， 空气流量10.512v/v/ m， 罐压0.020.1MPa培养14天， 按照摇瓶种子培养基的配比配置种子培养基300升， 移入 到500升二级种子罐内， 121， 30分钟灭菌， 冷却后， 将培养好的一级种子罐内的种子液按 照重量体积百分比。

8、510%接种量在无菌条件下移入二级种子罐内， 2035， 搅拌轴转速 100400r/min， 空气流量10.512v/v/m， 罐压0.020.1MPa培养14天， 配制含蛋白胨0.22%， 玉米浆0.22%， 葡萄糖0.55%， 黄豆粉0.11.5%， 氯化钠0.1 权利要求书 1/2 页 2 CN 103898004 B 2 1.5%， 磷酸二氢钾0.11.5%， 其余为水， pH7.08.0的发酵培养基3000升， 移入到5000升 发酵罐内， 121， 30分钟灭菌， 冷却后， 将培养好的二级种子罐内的种子液按照重量体积百 分比510%接种量在无菌条件下移入发酵罐内， 2035， 搅。

9、拌轴转速100400r/min， 空 气流量10.512v/v/m， 罐压0.020.1MPa培养14天， （2） 向自养假诺卡氏菌株的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素 D3， 继续发酵得发酵液， 继续发酵， 向5000升发酵罐中已经培养了14天的发酵液中补入一种或者多种环糊精 化合物的溶液和维生素D3， 环糊精化合物是指甲基环糊精、 乙基环糊精、 苄基环糊精， 羟丙 基环糊精、 羟乙基环糊精、 羟丁基环糊精， 环糊精化合物在发酵液中的终重量百分浓度达到 0.15%， 维生素D3在发酵液中的终浓度达到500ug/ml5000ug/ml， 补料后24hr内提高搅 拌轴转速为20。

10、0500r/min， 或者增加空气流量到10.812.5v/v/m， 继续发酵110天， （3） 将步骤(2)的发酵液， 用有机溶剂进行萃取， 浓缩， 柱层析及结晶后得到骨化二醇成 品， 骨化二醇的提取： 终止发酵后， 将发酵液通过压差法移入到10000升的储罐中， 往储罐中加入与发酵液等 体积的乙酸乙酯， 充分搅拌后， 加入破乳剂， 静置分层后移去下层的发酵液， 得乙酸乙酯萃 取液； 将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩， 所回收的有机溶剂乙酸乙酯又进 行二次萃取， 而减压浓缩后获得的浓缩液利用分离柱直径为5cm100cm高压制备液相层析 系统进行分离， 获得骨化二醇组分， 结晶后即得。

11、骨化二醇成品， 骨化二醇的HPLC测定： 色谱柱为Kromasil正相硅胶柱， 2504.6mmi.d， 5um， 流动相为 异丙醇-正己烷， 19， 流速1.5ml/min， 柱温为40， 检测波长265nm。 权利要求书 2/2 页 3 CN 103898004 B 3 假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法 0001 技术领域： 0002 本发明涉及一种用于发酵生产骨化二醇的假诺卡氏菌， 以及利用该假诺卡氏菌发 酵生产骨化二醇的方法。 0003 背景技术： 0004 骨质疏松症 （Osteoporosis， OP） 日益成为严重威胁老年人的健康的一种慢性疾 病； 维生素D类药物中的骨化二醇。

12、 （25羟基维生素D3） 是自然存在人体内的维生素D3的活性 代谢产物； 多年来， 骨化二醇主要用于治疗老年人骨质疏松症等各种慢性骨紊乱， 以及与慢 性肾衰竭有关的代谢性骨疾病， 低钙血病。 另外， 骨化二醇近年也作为饲料添加剂用于饲料 行业。 0005 骨化二醇的制备有化学合成和生物发酵两种方法； 化学合成反应步骤繁多、 需要 昂贵试剂、 反应过程中会产生外消旋体， 需要进行复杂的拆分过程， 不仅大大影响收率， 而 且难以拆分完全， 而且化学合成生产骨化二醇会对环境产生较大的污染。 而微生物发酵的 方式能够利用微生物细胞内的酶特异性的解决骨化二醇的手性结构问题， 其生产条件温 和， 收率高，。

13、 成本低廉， 环境友好， 成为一种有效替代化学合成的方法。 但是现有方法中添加 的维生素D3的浓度低， 专利USP5474923添加维生素D3的最大浓度仅为1000ug/ml， 这不利于 通过增加维生素D3的投料量来提高骨化二醇的产量； 而且目前用微生物发酵方式制备骨化 二醇的相关研究仅限于实验室水平， 没有工业规模深层发酵生产骨化二醇的技术方案。 0006 发明内容： 0007 本发明的目的是提供一种维生素D3的投料量高， 产品收率高， 质量好， 可工业规模 发酵生产骨化二醇的假诺卡氏菌株及其发酵生产骨化二醇的方法。 0008 本发明是这样实现的： 0009 假诺卡氏菌， 其特征在于其自编号。

14、为SIIA2243,其拉丁文名Pseudonocardia autotrophica， 保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期 2013年07月17日， 保藏编号CGMCCNo.7935。 0010 假诺卡氏菌发酵生产骨化二醇的方法， 生产过程包括： 0011 （1） 菌株SIIA2243依次经过三角烧瓶， 种子罐， 发酵罐进行深层培养发酵， 0012 （2） 向菌株SIIA2243的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素 D3， 继续发酵得发酵液， 0013 （3） 将步骤(2)的发酵液， 用有机溶剂进行萃取， 浓缩， 柱层析及结晶后得到骨化二 醇成品。

15、。 0014 步骤(1)中菌株SIIA2243的种子及发酵罐培养基含有蛋白胨、 玉米浆、 葡萄糖、 黄 豆粉、 氯化钠、 磷酸二氢钾。 0015 步骤(2)中菌株SIIA2243的发酵液在补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维 生素D3后， 继续发酵的时间为14天。 0016 步骤(2)中菌株SIIA2243的发酵液在补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维 生素D3后的24hr内， 通过增加搅拌轴转速或者增加空气流量来提高发酵液的溶氧水平。 说明书 1/7 页 4 CN 103898004 B 4 0017 步骤(3)中的柱层析是指制备型高效液相层析系统。 0018 假诺卡氏菌发酵生产骨化二醇。

16、的方法， 步骤如下： 0019 （1） 菌株SIIA2243依次经过三角烧瓶， 种子罐， 发酵罐进行深层培养发酵， 以下各 组分的含量均为重量体积百分比， 即g/l00ml。 0020 斜面培养： 0021 配制含葡萄糖110%， 蛋白胨110%， 玉米浆0.12%， 氯化钠0.11%， 琼脂1 2.5%， 其余为水， pH6.57.5的培养基,121， 30分钟灭菌， 灭菌后冷却、 制成斜面、 接种， 20 35培养510天。 0022 种子培养及发酵： 0023 配制含蛋白胨0.22%， 玉米浆0.22%， 葡萄糖0.55%， 黄豆粉0.11.5%， 氯化 钠0.11.5%， 磷酸二氢钾0。

17、.11.5%， 其余为水， pH7.08.0的种子培养基装入500ml摇瓶 中， 冷却后将培养好的斜面菌株挖块接入到装有种子培养基的摇瓶中， 摇瓶转速100 300r/min， 温度2035， 培养25天， 得摇瓶种子液。 0024 按照摇瓶种子培养基的配比配置种子培养基30升， 移入到50升一级种子罐内， 121 ， 30分钟灭菌， 冷却后， 将培养好的摇瓶种子液按照重量体积百分比510%接种量在无菌 条件下移入一级种子罐内， 2035搅拌轴转速100400r/min， 空气流量10.512v/ v/m， 罐压0.020.1MPa培养14天， 按照摇瓶种子培养基的配比配置种子培养基300升，。

18、 移 入到500升二级种子罐内， 121， 30分钟灭菌， 冷却后， 将培养好的一级种子罐内的种子液 按照重量体积百分比510%接种量在无菌条件下移入二级种子罐内， 2035， 搅拌轴转 速100400r/min， 空气流量1:0.51:2v/v/m， 罐压0.020.1MPa培养14天。 0025 配制含蛋白胨0.22%， 玉米浆0.22%， 葡萄糖0.55%， 黄豆粉0.11.5%， 氯化 钠0.11.5%， 磷酸二氢钾0.11.5%， 其余为水， pH7.08.0的发酵培养基3000升， 移入到 5000升发酵罐内， 121， 30分钟灭菌， 冷却后， 将培养好的二级种子罐内的种子液按照。

19、重量 体积百分比510%接种量在无菌条件下移入发酵罐内， 2035， 搅拌轴转速100400r/ min， 空气流量10.512v/v/m， 罐压0.020.1MPa培养14天。 0026 （2） 向SIIA2243的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D3， 继续发酵， 向5000升发酵罐中已经培养了14天的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合 物的溶液和维生素D3， 环糊精化合物在发酵液中的终重量百分浓度达到0.15%， 维生素D3 在发酵液中的终浓度达到500ug/ml5000ug/ml， 补料后24hr内提高搅拌轴转速为200 500r/min， 或者增加空气流量到10.8。

20、12.5v/v/m， 继续发酵110天。 0027 （3） 将步骤(2)的发酵液， 用有机溶剂进行萃取， 浓缩， 柱层析及结晶后得到骨化二 醇成品。 0028 骨化二醇的提取： 0029 终止发酵后， 将发酵液通过压差法移入到10000升的储罐中， 往储罐中加入等体积 的乙酸乙酯， 充分搅拌后， 加入破乳剂， 静置分层后移去下层的发酵液； 将乙酸乙酯萃取液 移入浓缩装置中进行减压浓缩， 所回收的有机溶剂乙酸乙酯又进行二次萃取， 而减压浓缩 后获得的浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离， 获得骨化二醇组分， 结晶后即得骨 化二醇成品。 0030 骨化二醇的HPLC测定： 说明书 2/7 页 5。

21、 CN 103898004 B 5 0031 色谱柱为Kromasil正相硅胶柱(2504.6mmi.d,5um)， 流动相为异丙醇正己烷 (19)， 流速1.5ml/min， 柱温为40， 检测波长265nm。 0032 假诺卡氏菌SIIA2243的获得途径： 0033 菌株分离、 诱变与鉴定。 0034 从广州白云山的土壤样品中分离筛选得到的能够将维生素D3转化为骨化二醇的 原始菌株SIIA243。 往菌株SIIA243的斜面培养物中加入10ml无菌生理盐水进行洗涤， 获得 孢子悬液， 梯度稀释至菌体浓度在107CFU/ml左右， 取5ml菌悬液放置在直径为9cm的培养皿 中， 在30W紫。

22、外灯下距离30cm照射30秒， 梯度稀释并取0.1ml涂布于平板培养基上， 28培养 10天， 挑取单菌落于斜面培养基上， 28培养7天， 获得紫外诱变菌株备用。 0035 往菌株SIIA243的斜面培养物中加入10mlpH5.0的无菌磷酸缓冲液进行洗涤， 获得 孢子悬液， 菌悬液中亚硝基胍的浓度为50ug/ml， 往诱变处理后的菌悬液加入无菌硫代硫酸 钠， 使亚硝基胍分解以终止其作用， 之后梯度稀释并取0.1ml涂布于平板培养基上， 28培 养10天， 挑取单菌落于斜面培养基上， 28培养7天， 获得亚硝基胍诱变菌株备用。 0036 将紫外诱变和亚硝基胍诱变获得的菌株移种到含维生素D3的基本。

23、培养基及完全 培养基上， 28培养510天， 检出在含维生素D3的基本培养基不长、 在完全培养基上生长 的菌株； 然后将筛选到的菌株移种到含骨化二醇的基本培养基上， 28培养510天， 检出 不生长或生长势较弱的菌落 （含维生素D3或骨化二醇的基本培养基包含Na2HP04、 KH2P04、 MgS04、 CaC12、 微量元素溶液和琼脂粉。 ） 。 将这些不消耗底物维生素D3和产物骨化二醇的菌 落挑选出来， 在摇瓶中发酵72hr后补入维生素D3， 使其在发酵液中的终浓度达到500ug/ml 5000ug/ml， 然后再发酵110天， 经过HPLC检测， 挑选出能够耐受高浓度底物维生素D3且 具。

24、有底物维生素D3残留低， 产物骨化二醇产量高这种转化特性的菌株； 0037 通过大量的诱变、 筛选工作， 最终获得了本发明所指的菌株SIIA2243。 菌株 SIIA2243具有特定的工业用途， 发酵生产骨化二醇。 0038 通过通用引物27F与1492R扩增菌株SIIA2243的16SrDNA， 获得的16srRNA基 因序列， 在Genebank数据库中注册， 序列号为KF796659， 将其与GenBank数据库调集的其它 放线菌菌株的16SrDNA相应序列进行比较， 并用Mega5.0软件包进行系统进化分析， 亲缘 关系最相近的是自养假诺卡氏菌模式菌Pseudonocardiaauto。

25、trophicaATCCIMSNU 20050T， 相似度99%， 说明菌株SIIA2243为自养假诺卡氏菌Pseudonocardiaautotrophica。 0039 菌株SIIA2243的形态学特性： 0040 基内菌丝 （营养菌丝） 在微黄， 明显分枝， 有横隔， 气生菌丝白色， 分枝， 产生卷曲的 孢子链， 孢子类椭圆状； 菌丝成节段， 在节段间的凹陷处或者节段中间长出芽的方式进行出 芽生长。 菌落白色， 皱褶， 致密， 圆形， 菌落色素浅黄色。 0041 菌株SIIA2243的培养特性： 0042 将菌株SIIA2243接种在各种合成培养基和有机培养基上， 28培养14天， 记录。

26、相 应生长特征。 说明书 3/7 页 6 CN 103898004 B 6 0043 0044 菌株SIIA2243的生理生化特性： 0045 在营养丰富的固体培养基上进行培养， 发现其最适生长温度为1832， 在4 时仍然缓慢生长， 4以下及40以上基本观察不到生长了。 该菌株革兰氏染色程阳性， 需 氧生长， 但是在氧气少的环境下也可生长， 淀粉水解反应阴性， 明胶液化反应阴性， 牛奶凝 固和胨化反应阴性， 黑色素产生呈阴性， 硝酸盐还原反应阴性， 不产生硫化氢； 能够利用D 葡萄糖， L阿拉伯糖， D木糖， L肌醇， D甘露醇， D果糖， 鼠李糖， 棉籽糖， D乳糖， D山梨糖， D麦芽糖。

27、， D半乳糖， 不能够利用D海藻糖和D木糖。 另外， 该菌株能够利 用碳酸氢钠为唯一碳源进行生长。 0046 该菌株无枝菌酸， 细胞壁含mesoDAP(内消旋二氨基庚二酸)， 全细胞水解液中含 有半乳糖和阿拉伯糖。 0047 综合以上分类数据分析， 鉴定菌株SIIA2243属于自养假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica， 其与已报道的自养假诺卡氏菌种中的相关菌株在形态学、 生理生化特征、 16srRNA基因序列分析方面有所差异， 因此， 鉴定菌株SIIA2243为自养假诺卡氏菌种中的 新菌株， 命名为PseudonocardiaautotrophicaSIIA2243。

28、。 菌株Pseudonocardia autotrophicaSIIA2243已于2013年7月17日保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心， 保藏号CGMCCNo.7935。 0048 发明的有益效果： 0049 利用本发明进行骨化二醇的发酵生产有以下优点和有益效果： 0050 1本发明选育获得菌株SIIA2243,不利用、 不降解底物维生素D3和产物骨化二醇， 使得底物维生素D3在发酵的过程中能够更好地被转化为骨化二醇， 从而有利于骨化二醇产 量的提高。 另外， 选育获得的菌株SIIA2243能够耐受更高浓度的维生素D3， 这有利于通过增 加维生素D3的投料量来提。

29、高骨化二醇的产量， 从而更充分地发挥发酵罐的生产能力。 由于 选育获得菌株SIIA2243的优良特性， 其在工业规模发酵过程中， 维生素D3的转化率最高能 够达到80%。 0051 2本发明提供了一种工业规模发酵生产骨化二醇的方法。 该生产工艺简单易行， 条 件温和， 安全可控， 工艺稳定性好， 能够大规模生产骨化二醇。 0052 3萃取剂乙酸乙酯回收反复使用降低了对环境的危害， 同时利用高压制备液相层 析系统来分离骨化二醇， 减少了工业规模生产中人力的投入， 提高了提取收率， 同时获得的 说明书 4/7 页 7 CN 103898004 B 7 骨化二醇成品纯度高， 杂质少， 产品质量好。 。

30、0053 菌株SIIA2243已于2013年7月17日保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心， 保藏号CGMCCNo.7935。 0054 具体实施方式： 0055 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0056 实施例1： 0057 自养假诺卡氏菌PseudonocardiaautotrophicaSIIA2243的获得途径与鉴定 0058 从广州白云山的土壤样品中分离筛选得到的能够将维生素D3转化为骨化二醇的 原始菌株SIIA243。 往菌株SIIA243的斜面培养物中加入10ml无菌生理盐水进行洗涤， 获得 孢子悬液， 梯度稀释至菌体浓度在。

31、107CFU/ml左右， 取5ml菌悬液放置在直径为9cm的培养皿 中， 在30W紫外灯下距离30cm照射30秒， 梯度稀释并取0.1ml涂布于平板培养基上， 28培养 10天， 挑取单菌落于斜面培养基上， 28培养7天， 获得紫外诱变菌株备用。 0059 往菌株SIIA243的斜面培养物中加入10mlpH5.0的无菌磷酸缓冲液进行洗涤， 获得 孢子悬液， 菌悬液中亚硝基胍的浓度为50ug/ml， 往诱变处理后的菌悬液加入无菌硫代硫酸 钠， 使亚硝基胍分解以终止其作用， 之后梯度稀释并取0.1ml涂布于平板培养基上， 28培 养10天， 挑取单菌落于斜面培养基上， 28培养7天， 获得亚硝基胍。

32、诱变菌株备用。 0060 将紫外诱变和亚硝基胍诱变获得的菌株移种到含维生素D3的基本培养基及完全 培养基上， 28培养510天， 检出在含维生素D3的基本培养基不长、 在完全培养基上生长 的菌株； 然后将筛选到的菌株移种到含骨化二醇的基本培养基上， 28培养510天， 检出 不生长或生长势较弱的菌落 （含维生素D3或骨化二醇的基本培养基包含Na2HP04、 KH2P04、 MgS04、 CaC12、 微量元素溶液和琼脂粉。 ） 。 将这些不消耗底物维生素D3和产物骨化二醇的菌 落挑选出来， 在摇瓶中发酵72hr后补入维生素D3， 使其在发酵液中的终浓度达到500ug/ml 5000ug/ml，。

33、 然后再发酵110天， 经过HPLC检测， 挑选出能够耐受高浓度底物维生素D3且 具有底物维生素D3残留低， 产物骨化二醇产量高这种转化特性的菌株。 0061 通过大量的诱变、 筛选工作， 最终获得了本发明所指的菌株SIIA2243。 菌株 SIIA2243具有特定的工业用途， 发酵生产骨化二醇。 0062 通过通用引物27F与1492R扩增菌株SIIA2243的16SrDNA， 获得的16srRNA基 因序列， 在Genebank数据库中注册， 序列号为KF796659， 将其与GenBank数据库调集的其它 放线菌菌株的16SrDNA相应序列进行比较， 并用Mega5.0软件包进行系统进化。

34、分析， 亲缘 关系最相近的是自养假诺卡氏菌模式菌PseudonocardiaautotrophicaATCCIMSNU 20050T， 相似度99%， 说明菌株SIIA2243为自养假诺卡氏菌Pseudonocardiaautotrophica。 0063 菌株SIIA2243的形态学特性： 0064 基内菌丝 （营养菌丝） 在微黄， 明显分枝， 有横隔， 气生菌丝白色， 分枝， 产生卷曲的 孢子链， 孢子类椭圆状； 菌丝成节段， 在节段间的凹陷处或者节段中间长出芽的方式进行出 芽生长。 菌落白色， 皱褶， 致密， 圆形， 菌落色素浅黄色。 0065 菌株SIIA2243的培养特性： 0066。

35、 将菌株SIIA2243接种在各种合成培养基和有机培养基上， 28培养14天， 记录相 应生长特征。 说明书 5/7 页 8 CN 103898004 B 8 0067 0068 菌株SIIA2243的生理生化特性： 0069 在营养丰富的固体培养基上进行培养， 发现其最适生长温度为1832， 在4 时仍然缓慢生长， 4以下及40以上基本观察不到生长了。 该菌株革兰氏染色程阳性， 需 氧生长， 但是在氧气少的环境下也可生长， 淀粉水解反应阴性， 明胶液化反应阴性， 牛奶凝 固和胨化反应阴性， 黑色素产生呈阴性， 硝酸盐还原反应阴性， 不产生硫化氢； 能够利用D 葡萄糖， L阿拉伯糖， D木糖，。

36、 L肌醇， D甘露醇， D果糖， 鼠李糖， 棉籽糖， D乳糖， D山梨糖， D麦芽糖， D半乳糖， 不能够利用D海藻糖和D木糖。 另外， 该菌株能够利 用碳酸氢钠为唯一碳源进行生长。 0070 该菌株无枝菌酸， 细胞壁含mesoDAP(内消旋二氨基庚二酸)， 全细胞水解液中含 有半乳糖和阿拉伯糖。 0071 综合以上分类数据分析， 鉴定菌株SIIA2243属于自养假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica， 其与已报道的自养假诺卡氏菌种中的相关菌株在形态学、 生理生化特征、 16srRNA基因序列分析方面有所差异， 因此， 鉴定菌株SIIA2243为自养假诺卡氏菌种中的 。

37、新菌株， 命名为PseudonocardiaautotrophicaSIIA2243。 菌株Pseudonocardia autotrophicaSIIA2243已于2013年7月17日保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心， 保藏号CGMCCNo.7935。 0072 实施例2： 0073 自养假诺卡氏菌PseudonocardiaautotrophicaSIIA2243发酵生产骨化二醇 0074 为了便于理解本发明， 下面将结合实施例来进一步详细描述本发明。 除非另有特 指， 本实施例中的灭菌条件为121， 30分钟。 %为质量百分比。 0075 1培养基： 00。

38、76 斜面培养基： 葡萄糖1.5%， 蛋白胨1.0%， 玉米浆0.3%， 氯化钠0.4%， 琼脂1.5%， 其余 为水， pH7.0, 0077 种子培养基： 蛋白胨1.5%， 玉米浆1.5%， 葡萄糖1.5%， 黄豆粉0.4%， 氯化钠0.5%， 磷 酸二氢钾0.2%， 其余为水， pH7.5。 0078 发酵培养基： 蛋白胨1.5%， 玉米浆1.5%， 葡萄糖1.5%， 黄豆粉0.4%， 氯化钠0.5%， 磷 酸二氢钾0.2%， 其余为水， pH7.5, 0079 2发酵生产骨化二醇 0080 制种： SIIA2243斜面菌株挖块到装有100ml种子培养基的500ml三角烧瓶中， 说明书 。

39、6/7 页 9 CN 103898004 B 9 摇瓶转速280r/min， 温度29， 培养3天， 总共制得1.5升种子液， 火焰保护下移入到已灭菌 的装有30升种子培养基的50升发酵罐中， 培养条件为搅拌轴转速260r/min， 29， 空气流 量0.9立方米/小时， 罐压0.05Mpa， 培养2天。 将培养了2天的30升种子液通过灭菌管道压入 到已灭菌的装有300升种子培养基的500升发酵罐中， 培养条件为搅拌轴转速180r/min， 29 ， 空气流量18立方米/小时， 罐压0.05MPa培养1天。 0081 发酵： 将培养了1天的300升种子液通过灭菌管道压入到已灭菌的装有3000升。

40、发酵 培养基的5000升发酵罐中， 培养条件为搅拌轴转速80r/min， 28， 空气流量90立方米/小 时， 罐压0.05MPa培养3天。 向发酵罐中补入溶解有9000g倍他环糊精的溶液100升和溶解有 1500g维生素D3的溶液100升， 补料后将搅拌速度调整为120r/min， 24hr后又调整为80r/ min， 继续发酵4天后终止发酵。 0082 提取精制： 终止发酵后， 将约3000升发酵液通过管道移入到10000升的储罐中， 往 储罐中加入3000升乙酸乙酯， 搅拌2hr， 搅拌轴转速50r/min， 加入破乳剂后静置过夜， 分层 后移去下层的发酵液， 将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩， 所回收的有机溶 剂乙酸乙酯又进行二次萃取， 而减压浓缩后获得的浓缩液利用高压制备液相层析系统进行 分离， 制备柱为C18柱， 检测波长为265nm， 流动相为乙腈水 （体积比8020） ， 收集目标组 分， 减压浓缩干后， 获得骨化二醇组分， 结晶后即得骨化二醇成品907g。 说明书 7/7 页 10 CN 103898004 B 10 。