技术领域
本发明属于生物细菌的检测技术范围，具体涉及类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的 快速检测引物和检测方法。
背景技术
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是针对靶序列上6个 特异性位点，设计2对特殊的引物，及1条加快反应速度的环引物，并通过具有链置换活性的 DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。扩增产物是一系列反向 重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物。现已有技术将 LAMP应用于巨细胞病毒，分枝杆菌，沙门菌，巴西副球孢子菌，非洲锥体虫等的检测。其 特异性和高效性的关键在于靶基因的选择和引物的设计。
类鼻疽伯克霍尔德菌是类鼻疽病的病原菌，常见于热带地区，该菌也可被利用作为生物 武器。类鼻疽病因其临床表现纷繁复杂，症状不典型而极难诊断，尤其是因其能形成脓肿样 病变易被误诊为结核病。病原学检查是诊断类鼻疽病的关键，但目前类鼻疽伯克霍尔德菌的 通用鉴定方法较为局限，多为培养后根据生化反应鉴定，存在一定的误检定率，而且病原菌 培养与鉴定需时较长，不能满足临床早期诊断和治疗的需要。特别是当其作为生物武器导致 人群感染时，更需要早期识别。尽管国外已有利用环介导等温扩增法检测类鼻疽伯克霍尔德 菌的文献报道(Journal ofClinical Microbiology2008，46：568-573)，但作者本人也认为检测的 速度、敏感性和特异性都不尽满意。该文作者采用LAMP方法从标本中检测类鼻疽伯克霍尔 德菌的最佳条件是65℃，90分钟，检测敏感性是44％，特异性为98.4％。
发明内容
本发明的目的是提供类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的快速检测引物和检测方法。
本发明提供的类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的快速检测引物，包括一对内引物、 一对外引物和一条环引物，其中，所述的一对内引物的序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2 所示，所述的一对外引物的序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示，所述的一条环引物的 序列如SEQ ID NO5所示。
本发明提供的类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的快速检测方法，其特征在于，对待 检测样品经过培养后提取DNA，得DNA模板，利用所述的类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温 扩增的快速检测引物进行环介导等温扩增，然后进行判读。
环介导等温扩增反应体系中混合引物SEQ ID NO1～5各序列的摩尔比优选为为8∶8∶1∶ 1∶4。
环介导等温扩增的优选反应体系组成如下：2X反应溶液(来自Loopamp的环介导等温 扩增法脱氧核糖核酸扩增试剂盒)12.5μl，10μM的SEQ ID NO1和2混合液4μl，10μM的 SEQ ID NO3和4的混合液0.5μl，10μM的SEQ ID NO52μl，DNA模板2μl，Bst DNA聚合 酶1μl，用水补足至25μl。
能够通过浊度或根据加入荧光目视检测试剂钙黄绿素后反应的颜色进行判读
利用本发明对类鼻疽伯克霍尔德菌进行检测具有敏感性高、特异性强、检测快速、操作 简便、不需要特殊设备的优点。
附图说明
图1为本发明的检测方法的最佳反应温度试验曲线；
图2为本发明的检测方法的敏感性试验曲线；
图3为本发明的检测方法的特异性试验曲线。
具体实施方式
本发明关键在于靶基因选择及引物设计。本发明的发明人选择类鼻疽伯克霍尔德菌III 型分泌系统基因序列中的TTS1的一段特殊序列orf2作为靶基因，在GenBank中查询比对后 确定其为类鼻疽伯克霍尔德菌所特有。针对此序列，采用primerexplorer V4软件，进行引物 设计。通过大量的对比分析和实验验证。最终获得以下内、外引物各1对和环引物1条，引 物序列为：
SEQ ID NO1：5’-TGCACACCGGTCAGTATCCGTA-TCCGGAATCTGGATCACCA-3’；
SEQ ID NO2：5’-GGCGCGCAGTTGCAGCTT-CGGTCAAGCGGATGTCG-3’；
SEQ ID NO3：5’-CTGTCGAGCAATCGGCG-3’；
SEQ ID NO4：5’-GCAGAAGATCGGAGGCATG-3’；
SEQ ID NO5：5’-ATTCCAGGGCAAGGACGG-3’。
实验证实，使用该组引物检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性和敏感性均较好。
下面通过具体实施方式对本发明提供的类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的快速检测 方法做进一步说明。
1.实验材料
(1)实验菌株的选择
实验菌株采用已知经测序确认的类鼻疽伯克霍尔德菌临床菌株及经常规鉴定的其他细菌 (包括：洋葱伯克霍尔德菌，铜绿假单胞菌，嗜麦芽窄食单胞菌，结核分枝杆菌，布鲁杆菌， 大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯菌，白念珠菌)。
(2)试剂采购
Loopamp环介导等温扩增法脱氧核糖核酸扩增试剂盒(由Bst DNA聚合酶以及反应混合液 构)和钙黄绿素荧光染料(荧光目视检测试剂)购自日本荣研株式会社，引物的合成由生工 生物工程有限公司完成。
2.DNA提取
可以采取简易法和试剂盒法，主要区别是试剂盒法更快捷。后面的效果说明中，如果未 加特别说明，DNA提取采用试剂盒法。
简易法：对于纯菌(已知类鼻疽伯克霍尔德菌经常规鉴定和测序确定的临床分离菌株)， 将新鲜培养的待检菌用生理盐水制成菌悬液，100℃煮沸10分钟，提取上清液，-20℃保存留 用。(注意：在生物安全柜中操作！)
试剂盒法：采用Wizard genomic DNApurification kit(promega公司)，按照厂家的操作 说明书提取DNA。
3.LAMP步骤
(1)引物配制：将新合成的所有引物先溶解并配制为100μM的保存液，再将SEQ ID NO 1和2，SEQ ID NO3和4，以及SEQ ID NO5分别配制为10μM的使用液。
(2)反应体系：反应体系总计25μl。包括：12.5μl的反应混合液，4μl10μM的SEQ ID NO 1和2的混合液，0.5μl10μM SEQ ID NO3和4的混合液，2μI10μM的SEQ ID NO5，1μl Bst DNA聚合 酶，2μl DNA模板，加3μl H2O至25μl。
(3)在反应管中加入钙黄绿素指示剂1μl。
(4)LAMP反应：①将内含25μl反应体系的反应管于65℃恒温模块加热30～60分钟； ②然后再加热至95℃2分钟，将bstDNA聚合酶灭活以终止反应。
(5)结果判读：由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷酸镁沉淀，通过以下 方法进行结果判读：①肉眼观察浊度：反应后管内清澈透明者为阴性，管内混浊或有白色沉 淀者为阳性；②反应管中指示剂颜色变化：颜色仍为黄色为阴性，由橙黄色变为绿色为反应 阳性。
该方法具有以下优点
(1)反应温度恒定，所需仪器简单：由于反应可以在恒定的温度条件下进行，不需变 换不同的温度，所需仪器设备简单，仅需一恒温加热模块或一台恒温水浴箱即可。如图1所示， 横坐标为时间，纵坐标为扩增反应中产物的浊度。选取60℃，63℃，65℃，67℃，68℃和69 ℃四个温度，对类鼻疽伯克霍尔德菌进行扩增以确定最佳反应温度。当浊度＞0.1时即能判定 为扩增反应阳性。从实时浊度曲线图可看出，在60℃～69℃的范围内，反应都能进行，但在 63℃～68℃间，结果在25min内可判为阳性(65℃左右为最佳反应温度)，而当温度为60℃和 69℃时，结果需要在25min后才能判为阳性。
(2)敏感性高：如图2所示，横坐标为时间，纵坐标为扩增反应中产物的浊度。将采 用试剂盒法提取的类鼻疽伯克霍尔德菌的DNA模板首先进行紫外分光光度法定量，然后进行 稀释和等温扩增反应。从该实时浊度曲线图可以看出，按照试剂盒法提取待测菌DNA，使其 在终反应体系中具有0.1ng的DNA量即可获得阳性检测结果。
(3)特异性强：如图3所示，横坐标为时间，纵坐标为扩增反应中产物的浊度。将建 立的环介导等温扩增方法检测包括类鼻疽伯克霍尔德菌在内的其他常见致病菌。阳性对照为 用试剂盒提取的已知浓度的类鼻疽伯克霍尔德菌DNA模板。用煮沸法提取以下待测菌的DNA 模板：类鼻疽伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌，铜绿假单胞菌，大肠埃希菌，金黄色葡萄 球菌，肺炎克雷伯菌，白念珠菌，布鲁杆菌，结核分枝杆菌，鲍曼不动杆菌，嗜麦芽窄食单 胞菌。平行进行扩增实验。图中显示，阳性对照和煮沸法的类鼻疽伯克霍尔德菌DNA能进行 有效扩增，均在25分钟内出现阳性，而其他菌及无菌水阴性对照的浊度值均未达到阳性判定 的标准，证明本方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性极佳。
(4)快速检测：采用本发明的引物和实验方法可以在30分钟内获得环介导等温扩增的 最高扩增反应，自简易法通过煮沸从纯菌落提取DNA至结果判读只需大约1小时时间，与培 养鉴定法(至少需时24小时)比较，大大缩短了明确病原菌种类的时间。
需要说明的是，①由于敏感性极高，要确保操作规范，防止污染，以避免结果发生假阳 性；②从临床标本中直接提取DNA进行类鼻疽伯克霍尔德菌的环介导等温扩增需要对标本进 行预处理。
本发明的效果还得到了临床病例的验证，下面列表说明。
LAMP扩增法检测的类鼻疽伯克霍尔德菌感染病例