快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法.pdf

一种快于常规检测、能够满足环保部门和排污企业的实际需要的快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法。技术方案是：其特征在于包括下列步骤：显色底物的选择：标准曲线的测定或线性方程参数确定：取菌样梯度稀释接种入显色培养基，同时同样的稀释菌样接种入底物平板或MPN管以确定不同稀释度粪大肠菌群或大肠杆菌的数量；计算特征时间：设定特征，底物显色达到该设定特征数值的时间即为特征时间；所得菌数目求对数与对应特征时间成线性，做出标准曲线或者求出线性方程lgxo＝AtT±B中的参数A和B的数值；未知浓度样品接入显色培养基同上求取特征时间，根据特征时间在标准曲线上找到对应的浓度或者将特征时间代入参数完整的线性方程求得菌浓(xo)的数值。

1、  一种快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)显色底物的选择；
(2)标准曲线的测定或线性方程参数确定：取菌样梯度稀释接种入显色培养基，同时将同样的稀释菌样接种入底物平板或MPN管确定各种稀释度粪大肠菌群或大肠杆菌的数量；
(3)计算特征时间：设定特征，将显色底物显色达到该设定特征数值的时间作为特征时间；
(4)步骤(2)所得菌数目求对数与对应特征时间成线性，做出标准曲线或者求出线性方程lg x_o＝At_T±B中的参数A和B的数值；
(5)未知浓度样品接入显色培养基同上求取特征时间，根据特征时间在标准曲线上找到对应的浓度或者将特征时间代入参数完整的线性方程求得菌浓(x_o)的数值。

2、  根据权利要求1所述的在线监测模式检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法，其特征在于：测量粪大肠菌群的显色底物为：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷或其他修饰的β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷或其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷，培养温度为44--45℃。

3、  根据权利要求1所述的在线监测模式检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法，其特征在于：测量大肠菌群的显色底物为：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷四种之一或混合物及4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷，培养温度为36.5-37.5℃，同时以4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)进行定量。

快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法
技术领域
本发明属于在线检测粪大肠菌群及大肠杆菌的方法领域，尤其是快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法。
背景技术
大肠菌群作为水质粪便污染指示菌的原因及概念：
总大肠菌群系指一群在37℃培养24～48小时能发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。总大肠菌群可作为粪便污染的指示菌。但是水中总大肠菌群不只来自人和温血动物的粪便污染，还能来自植物和土壤的天然存在。仅来源于人和温血动物粪便的大肠菌群称粪大肠菌群，是可在44.5℃培养温度下生长的耐热大肠菌群。由于大肠菌群是人及各种动物肠道中的正常寄居菌，常随粪便从人及动物体排出广泛散播于自然环境中。所以一旦检出，即意味着直接或间接地被粪便污染。在卫生学上大肠菌群被用作饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标。大肠菌群在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近，它的出现也可能预示着某些肠道病原菌例如沙门氏菌、志贺氏菌的存在，因此它是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在制定标准时，将大肠菌群作为微生物污染状况的监测指标和实施效果的评估指标。
目前的检测方法速度慢，不利于推广和实际应用。
发明内容
本发明公开了一种远远快于常规检测，有利于实际推广和应用，能够满足环保部门和排污企业的实际需要的在线监测模式检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法。
本发明的技术方案是：一种在线监测模式检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)显色底物的选择；
(2)标准曲线的测定或线性方程参数确定：取菌样梯度稀释接种入显色培养基，同时将同样的稀释菌样接种入底物平板或MPN管确定各种稀释度粪大肠菌群或大肠杆菌的数量；
(3)计算特征时间：设定特征，将显色底物显色达到该设定特征数值的时间作为特征时间；
(4)步骤(2)所得菌数目求对数与对应特征时间成线性，做出标准曲线或者求出线性方程lgx_o＝At_T±B中的参数A和B的数值；
(5)未知浓度样品接入显色培养基同上求取特征时间，根据特征时间在标准曲线上找到对应的浓度或者将特征时间代入参数完整的线性方程求得菌浓(x_o)的数值。
测量粪大肠菌群的显色底物为：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷或其他修饰的β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷或其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷，培养温度为44--45℃。
测量大肠菌群的显色底物为：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷四种之一或混合物及4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷，培养温度为36.5-37.5℃，同时以4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)进行定量。
本发明的效果是：本方法可用于检测复杂样品中的粪大肠菌群及大肠杆菌，具有特异、高效、快速、准确、稳定的特点；并且本方法使用在线仪器，取样到结果可见时间差取决于样品为2-10小时之间，远远快于常规检测，有利于实际推广和应用，能够满足环保部门和排污企业的实际需要。也为政府部门监管和企业质控提供了快速可靠的检测方法。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1为菌生长曲线图；
图2为图1的曲线微分图；
图3为一阶最值时间对接种浓度对数图；
图4为原理样机所作梯度稀释的的单克隆培养物在底物培养基中再培养过程特征波长吸光度实时监测图；
图5特征时间对接种浓度对数作曲线图。
具体实施方式
粪大肠菌群及大肠杆菌检测原理：
酶-底物法检测粪大肠菌群的依据是粪大肠菌群的定义。粪大肠菌群在44.5℃可以利用乳糖发酵产酸产气。则粪大肠菌群含有利用乳糖的一系列酶，这当中就包括β-D-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)。β-D-半乳糖苷酶可水解不同的底物生成有色物质，从而完成对大肠杆菌的快速检测。本系统采用的是含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷(MNPG)或其他修饰的β-D-半乳糖苷的培养基进行培养显色。
酶-底物法检测大肠杆菌的依据是大肠杆菌产生一种特异性酶β-D-葡糖醛酸糖苷酶(E.C.3.2.1.31)，研究表明94％-97％的E.Coli具有β-D-葡糖醛酸糖苷酶活性，而且几乎水和食品中所有其它肠杆菌缺乏这种酶，因此，以此为基础的水中和食品中的E.Coli检测方法得到了快速发展。β-D-葡糖醛酸糖苷酶可水解不同的底物生成有色或荧光物质，从而完成对大肠杆菌的快速检测。本系统采用的是含甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷的培养基培养。
诱导酶在培养过程中的积累量与接种菌浓度相关。理论论证得出接种量的对数(lgx_o)与特征时间(t_T)成正比。
以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷(MNPG)或其他修饰的β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)或其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷)为显色底物实时监测，在合适时间确定初始菌浓度。
在线仪器使用含前4种成分的培养基(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷或其他修饰的β-D-半乳糖苷或其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷)培养温度为44.5℃时监测粪大肠菌群。
在线仪器并行使用分别含上述四种之一或混合及4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)的培养基培养培养温度为37℃时监测大肠杆菌，大肠杆菌监测时以4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)定量，定量特征时间的确定通过对实时底物显色监测出来的生长曲线样曲线进行微分来确定。
对实时监测的吸光度曲线的数据处理为：
1、标准曲线的测定或线性方程参数确定。取菌样梯度稀释接种入显色培养基，同时同样的稀释菌样接种入底物平板或MPN管以确定不同稀释度粪大肠菌群或大肠杆菌的数量。
2、对实时监测得到的底物显色曲线进行数据处理，如设定特征为O.D.＝0.1特征的选择方法是选取曲线之间具有比较意义的点，一般选定特征范围定为0.1-0.3，底物显色达到该数值的时间为特征时间；或者通过微分取极值，底物显色达到该数值的时间为特征时间。
3、如上1所得菌数目求对数与对应特征时间成线性。做出标准曲线或者求出线性方程lgx_o＝At_T±B中的参数A和B的数值。
4、未知浓度样品接入显色培养基同上求取特征时间。根据特征时间在标准曲线上找到对应的浓度或者将特征时间代入参数完整的线性方程求得菌浓(x_o)的数值。
下面具体介绍相关工作原理：
1、阳性大肠菌群累积酶活与接种样品菌浓正相关理论推导：
x_T＝x_o2ⁿ    (1)
n=tT-toG---(2)]]>
x_T----是被培养菌达到设定的特征时的细胞数(特征时间)；
x_o----接种细胞数；
n------x_T时已繁殖代数；
t_o------菌体适应时间；
t_T------达到x_T时经历的总时间；
G-----平均代时。
(2)代入(1)得：
xTxO=2tT-toG---(3)]]>
lgxT=tTGlg2-toGlg2+lgxo---(4)]]>
对于设定的特征lgx_T为常数，则lgx_o与t_T有线性关系。
lgxo=-0.301GtT+0.301toG+lgxT---(5)]]>
即，接种量的对数与特征时间成正比。
2、实验室离线培养及数据处理
阳性克隆获取：
有粪大肠杆菌污染环境中取样，44.5℃在含乳糖培养基中培养，取扩增培养液适度生理盐水稀释铺X-gal底物平板，挑取蓝色单克隆菌落倒管培养，确定产酸产气后既可获得纯培养阳性菌落，反之白色菌落为阴性。
培养：梯度稀释的阳性菌样和阴性菌样在含X-gal底物培养基44.5℃培养，3％接种量接种。
同样稀释的菌液定量铺LB固体平板计数。
3：生长曲线特征时间确定及数据处理
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷作为底物可被β-D-半乳糖糖苷酶分解释放出5-溴-4-氯-3-吲哚。该化合物氧化形成蓝色产物，在溶液状态下，在1个/100ml~10⁸个/ml浓度范围内，符合朗伯比尔定律。根据这一原理，通过测酶反应产物的溶液的450nm吸光度即可对应菌群浓度。
图1为定时取平行样测定O.D.450nm.吸光度对时间作图得到典型的菌生长曲线，不同曲线对应不同接种菌浓，菌浓度通过平板计数确定。菌浓度按曲线由左到右分别为：1.35×10⁶个/ml，1.35×10⁴个/ml，1.35×10³个/ml，1.35×10²个/ml，1.35×10个/ml，1.35个/ml。
图2为图1中的1.35×10⁶个/ml，1.35×10⁴个/ml，，1.35×10²个/ml三条曲线的微分图。
图3为一阶最值时间对接种浓度对数作图，最值时间与接种浓度成线性关系。
图4为原理样机所作梯度稀释的的单克隆培养物在底物培养基中再培养过程特征波长吸光度实时监测图。
图5中，由图4通过上述方法计算所得特征时间对接种浓度对数作曲线图，得到样机所用标准曲线，实际样品测定时用上述方法计算出特征时间，代入标准曲线方程即可得样品菌浓度。