一种聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102757992 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757992 A *CN102757992A* (21)申请号 201110104461.X (22)申请日 2011.04.25 C12P 21/00(2006.01) C07K 14/00(2006.01) C07K 9/00(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (71)申请人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 张丽华 侯春彦 杨开广 梁振 张玉奎 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 2。

2、1002 代理人 马驰 (54) 发明名称 一种聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖 肽的方法 (57) 摘要 本发明涉及糖肽的富集方法， 具体地说是一 种聚乙二醇偶联结合超滤分离富集糖肽的方法 ； N- 连接糖蛋白质经过酶解产生的肽段混合物中 加入高碘酸， 糖链上的顺式邻二醇经氧化生成醛 基， 通过反相色谱除盐去除多余的高碘酸 ； 向氧 化后的肽段混合物中加入单甲氧基聚乙二醇酰 肼 （mPEG-Hz） ， 在乙酸乙酸钠缓冲液中糖肽与 聚乙二醇偶联 ； 将反应产物加入超滤离心管样品 池中， 经过清洗和离心过滤将糖肽和非糖肽分开 ； 糖肽保留在滤膜内， 非糖肽离心到滤膜外 ； 向样 品池中再加入肽。

3、 N- 糖苷酶 F（PNGaseF） 的碳酸氢 铵缓冲液， 酶解后将肽段从其糖基化位点处酶切 下来， 经过离心即可获得含糖基化位点的肽段。 本 发明的优点为 ： 是一种普适性的糖肽富集方法， 具有较好的选择性， 操作步骤简单， 非特性吸附的 清洗比较容易， 成本较低。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽的方法， 其特征在于 ： 1） N- 连接糖蛋白质经过酶解产生的肽段混合物中加入高碘。

4、酸， 糖链上的顺式邻二醇经 氧化生成醛基， 通过反相色谱除盐去除多余高碘酸 ； 2） 向氧化后的肽段混合物中加入单甲氧基聚乙二醇酰肼 （mPEG-Hz） ， 在乙酸 - 乙酸钠 缓冲液中糖肽与聚乙二醇偶联 ； 3） 将反应产物加入超滤离心管样品池中， 经过清洗和离心过滤将糖肽和非糖肽分开 ； 糖肽保留在滤膜内， 非糖肽离心到滤膜外 ； 4） 向样品池中再加入肽 N- 糖苷酶 F（PNGase F） 的碳酸氢铵缓冲液， 酶解后将肽段从 其糖基化位点处酶切下来， 经过离心即可获得含糖基化位点的肽段。 2. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 2） 中聚乙二醇偶联反应的具体过程为 。

5、： 肽段混合物中加入含有 1-5mg/mL 单甲氧 基聚乙二醇酰肼 （分子量为 10,00020,000 Da） 的 pH=4.56.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液 中， 在室温下振荡反应 6-24 小时。 3. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 3） 中超滤离心分离的过程为 ： 将步骤 2） 中的反应产物加入滤膜截留分子量为 10,000 5,000 的超滤离心管中， 在室温下 14,000-16,000 g 离心 15 30 分钟 ； 被滤膜 截留的部分再加入超纯水或 pH 7-8 碳酸氢铵缓冲液， 振荡后在室温下 14,000-16,000 g 离心 15 30 分钟 ； 如。

6、此反复清洗 7-9 次。 4. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 4） 中碳酸氢铵缓冲液为 50 100 mM 的碳酸氢铵水溶液， pH 为 7.5 8.5。 权 利 要 求 书 CN 102757992 A 2 1/4 页 3 一种聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽的方法 技术领域 0001 本发明涉及糖肽的富集方法， 具体地说是一种聚乙二醇偶联结合超滤分离富集糖 肽的方法， 应用于含 N- 连接糖基化位点的肽段的选择性富集。 背景技术 0002 糖蛋白具有重要的生物功能， 但其在生物体内的丰度较低。 因此， 通常需要经过富 集才能对其进行分析。 现有的富集方法主要包括。

7、凝集素亲和法、 硼酸亲和法、 亲水相互作用 法和糖氧化 / 酰肼法等。其中凝集素亲和法是一种基于生物亲和的经典方法， 具有很高的 特异性。但不同类型的凝集素只能专一性的亲和富集一种类型的糖蛋白 / 糖肽 (Yahara， I.and Edelman， G.M.， Proc.Nat.Acad.Sci.， 1972， 69， 608-612)。 如要富集不同类型的糖蛋 白/糖肽， 则需要不同类型的凝集素联用(Jung K.， Cho W.， Regnier F.， J.Proteome Res.， 2009， 8， 643-650)。而其他几种都是普适性的富集方法， 对各种糖型具有效果。 0003。

8、 糖氧化 / 酰肼法是目前最广范使用的普适性富集方法。作为一种化学衍生法， 已 有商品化的酰肼微球可提供用于实验研究。其富集过程为 ： N- 连接糖蛋白的糖链上的顺式 邻二醇先经高碘酸氧化成醛 ； 醛基再与固定在基质上的酰肼反应形成共价的腙键， 于是糖 蛋白便可富集到酰肼微球上， 非糖基化蛋白经洗脱去除 ； 糖蛋白再进行固相的酶解， 同样通 过洗脱去除掉非糖肽 ； 富集的糖肽经 PNGase F 酶酶解从固相基质上切除下来。Zhang 等进 一步完善了糖肽的酰肼化学富集， 使之成为一套标准方法 (Tian Y.， Zhou Y.， et al.， Nat. Protocol.， 2007， 2。

9、 ： 334-339)。 0004 但基于微球的糖氧化 / 酰肼法操作步骤繁琐， 尤其对微球的非特性性吸附的洗脱 需要多种试剂多次清洗。 并且， 由于商品化凝胶基质微球是透明的， 在离心后的分离过程中 容易损失， 影响回收率。因此， 我们尝试发展一种新型的基于衍生酰肼的聚乙二醇偶联， 结 合超滤分离过滤的方法进行糖肽的富集。该方法不仅对糖肽具有特异性， 并且操作过程简 单， 非特性吸附的清洗容易， 成本低。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种糖肽选择性富集方法， 利用该方法富集 N- 连接糖肽， 具备较好的特异性， 并且操作步骤比较简单。 0006 为实现上述目的， 本发明采用的技术。

10、方案为 ： 0007 糖肽经过氧化后， 糖链上的顺式邻二醇发应生成醛基 ； 再加入单甲氧基聚乙二醇 酰肼， 使其通过与醛基反应形成共价腙键从而特异性的偶联到糖链上 ； 通过超滤离心分离 将非糖肽滤出， 与糖肽分离 ； 再向滤膜内样品管中加入糖苷酶将糖链切下， 产生的含糖基化 位点的肽段经超滤离心分离， 即可实现含 N- 连接糖基化位点的肽段的选择性富集。 0008 具体为 ： 0009 一种聚乙二醇偶联结合超滤分离富集糖肽的方法， 0010 1)N- 连接糖蛋白质经过酶解产生的肽段混合物中加入高碘酸， 糖链上的顺式邻二 说 明 书 CN 102757992 A 3 2/4 页 4 醇经氧化生成。

11、醛基， 通过反相色谱除盐去除多余的氧化剂 ； 0011 2) 向氧化后的肽段混合物中加入单甲氧基聚乙二醇酰肼， 在乙酸 - 乙酸钠缓冲液 中糖肽与聚乙二醇偶联 ； 0012 糖肽参与偶联反应的是糖链上经氧化产生的醛基 ； 醛基与聚乙二醇上衍生的酰肼 基团通过生成共价腙键发生偶联， 将单甲氧基聚乙二醇酰肼分子选择性的修饰到糖肽的糖 链上 ； 0013 步骤 2) 中聚乙二醇偶联反应的具体过程为 ： 将含有 1-5mg/mL 单甲氧基聚乙二醇 酰肼 ( 分子量为 10,000-20,000Da) 的 pH 4.5-6.5 乙酸 - 乙酸钠缓冲溶液加入肽段混合 物中， 在室温下振荡反应 6-24 小。

12、时。 0014 3) 将反应产物加入超滤离心管样品池中， 经过清洗和离心过滤将糖肽和非糖肽分 开 ； 糖肽保留在滤膜内， 非糖肽离心到滤膜外 ； 0015 步骤3)中超滤离心分离的过程为 ： 将步骤2中的反应产物加入滤膜截留分子量为 10,000 的超滤离心管中， 在室温下 14,000-16,000g 离心 15 分钟 ； 被滤膜截留的部分再加 入超纯水或 pH 7-8 碳酸氢铵缓冲液， 振荡后在室温下 14,000-16,000g 离心 15-30 分钟 ； 如此反复清洗 7-9 次。 0016 4) 向样品池中再加入肽 N 糖苷酶 F 的碳酸氢铵缓冲液， 酶解后将肽段从其糖基化 位点处酶。

13、切下来， 经过离心即可获得含糖基化位点的肽段。 0017 步骤 4) 中获得含 N- 连接糖基化位点的肽段的过程为 ： 向滤膜内含有偶联了聚 乙二醇的糖肽样品中加入含肽 N- 糖苷酶 F 的 pH 7.5-8.5 的碳酸氢铵缓冲液， 在 37孵 育 4-12 小时 ； 在室温下 14,000-16,000g 离心 15-30 分钟 ； 再向滤膜内样品管中加入 pH 7.5-8.5 的碳酸氢铵缓冲液， 振荡后在室温下 14,000-16,000g 离心 15-30 分钟 ； 将两次收 取的滤出液收集合并即得到含 N- 连接糖基化位点的肽段。 0018 本发明聚乙二醇偶联结合超滤离心过滤分离方法对。

14、含有 N- 连接糖基化位点的肽 段有特异性富集作用， 应用于混合肽段中 N- 连接糖肽的选择性富集。 0019 本发明的优点为 ： 本发明以单甲氧基聚乙二醇酰肼的酰肼基团与糖肽糖链上氧化 产生的醛基共价偶联， 结合超滤离心分离的方法即可用于 N- 连接糖肽的选择性富集。其方 法简便， 成本低 ； 对 N- 连接糖肽的选择性好， 非特异性吸附的洗脱过程简单。 附图说明 0020 图 1 聚乙二醇偶联结合超滤离心过滤分离富集糖肽方法的示意图。 0021 图 2 辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后的产物， 经聚乙二醇偶联结合超滤离心 分离富集糖肽方法处理得到的产物 (a) 和经商品化糖氧化 / 酰肼法处。

15、理得到的产物 (b) MALDI-TOF MS 分析得到的质谱图 ； 0.05mg 的辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后的产物经 过两种富集方法的处理， 得到相似的产物质谱图， 用聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集 糖肽方法处理后检测到的含 N- 连接糖基化位点的肽段数目增加。这说明本发明所开发的 富集方法对 N- 连接糖肽的富集特异性好， 可以有效的富集肽段混合物中的 N- 连接糖肽。 0022 图3辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后产物， 经滤膜截留分子量10,000Da的超滤 离心管清洗并离心过滤 1 次 (a) 和 6 次 (b)MALDI-TOF MS 分析得到的质谱图。经过 6 次过 滤分离。

16、， 可以将酶解产物中绝大部分非糖肽去除， 说明本发明所开发的超滤分离方法可以 说 明 书 CN 102757992 A 4 3/4 页 5 方便的去除非糖肽的干扰， 简化富集的步骤。 具体实施方式 0023 本 发 明 糖 肽 上 糖 链 的 氧 化 可 参 照 文 献 (Tian Y.， Zhou Y.， et al.， Nat. Protocol.， 2007， 2 ： 334-339) 进行。 0024 具体操作过程为 ： N- 连接糖蛋白质的蛋白酶酶解产物溶于 100L 含有高碘酸钠 的 pH 5-6 的缓冲液 ( 其中含有 100mM 乙酸钠， 150mM 氯化钠， 10mM 高碘酸。

17、钠 ) 中， 在 4避 光反应 1 小时。产物酸化后上样到用 C18 捕集柱上， 捕集柱用 0.1三氟乙酸冲洗 3-10 倍 柱体积， 再用含 0.1三氟乙酸的 50乙腈将保留在捕集柱上的氧化后的糖肽洗脱下来。 洗脱液冷冻干燥， -20保存。 0025 实施例 1 0026 按照如下步骤进行 N- 连接糖肽的富集。 0027 1) 聚乙二醇的偶联反应 ： 将含有 1mg/mL 单甲氧基聚乙二醇酰肼的 100mM 乙酸钠 缓冲液 (pH 5.5， 其中含有 150mM 氯化钠 )400L 加入氧化后的肽段混合物中， 在室温下反 应 12 小时。即可制备得到聚乙二醇偶联的糖肽。反应实例具体参数如下。

18、表 1 所示。 0028 2) 超滤离心分离 ： 含有偶联了聚乙二醇的糖肽和其他非糖肽的水溶液， 加入超滤 离心管中， 滤膜的截留分子量为10,000Da。 在室温下1,400g离心15分钟 ； 再向滤膜内样品 管中加入 400L 水或 pH 8.0 的 100mM 碳酸氢铵缓冲液， 振荡后， 再次在室温下 1,400g 离 心 15 分钟 ； 重复此清洗过程 7-9 次。( 具体参数如下表 1 所示 )。 0029 表 1. 聚乙二醇偶联反应和超滤离心分离参数。 0030 0031 0032 具体应用 ： 0033 富集 N- 连接糖肽的过程为 ： 0.05mg 辣根过氧化物酶经过胰蛋白酶酶。

19、解的产物， 溶解于 pH 5.5 的乙酸钠缓冲液中， 进行偶联反应并经过超滤离心分离去除非糖肽 ； 再加 入 100mM pH 8.0 的碳酸氢铵缓冲液振荡后离心， 反复 7 次 ； 向滤膜内的样品池中加入含有 说 明 书 CN 102757992 A 5 4/4 页 6 2L PNGaseF的pH 8.0碳酸氢铵缓冲液， 于37孵育12小时 ； 产物经过离心收集滤出液。 0034 由图 2 可以看出， 0.05mg 的辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后的产物经过聚乙 二醇偶联结合超滤离心分离富集方法处理， 和经过商品化糖氧化 / 酰肼法处理， 得到相似 的产物质谱图。而且用聚乙二醇偶联结合超滤离。

20、心分离富集糖肽方法处理后检测到的含 N- 连接糖基化位点的肽段数目增加。这说明本发明所开发的富集方法对 N- 连接糖肽的富 集特异性与商品化方法相同， 可以有效的富集肽段混合物中的 N- 连接糖肽。 0035 由图 3 可以看出， 辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后产物， 经过 6 次过滤分离， 就 可以将酶解产物中绝大部分非糖肽去除， 说明本发明所开发的超滤分离方法可以方便的去 除非糖肽的干扰， 简化富集的步骤。 0036 本发明的优点为 ： 是一种普适性的糖肽富集方法， 具有较好的选择性， 操作步骤简 单， 非特性吸附的清洗比较容易， 成本较低。 说 明 书 CN 102757992 A 6 1/3 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102757992 A 7 2/3 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757992 A 8 3/3 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 102757992 A 9 。