一种5-还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A及其制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101671379 B (45)授权公告日 2011.06.22 CN 101671379 B *CN101671379B* (21)申请号 200910012707.3 (22)申请日 2009.07.22 C07H 15/26(2006.01) C07H 1/08(2006.01) A61K 31/7048(2006.01) A61P 13/08(2006.01) (73)专利权人 大连大学 地址 116622 辽宁省大连市经济技术开发区 学府大街 10 号 (72)发明人 冯宝民 王恵国 史丽颖 王永奇 (74)专利代理机构 大连八方知识产权代理有限 公司 21。

2、226 代理人 高杰 CN 1850979 A,2006.10.25, 全文 . (54) 发明名称 一种5-还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷 A 及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方 法， 具体涉及一种 5- 还原酶抑制剂 - 荨麻裂环 木脂素苷 A 及其制备方法。本发明在前期研究的 基础上， 从三角叶荨麻中分离得到了荨麻裂环木 脂素苷 A， 该成分的结构不同于上述木脂素类成 分， 为一种新的裂环木脂素类成分， 其分子结构式 如下 ：上述的 5- 还原酶抑制 剂 - 荨麻裂环木脂素苷 A 的制备是以三角叶荨麻 为原料， 5-还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A 对抑。

3、制 5- 还原酶作用研究发现具有较强活性， 是一种潜在的抗前列腺增生药物成分。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王少华 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 101671379 B1/1 页 2 1. 一种 5- 还原酶抑制剂 - 荨麻裂环木脂素苷 A， 其特征在于， 其分子结构式如下 ： 。 2.权利要求1所述的一种5-还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A的制备方法， 其特 征在于， 该方法是以三角叶荨麻为原料， 步骤如下 ： (1) 将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后， 用质量浓度为 95的工业乙醇回流提 取， 过滤。

4、后减压浓缩 ； (2) 将醇提取物用 50-90的水混悬， 依次用石油醚、 乙酸乙酯、 水饱和正丁醇萃取， 各 萃取三次 ； (3) 正丁醇萃取物经大孔树脂 D101 分离， 采用质量浓度为 30的乙醇洗脱， 收集洗脱 液 ； (4) 乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化， 采用体积比为氯仿甲醇 30 1、 10 1、 5 1、 3 1、 1 1 的梯度洗脱， 收集洗脱液 ； (5)步骤(4)的洗脱液经反相硅胶柱色谱分离纯化， 采用体积比为甲醇水37的 溶液洗脱， 每 15-30ml 收集成 1 份， 收集第 15-20 份洗脱液， 合并浓缩后得到荨麻裂环木脂 素苷 A。 权 利 要 求 书 CN 。

5、101671379 B1/6 页 3 一种5-还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A及其制备方 法 技术领域 0001 本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方法， 具体涉及一种 5- 还原酶抑制 剂 - 荨麻裂环木脂素苷 A 及其制备方法。 背景技术 0002 荨麻属植物中含有大量的木脂素类成分， 从中鉴定出了 13 个木脂素类化合物 ： (+)- 新橄榄树脂素、 (-)- 开环异落叶松脂素、 异落叶松脂素、 松醋醇、 3， 4- 二香草基四氢吠 喃、 新橄榄树脂素 -4-O-D- 葡萄糖苷、 9- 乙酰基 - 新橄榄树脂素、 9- 乙酰基 - 新橄榄树 脂素 -4-O-D- 葡萄糖苷、 9， 9 。

6、- 二乙酰基 - 新橄榄树脂素、 9， 9 - 二乙酰基 - 新橄揽树 脂素 -4-O-D- 葡萄糖苷、 (-)- 开环异落叶松脂素 -9-O-D- 葡萄糖苷、 (-)- 开环异落 叶松脂素 -4-O-D- 葡萄糖苷、 新橄榄树脂素 -9-O-D- 葡萄糖苷。其结构类型主要有 新橄榄树脂素及其苷类和开环落叶松脂素、 落叶松脂素及其苷类， 其中新橄榄树脂素及其 苷类结构如下 ： 0003 0004 新橄榄树脂素 新橄榄树脂素 -4-O-D- 葡萄糖苷 0005 0006 新橄榄树脂素-9-O-D-葡萄糖苷 9-乙酰基-新橄榄树脂素 0007 0008 9， 9- 二乙酰基 - 新橄榄树脂素、 9。

7、- 乙酰基 - 新橄榄树脂素 -4-O-D- 葡萄糖苷 0009 说 明 书 CN 101671379 B2/6 页 4 0010 9， 9- 二乙酰基一新橄揽树脂素 -4-O-D- 葡萄糖苷 橄榄脂素 0011 开环落叶松脂素、 落叶松脂素及其苷类结构如下 ： 0012 0013 (-)- 开环异落叶松脂素 (-)- 开环异落叶松脂 素 -9-O-D- 葡萄糖苷 0014 0015 ()- 开环异落叶松脂素 -4-O-D- 葡萄糖苷 5- 甲氧基开环异 落叶松脂素 0016 0017 异落叶松脂素 0018 有研究表明从大荨麻根中分离到 (+)- 新橄榄树脂素、 (-)- 开环异落叶松脂素、。

8、 脱 氢二松柏醇、 异落叶松脂素、 松脂醇和 3， 4- 二香草基四氢呋喃， 并检验了以上几种物质体 外与 SBHG 的亲和作用， 结果除松脂醇外， 其余化合物都有亲合力， 其中 3， 4- 二香草基四氢 说 明 书 CN 101671379 B3/6 页 5 呋喃的亲合作用最强， 浓度为 250g/ml 时抑制率为 95。提示大荨麻根中木脂素类是治 疗 BPH 的活性成分之一。 0019 本发明的课题组曾对国产的 8 种荨麻属植物根的不同提取物进行了抗前列腺增 生的生物活性筛选， 结果表明滇减荨麻根的 20和 95乙醇提取物能显著地抑制前列腺 增生大鼠的病变组织。 发明内容 0020 本发明。

9、的目的是在前期研究的基础上， 为了进一步研究提取物抗前列腺增生的活 性部位和作用机理， 选取前列腺组织中一个关键酶 -5- 还原酶为作用靶点， 采用酶联免 疫 (Enzyme-linked immunospecific assay ELISA) 的方法， 建立抑制 5- 还原酶体外模 型， 从大鼠前列腺组织中提取 5- 还原酶， 与底物睾酮以及供氢体 NADPH 共同组成了一种 微量反应体系， 利用酶标仪检测双氢睾酮(DHT)的含量， 以DHT的含量来判断荨麻提取物是 否有抑制 5- 还原酶的活性。 0021 本发明从三角叶荨麻中分离得到了荨麻裂环木脂素苷 A， 该成分的结构不同于上 述木脂素。

10、类成分， 为一种新的裂环木脂素类成分， 对抑制 5- 还原酶作用研究发现具有较 强活性， 是一种潜在的抗前列腺增生药物成分。 0022 本发明的技术方案是 ： 一种 5- 还原酶抑制剂 - 荨麻裂环木脂素苷 A， 其分子结 构式如下 ： 0023 0024 上述的 5- 还原酶抑制剂 - 荨麻裂环木脂素苷 A 的制备方法是以三角叶荨麻为 原料， 制备步骤如下 ： 0025 (1) 将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后， 用质量浓度为 95的工业乙醇回流 提取， 过滤后减压浓缩 ； 0026 (2) 将醇提取物用 50-90的水混悬， 依次用石油醚、 乙酸乙酯、 水饱和正丁醇萃 取， 各萃取三次 。

11、； 0027 (3) 正丁醇萃取物经大孔树脂 D101 分离， 采用质量浓度为 30的乙醇洗脱， 收集 洗脱液 ； 0028 (4) 乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化， 采用体积比为氯仿甲醇 30 1、 说 明 书 CN 101671379 B4/6 页 6 10 1、 5 1、 3 1、 1 1 的梯度洗脱， 收集洗脱液 ； 0029 (5) 步骤 (4) 的洗脱液经反相硅胶柱色谱分离纯化， 采用体积比为甲醇水 37的溶液洗脱， 每15-30ml收集成1份， 收集第15-20份洗脱液， 合并浓缩后得到荨麻裂 环木脂素苷 A。 0030 采用核磁共振 (NMR) 等波谱技术测定其结构， 荨麻裂环。

12、木脂素苷 A 的波谱数据见 表 1。 0031 表 1. 荨麻裂环木脂素苷 A 的 1H NMR 利13C NMR 0032 0033 荨麻裂环木脂素苷 A 可以用于制备抗前列腺增生药物， 将有效剂量的荨麻裂环木 脂素苷 A 与药用载体混合并制成适当剂型的药物。 0034 本发明的有益效果是 ： 原料为纯天然植物根， 安全易得， 方法简单易操作， 不引入 有毒物质， 成本低廉， 在抗前列腺增生药物研究开发上具有非常重要的意义。 具体实施方式 0035 下面以具体实施例对本发明作进一步的说明， 但并不影响本发明的保护范围。 0036 实施例 1 0037 三角叶荨麻药材采集自四川省阿巴州。 00。

13、38 从三角叶荨麻中制备荨麻裂环木脂苷 A 方法步骤如下 ： 说 明 书 CN 101671379 B5/6 页 7 0039 (1) 将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后， 用质量浓度为 95的工业乙醇回流 提取， 料液比 (kg/l) 1 8， 提取温度 90， 提取时间 3h， 提取次数 3 次， 合并提取液， 过 滤后减压浓缩至无醇味 ； 0040 (2) 将醇提物 200g 用 2L 温度为 60的水混悬， 依次用 2L 的石油醚、 乙酸乙酯、 水 饱和正丁醇萃取， 各萃取 3 次。 0041 (3) 正丁醇萃取物 30g 经 D101 大孔树脂 (1kg) 分离， 采用质量浓度为 3。

14、0的乙醇 洗脱， 收集洗脱液 10L ； 0042 (4) 乙醇洗脱液浓缩至干得 5g， 用硅胶柱色谱 ( 硅胶 150g) 分离纯化， 采用体积比 为氯仿甲醇 30 1、 10 1、 5 1、 3 1、 1 1 梯度洗脱， 收集每个比例洗脱液 1L ； 0043 (5) 步骤 (4) 的洗脱液浓缩至干得 1g， 然后经反相硅胶柱色谱 ( 反相硅胶 30g) 分 离纯化， 采用体积比甲醇水 3 7 的溶液洗脱， 每 25ml 收集成 1 份， 合并 15-20 份洗脱 液， 浓缩后得到荨麻裂环木脂素苷 Al20mg。 0044 实施例 2 0045 5- 还原酶抑制作用实验步骤如下 ： 004。

15、6 (1)5- 还原酶的制备 ： 0047 雄性SD大鼠3只， 体重20010g， 大连医科大学实验动物中心提供， 禁食不禁水过 夜处死， 迅速取出腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎， 用预冷的匀浆液 ( 蔗糖 0.73molL-1， 氯化钙 1.91mmol L-1) 在玻璃匀浆器中匀浆， 在 4下以 10000rpm 低温高速离心 20min， 取 上清液再以 16000rpm 低温高速离心 30min， 即得 5- 还原酶提取物。采用 lowry 法测定蛋 白含量， 以酶提物中的总蛋白含量表示 5- 还原酶提取物的含量， 将提取物放入小离心管 在 -70下保存， 备用。 0048 (2)5- 。

16、还原酶抑制活性测定 ： 0049 操作分两部分完成， 即将反应成分 37恒温缓冲液、 睾酮、 实施例 1 制备的荨麻 裂环木脂苷 A 样品、 阳性对照药、 NADPH 及酶组织液依次加入 96 孔板内， 使之微量化， 设置 不同反应孔和对照孔板。反应温度为 37 ( 相对饱和湿度 )， 反应时间为 60min ； 0050 采用 EL ISA 法定量测定产物 DHT， 以产物的生成量大小反映酶活性的强弱。受 试样品管中 DHT 的含量低于酶反应管中 DHT 含量时， 则视为具有抑制 5- 还原酶的活性。 检测方法及计算参照睾酮试剂盒 ( 购于 Adlitteram Diagnostic Lab。

17、oratories 公司 ) 使 用说明进行。所有实验孔均为双复孔操作。在已经确定的反应体系基础上， 辅酶 NADPH 浓 度为 1mmolL-1， 睾酮浓度为 0.5molL-1， 结合睾酮试剂盒微量测定的特点， 将整个反应 体系的总量定为 200l。 0051 酶反应体系中各组分的原始浓度分别为 ： 缓冲溶液 (PBS 20mmolL-1， 蔗 糖 0.2molL-1， EDTA Na21mmolL-1， pH6.8) ； NADPH 浓 度 (20mmolL-1) ；粗 酶 浓 度 (4.3mgml-1) ； 睾酮浓度 (20molL-1) ； 非那雄胺 (1.3mmolL-1)。测定结果见表 2。 0052 表 2 荨麻裂环木脂素苷 A 抑制 5- 还原酶作用 0053 说 明 书 CN 101671379 B6/6 页 8 0054 从上表可以看出荨麻裂环木脂素 A 能显著抑制 DHT 的生成， 与阳性药非那雄胺相 当。 说 明 书 。