制备泽拉木醛的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101519421 B (45)授权公告日 2012.05.23 CN 101519421 B *CN101519421B* (21)申请号 200810033907.2 (22)申请日 2008.02.26 C07J 63/00(2006.01) A61K 31/56(2006.01) A61K 36/37(2006.01) A61P 31/00(2006.01) (73)专利权人 上海医药工业研究院 地址 200040 上海市北京西路 1320 号 (72)发明人 肖婕妤 杨培明 欧阳丹薇 倪翔 许海燕 陈佳 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256。

2、 代理人 徐雁漪 谢燕军 Chandra B. Gamlath,et al. Studies on Terpenoids and Steroids. Part 10.Structures of Four New Natural Phenolic D:A-friedo-24-Noroleanane Triterpenoids. J. CHEM. SOC. PERKIN TRANS. I .1987,2849-2854. G.M.Kamal B. Gunaherath,et al. STRUCTURE OF TWO NEW PHENOLIC 24-NOR-D:A-FRIEDO-DLEANANES 。

3、RELATED TO ZEYLASTERONE:A PARTIAL SYNTHESIS OF TRIMETHYLZEYLASTERONE.Tetrahedron Letters .1983, 第 24 卷 ( 第 19 期 ),2025-2028. (54) 发明名称 制备泽拉木醛的方法 (57) 摘要 制备高纯度泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所 述泽拉木醛从南蛇藤植物中分离得到。优选用高 速逆流色谱法。该方法分离条件温和， 分离效率 高， 且分离时间短， 能得到高纯度的泽拉木醛。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李士坤 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民。

4、共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述泽拉木醛从南蛇藤中分离得到。 2. 如权利要求 1 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 采用高速逆流色谱法、 柱层 析法或薄层层析法将所述泽拉木醛从南蛇藤中分离得到。 3. 如权利要求 2 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 采用高速逆流色谱法将所 述泽拉木醛从南蛇藤中分离得到。 4. 如权利要求 3 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述方法包括 ： 制备构成 固定相和流动相的溶剂体系 ； 设置恒温循环器的温度 ； 调节流动相流速 ； 。

5、调节主机转速 ； 其特征在于， 所述溶剂体系由石油醚、 乙醇和水组成， 三种组分的体积比为 9 12 9 10 1 1.1， 该溶剂体系的上相为固定相， 下相为流动相。 5. 如权利要求 4 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述恒温循环器的温度为 22 27。 6. 如权利要求 5 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述恒温循环器的温度为 25。 7.如权利要求4所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述流动相的流速为1.0 2.2ml/min。 8. 如权利要求 7 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述流动相的流速为 1.6ml/min。 9. 如权利要求 4。

6、 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述主机转速为 800 880rpm。 10. 如权利要求 9 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述主机转速为 840rpm。 11. 如权利要求 4 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述溶剂体系的三种组分 的体积比为 10 10 1。 12. 如权利要求 4 所述的制备泽拉木醛的方法， 其特征在于， 所述溶剂体系的三种组分 的体积比为 10 9 1。 权 利 要 求 书 CN 101519421 B 2 1/5 页 3 制备泽拉木醛的方法 技术领域 0001 本发明涉及从南蛇藤植物中分离得到高纯度泽拉木醛的方法， 尤其涉及用高速。

7、逆 流色谱法 (HSCCC) 从南蛇藤植物中分离得到高纯度泽拉木醛的方法。 0002 背景技术 0003 南蛇藤 (Celastrus orbiculatus Thumb) 是我国民间常用的一种植物药， 有驱风 除湿， 活血解毒消肿功效， 主治筋骨疼痛， 四肢麻木， 风湿性关节炎， 腰腿痛， 闭经， 小儿惊 风， 痧症， 痢疾， 肿毒， 跌打损伤 ( 守立人 . 现代中药学大辞典 ( 下册 )M. 北京 ： 人民卫生 出版社.2001.1457)。 南蛇藤主要药用成分有倍半萜及倍半萜衍生物、 生物碱、 三萜、 黄酮等 四类物质， 其中三萜类成分主要存在于南蛇藤属植物的根皮中， 主要类型有羽扇豆。

8、烷型和 齐墩果酸型。泽拉木醛 (Zeylasteral) 是药理活性很强的五环三萜类化合物。 0004 泽拉木醛有抗菌活性， 报道有抗革兰氏阳性菌、 Candida albicans 菌、 Bacillus subtilis 菌 等 的 活 性 (de Len L， Beltrn B， Moujir L.Antimicrobialactivity of 6-oxophenolic triterpenoids.Mode of action against Bacillussubtilis.Planta MedJ.2005 Apr ； 71(4) ： 313-9)。 0005 泽拉木醛药理活性显著。

9、， 但其在自然界中存在量不多， 少有报道分离得到此化合 物， 而且其易混杂杂质， 因此至今有大量研究人员正在探索理想的分离纯化方法。 0006 文献报道了用柱层析方法得到泽拉木醛单体的方法 (Gamlath， C ； Studies on terpenoids and steroids.Part 10.Structures of four new naturalphenolic D ： A-friedo-24-noroleanane triterpenoids.J Chem Soc， Perkin Trans1 1987， 2849) ： 从 卫矛科植物kokoona zeylanica植物茎。

10、表皮， 分别用热石油醚和热苯溶剂提取后浓缩， 石油 醚部位经过柱层析后得到泽拉木醛。但 该方法操作步骤繁琐， 过程中损失大， 从而回收率 低。 0007 高速逆流色谱 (High Speed Countercurrent Chromatography， 简称 HSCCC) 是国 际上于上世纪 80 年代以来在液 - 液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术， 其分离原 理是利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力， 使螺旋柱中互不相溶的两相不断混 合， 达到稳定的流体动力学平衡态， 此时在螺旋柱中任何一部分， 两相溶剂都反复进行着混 合和静置的分配过程， 这一过程频率极高， 当柱心以800rp。

11、m旋转时， 频率超过每秒13次。 流 动相不断地穿过固定相， 同时保留其中的一相 ( 固定相 )， 利用恒流泵连续输入另一相 ( 流 动相 )， 流动相载着溶质 ( 样品 ) 进入螺旋柱并不断反复穿过固定相， 使样品在两相之间也 不断反复地进行分配， 由于样品中各组分在两相中分配系数不同， 导致在螺旋柱中的移动 速度不同， 因而能使样品各组分按分配系数的次序， 依次得到分离。 0008 高速逆流色谱作为一种新型的分离技术， 有许多优点是传统液 - 固色谱无法比拟 的， 因而有很广阔的应用前景。首先， 它的流动相、 间定相均为液体， 不需要固体载体， 避免 了液 - 固色谱常会造成的固体载体对样。

12、品的不可逆吸附， 可以保证样品在不损失任何一种 组分的情况下得到分离， 理论上样品回收率相当高 ； 其次， 它的分离效率高， 可以达到几千 个理论塔板数， 尤其在天然产物组分分离提取中有较高的分离度， 有的样品经过一次分离 说 明 书 CN 101519421 B 3 2/5 页 4 就可以得到一个甚至多个单体， 并且分离时间也短， 一般是几个小时即可完成一次分离 ： 此 外， 它使用常规试剂， 有广泛的液 - 液分配体系可供选择， 体系更换方便、 快捷 ： 它的进样量 大， 可以从毫克到克量级， 进样体积可达 20mL 以上， 这对于样品的纯化制备显示出惊人的 优势。 0009 但欲用 HS。

13、CCC 进行成功的分离， 选择适宜的溶剂系统非常重要。不同的溶剂系统， 具有不同的上、 下相之比， 其粘度、 极性、 密度等性质相差甚远， 对相同的成分具有不同的溶 解、 分配能力， 形成分配系数的差异， 对分离效果产生不同的影响。 目前， 溶剂体系的选择还 没有一套完整的理论依据。另外， 在选定了溶剂体系后， 有时需要对四个仪器运行参数 ( 温 度、 转速、 流动相流速、 进样体积 ) 进行设定。 发明内容 0010 由于泽拉木醛在自然界中存在量不多， 少有报道分离得到此化合物， 而且其容易 混杂杂质， 因此至今有大量研究人员正在探索理想的分离纯化方法。本发明提供一种制备 高纯度泽拉木醛的方。

14、法， 其特征在于， 所述泽拉木醛从南蛇藤植物中分离得到。 0011 泽拉木醛为首次从南蛇藤植物中提取分离得到。 可以使用本领域技术人员所熟知 的技术， 例如高速逆流色谱法、 柱层析法或薄层柱层析法将泽拉木醛从南蛇藤植物中提取 分离。 0012 采用柱层析法将泽拉木醛从南蛇藤植物中提取分离的具体操作步骤如下 ： 0013 南蛇藤干燥根皮用二氯甲烷冷浸提取， 回收溶剂得粗提干燥物 ( 样品 )， 用硅胶拌 样并上柱， 用流动相洗脱， 合并流份， 浓缩后得到纯泽拉木醛。 0014 采用薄层层析法将泽拉木醛从南蛇藤植物中提取分离的具体操作步骤如下 ： 0015 南蛇藤干燥根皮用二氯甲烷冷浸提取， 回收。

15、溶剂得粗提干燥物 ( 样品 )， 精确称取 二氯甲烷粗提干燥物并溶解， 全部点样在自制薄层硅胶板上， 用展开剂展开， 泽拉木醛斑点 约走至薄层板中部， 刮下含该斑点的硅胶层， 洗脱此硅胶层， 浓缩后得到纯泽拉木醛。 0016 本发明优选采用高速逆流色谱法将泽拉木醛从南蛇藤植物中提取分离。 0017 采用高速逆流色谱法制备高纯度泽拉木醛时， 该方法包括 ： 制备构成固定相和流 动相的溶剂体系 ； 设置恒温循环器的温度 ； 调节流动相流速 ； 调节主机转速 ； 其特征在于， 所述溶剂体系由石油醚、 乙醇和水组成， 三种组分的体积比为 9 12 9 10 1 1.1， 该溶剂体系的上相为固定相， 下。

16、相为流动相。 0018 在不破坏体系平衡的调节下， 可在上述范围内任意调节石油醚乙醇水的体积 比， 优选的体积比为 10 10 1 或 10 9 1 或 11 9 1.1。 0019 恒温循环器的温度须控制在 22 27， 优选 25 ； 主机转速须控制在 800 880rpm范围内， 优选840rpm ； 流动相的流速须控制在1.02.2ml/min范围内， 优选1.6ml/ min。 0020 其具体操作步骤如下 ： 0021 南蛇藤干燥根皮 ( 湖南省南部山区所产 ) 用二氯甲烷冷浸提取， 每次冷浸 24 小 时， 再回收溶剂， 重复三次， 得褐色干燥粉末状物质， 即为粗提干燥物， 精确。

17、称取二氯甲烷粗 提干燥物， 用固定相溶解样品， 开启恒温循环器并设置温度， 用双泵等比例同时泵入流动相 ( 下相 ) 和固定相 ( 上相 )， 当溶剂从管路出口流出时， 停止泵入固定相， 设定流动相流速， 说 明 书 CN 101519421 B 4 3/5 页 5 同时启动主机电机， 调节转速， 十几分钟后， 管柱内溶剂达成动态平衡， 管柱出口处只有流 动相流出。 通过进样器注入样品， 设定检测器的波长为254nm， 在进样后约90分钟至380分 钟出现泽拉木醛峰， 收集该流份， 浓缩后得到纯泽拉木醛单体。 0022 采用本发明可以从南蛇藤植物中分离得到纯度较高的泽拉木醛。 特别是采用高速 。

18、逆流色谱法制备高纯度泽拉木醛时， 由于采用了合理的溶剂体系， 控制主机转速和流动相 流速等工艺条件， 可从南蛇藤植物中分离得到高纯度的泽拉木醛。且该分离纯化过程条件 温和， 分离时间短， 由于不引入酸碱， 从而减少了化合物化学性质的变化， 保持化合物的稳 定而减少损失， 化合物不流失也不存在死吸附。 具体实施方式 0023 实施例 1 0024 高速逆流色谱法得到泽拉木醛 ： 0025 南蛇藤干燥根皮 100 克 ( 湖南省南部山区所产 ) 用二氯甲烷冷浸提取， 每次冷浸 24 小时， 再回收溶剂， 重复三次， 得褐色干燥粉末状物质， 即为粗提干燥物， 精确称取二氯甲 烷粗提干燥物 11.2 。

19、克。 0026 精确称取二氯甲烷粗提干燥物 1 克， 用石油醚乙醇水 ( 溶剂体积比 10 10 1) 溶剂系统的上相溶解样品， 开启恒温循环器， 设置温度为 25 摄氏度， 以该溶 剂系统上相为固定相， 下相为流动相， 用双泵等比例同时泵入流动相 ( 下相 ) 和固定相 ( 上 相 )， 当溶剂从管路出口流出时， 停止泵入固定相， 设定流动相流速为 2ml/min， 同时开启主 机电机， 调节转速为 880rpm， 十几分钟后， 管柱内溶剂系统达成动态平衡， 管柱出口处只有 流动相流出。通过进样器注入样品， 设定波长为 254nm， 在进样后约 150 分钟出现泽拉木醛 峰， 收集该流分， 。

20、浓缩后得到纯泽拉木醛 35mg， 纯度大于 99.5， 相对进样前收率为 3.5， 相对于药材 0.392。 0027 实施例 2 0028 高速逆流色谱法得到泽拉木醛 ： 0029 精确称取二氯甲烷粗提干燥物 1.2 克， 用石油醚乙醇水 ( 溶剂体积比 10 9 1) 溶剂系统的上相溶解样品， 开启恒温循环器， 设置温度为 24 摄氏度， 以该溶剂 系统上相为固定相， 下相为流动相， 用双泵等比例同时泵入流动相 ( 下相 ) 和固定相 ( 上 相 )， 当溶剂从管路出口流出时， 停止泵入固定相， 设定流动相流速为 1.8ml/min， 同时开启 主机电机， 调节转速为 860rpm， 十几。

21、分钟后， 管柱内溶剂系统达成动态平衡， 管柱出口处只 有流动相流出。通过进样器注入样品， 设定波长为 254nm， 在进样后约 250 分钟出现泽拉 木醛峰， 收集该流分， 浓缩后得到纯泽拉木醛 38mg， 纯度大于 98.5， 相对进样前收率为 3.16， 相对于药材 0.355。 0030 实施例 3 0031 高速逆流色谱法得到泽拉木醛 ： 0032 精确称取二氯甲烷粗提干燥物 1.6 克， 用石油醚乙醇水 ( 溶剂体积比 9 10 1) 溶剂系统的上相溶解样品， 开启恒温循环器， 设置温度为 23 摄氏度， 以该溶剂 系统上相为固定相， 下相为流动相， 用双泵等比例同时泵入流动相 ( 。

22、下相 ) 和固定相 ( 上 相 )， 当溶剂从管路出口流出时， 停止泵入固定相， 设定流动相流速为 2.2ml/min， 同时开 说 明 书 CN 101519421 B 5 4/5 页 6 启主机电机， 调节转速为 840rpm， 十几分钟后， 管柱内溶剂系统达成动态平衡， 管柱出口处 只有流动相流出。通过进样器注入样品， 设定波长为 254nm， 在进样后约 90 分钟出现泽拉 木醛峰， 收集该流分， 浓缩后得到纯泽拉木醛 45mg， 纯度大于 98.5， 相对进样前收率为 2.813， 相对于药材 0.315。 0033 实施例 4 0034 高速逆流色谱法得到泽拉木醛 ： 0035 精。

23、确称取二氯甲烷粗提干燥物 0.8 克， 用石油醚乙醇水 ( 溶剂体 积比 10 10 1.1) 溶剂系统的上相溶解样品， 开启恒温循环器， 设置温度为 26 摄氏度， 以该 溶剂系统上相为固定相， 下相为流动相， 用双泵等比例同时泵入流动相 ( 下相 ) 和固定相 ( 上相 )， 当溶剂从管路出口流出时， 停止泵入固定相， 设定流动相流速为 1.4ml/min， 同时 开启主机电机， 调节转速为 820rpm， 十几分钟后， 管柱内溶剂系统达成动态平衡， 管柱出口 处只有流动相流出。通过进样器注入样品， 设定波长为 254nm， 在进样后约 220 分钟出现 泽拉木醛峰， 收集该流分， 浓缩后。

24、得到纯泽拉木醛 27mg， 纯度大于 98， 相对进样前收率为 3.375， 相对于药材 0.378。 0036 实施例 5 0037 高速逆流色谱法得到泽拉木醛 ： 0038 精确称取二氯甲烷粗提干燥物 1.9 克， 用石油醚乙醇水 ( 溶剂体积比 12101.1)溶剂系统的上相溶解样品， 开启恒温循环器， 设置温度为22摄氏度， 以该溶 剂系统上相为固定相， 下相为流动相， 用双泵等比例同时泵入流动相 ( 下相 ) 和固定相 ( 上 相 )， 当溶剂从管路出口流出时， 停止泵入固定相， 设定流动相流速为 1ml/min， 同时开启主 机电机， 调节转速为 800rpm， 十几分钟后， 管柱。

25、内溶剂系统达成动态平衡， 管柱出口处只有 流动相流出。通过进样器注入样品， 设定波长为 254nm， 在进样后约 380 分钟出现泽拉木醛 峰， 收集该流分， 浓缩后得到纯泽拉木醛 62mg， 纯度大于 99， 相对进样前收率为 3.26， 相对于药材 0.365。 0039 实施例 6 0040 高速逆流色谱法得到泽拉木醛 ： 0041 精确称取二氯甲烷粗提干燥物 2 克， 用石油醚乙醇水 ( 溶剂体积比 11 9 1.1) 溶剂系统的上相溶解样品， 开启恒温循环器， 设置温度为 27 摄氏度， 以该 溶剂系统上相为固定相， 下相为流动相， 用双泵等比例同时泵入流动相 ( 下相 ) 和固定相。

26、 ( 上相 )， 当溶剂从管路出口流出时， 停止泵入固定相， 设定流动相流速为 2.2ml/min， 同时 开启主机电机， 调节转速为 870rpm， 十几分钟后， 管柱内溶剂系统达成动态平衡， 管柱出口 处只有流动相流出。通过进样器注入样品， 设定波长为 254nm， 在进样后约 190 分钟出现泽 拉木醛峰， 收集该流分， 浓缩后得到纯泽拉木醛 68mg， 纯度大于 98.5， 相对进样前收率为 3.40， 相对于药材 0.381。 0042 实施例 7 0043 柱层析方法得到泽拉木醛 ： 0044 南蛇藤干燥根皮100克用二氯甲烷冷浸提取， 每次冷浸24小时， 再回收溶剂， 重复 三次。

27、， 得褐色干燥粉末状物质， 即为粗提干燥物， 精确称取二氯甲烷粗提干燥物11.4克(样 品)， 用200-300目的硅胶15克拌样， 用1500克200-300目硅胶上柱， 流动相石油醚乙酸 说 明 书 CN 101519421 B 6 5/5 页 7 乙酯 ( 溶剂体积比 10 1) 洗脱， 得到约 180 个流份， 第 75-94 流份合并浓缩后得到纯泽拉 木醛 273mg， 纯度约为 95， 相对进样前收率为 3.11， 相对于药材 0.273。 0045 实施例 8 0046 柱层析方法得到泽拉木醛 ： 0047 南蛇藤干燥根皮100克用二氯甲烷冷浸提取， 每次冷浸24小时， 再回收溶。

28、剂， 重复 三次， 得褐色干燥粉末状物质， 即为粗提干燥物， 精确称取二氯甲烷粗提干燥物10.9克(样 品 )， 用 200-300 目的硅胶 15 克拌样， 用 1500 克 200-300 目硅胶上柱， 流动相石油醚丙 酮 ( 溶剂体积比 12 1) 洗脱， 得到约 200 个流份， 第 83-110 流份合并浓缩后得到纯泽拉 木醛 260mg， 纯度约为 95.5， 相对进样前收率为 2.83， 相对于药材 0.260。 0048 实施例 9 0049 薄层层析方法得到泽拉木醛 ： 0050 南蛇藤干燥根皮 100 克用二氯甲烷冷浸提取， 每次冷浸 24 小时， 再回收溶剂， 重 复三次。

29、， 得褐色干燥粉末状物质， 即为粗提干燥物， 精确称取二氯甲烷粗提干燥物 11.3 克 (样品)， 精确称取二氯甲烷粗提干燥物1克并溶解， 全部点样在自制薄层硅胶板上， 用石油 醚乙酸乙酯 ( 溶剂体积比 3 1) 作展开剂， 泽拉木醛斑点约走至薄层板中部， 刮下含该 斑点的硅胶层， 用甲醇洗脱此硅胶层， 浓缩后得到纯泽拉木醛 31.5mg， 纯度约为 97， 相对 进样前收率为 3.15， 相对于药材 0.356。 0051 实施例 10 0052 薄层层析方法得到泽拉木醛 ： 0053 南蛇藤干燥根皮 100 克用二氯甲烷冷浸提取， 每次冷浸 24 小时， 再回收溶剂， 重 复三次， 得褐色干燥粉末状物质， 即为粗提干燥物， 精确称取二氯甲烷粗提干燥物 11.3 克 (样品)， 精确称取二氯甲烷粗提干燥物1克并溶解， 全部点样在自制薄层硅胶板上， 用石油 醚丙酮 ( 溶剂体积比 7 2) 作展开剂， 泽拉木醛斑点约走至薄层板中部， 刮下含该斑点 的硅胶层， 用甲醇洗脱此硅胶层， 浓缩后得到纯泽拉木醛 32.1mg， 纯度约为 97， 相对进样 前收率为 3.21， 相对于药材 0.362。 说 明 书 CN 101519421 B 7 。