一种在大肠杆菌中分泌表达重组人粒细胞集落因子的方法.pdf

本发明涉及一种在大肠杆菌分泌型表达重组人粒细胞集落因子(rHG-CSF)，该载体通过在外源蛋白的N端添加DsbA信号肽(SEQ ID NO：1)，并使用λPL启动子，可构建一种周质腔分泌型表达重组蛋白的载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过温度诱导实现外源蛋白在大肠杆菌周质腔中表达。该方法表达量高、分泌效率高，适用于高效稳定地分泌表达多种外源基因。

1.  一种周质腔分泌型表达表达重组人粒细胞集落此刺激因子的方法，其结构如图1所示。其特征在于蛋白基因的N端含有信号肽。

2.  权利要求1的表达方法，其中所述信号肽是DsbA信号肽SEQ ID NO：1，使用λP_L启动子，利用温度调控诱导外源基因表达。

3.  权利要求1、2所述方法的用途，其特征在于通过信号肽引导重组人粒细胞集落因子rHG-CSF在细胞周质中表达，有利于形成可溶有活性蛋白，不需破菌，直接从周质腔提取蛋白。

一种在大肠杆菌中分泌表达重组人粒细胞集落因子的方法
技术领域
本发明涉及一种大肠杆菌周质腔分泌型表达重组人粒细胞集落因子(G-CSF)方法，更具体地，涉及一种通过在G-CSF的N端添加DsbA信号肽(MKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQID NO：1))，并使外源蛋白在大肠杆菌周质腔中表达的新型表达载体；这种表达载体的说明及应用。
技术背景
基因工程重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)，主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症.此外还用于自身骨髓移植、某些类型的白血病、艾滋病的白细胞减少和再生障碍性贫血等，均显示具有显著的疗效。目前大多通过大肠杆菌表达，表达量虽高，但形成包涵体，需经过变性复性才能得到活性蛋白，收率很低，N端甲硫氨酸不能去除。
采用原核表达体系(主要是大肠杆菌表达体系)具有许多独特的优点。比如遗传背景清楚、细胞生长迅速、发酵周期短、易于筛选和基因重组操作、表达系统较为丰富等。但是原核表达体系也存在一些缺点：如外源蛋白无法糖基化和易于形成包涵体等。外源蛋白形成的包涵体必须经过变性、再折叠复性，才能得到活性蛋白产物。上述过程操作烦琐、复性效率低，对于不同的外源蛋白需要分别进行优化。因此，如果能够采用原核表达体系实现外源蛋白的胞内可溶表达或周质腔分泌表达，那么在实践应用中将会大大提高工作效率，节约生产成本。
人们采取过了多种方式促进外源蛋白的可溶表达。与谷胱甘肽(GST)或硫氧环蛋白融合表达，对部分外源蛋白能够起到促可溶作用；利用蛋白质二硫键形成相关蛋白、脯氨酰顺反异构酶和其他分子伴侣的辅助折叠作用，设计表达载体，能够明显促进外源蛋白的胞内可溶表达。但是，胞内可溶表达方式也具有比较明显的缺点：胞内属还原性环境，不利于外源蛋白形成正确的二硫键桥，进而影响正确构像的形成，而且需要超声破碎或压力破碎细胞壁才能释放胞内可溶表达组分，不利于大规模培养和纯化。比较而言，因为周质腔属氧化型环境，有利于形成正确的二硫键桥，而且提取周质腔表达组分时不需要破碎细胞壁，能够大幅度降低纯化成本，所以周质腔分泌型表达是一种理想的表达方式。通常将外源蛋白与适当的信号肽融合，借助信号肽的引导作用将外源蛋白分泌到周质腔中。控制表达载体的拷贝数，选择合适的启动子和培养基，采用适当诱导表达方式和培养条件(培养温度、诱导时机和诱导时间)，会改善周质腔分泌型表达的效率。
实验证明，连接到信号肽后的G-CSF，不仅实现周质腔分泌型表达，表达的G-CSF无须复性得到有活性的产物，经测序蛋白结构正确，N-端无多余氨基酸。分泌表达的原理是：将目的G-CSF编码序列融合到信号肽编码序列之后，表达产物在通过大肠杆菌细胞内膜分泌至胞周质(periPlasmic space)时，信号肽可被信号肽酶正确识别并切除。分泌后的外源蛋白不含N端甲硫氨酸，并已经空间折叠(包括形成二硫键)成具有天然构象的活性蛋白，无需后续的复性过程，从而简化了生产工艺.另外，蓄积在胞周质的外源蛋白避免了细胞内一些蛋白酶的降解，因而更加稳定。
发明内容
本发明的目的就是提供一种原核分泌表达G-CSF的方法，该方法的通用性好、表达量高、分泌效率高，适用于高效稳定地分泌表达多种外源基因，如G-CSF、IL-2等。
本发明涉及重组DNA技术，更具体地涉及一种新的原核分泌表达G-CSF质粒的构建方法。本发明还涉及原核分泌表达G-CSF的表达及提取方法。
附图说明
图1pDsbA-GCSF的结构图。
图2pBV-DsbA-GCSF的结构图。
图3周间腔蛋白电泳
在表达GCSF时，将基因被插入DsbA序列的下游，这使得表达基因时，所表达肽链由DsbA信号肽引导到周质腔中折叠形成活性蛋白。在本方法中选用了rrnB强终止序列，而且还有稳定作用。至于复制起点ori和标记基因(如抗性基因)等元件，没有任何特别限制。比如，用于筛选的抗性基因可选用四环素抗性基因、新霉素抗性基因、或氨节青霉素抗性基因等。
在本发明的另一个方面，提供了一种含有通用的周质腔分泌型表达载体pDsbA的宿主细胞，常用的为大肠杆菌DH5α，最佳地为大肠杆菌菌株W3110。
本发明所提供的载体具有以下特点：
1.共表达促折叠信号肽DsbA，有效促进GCSF在周质腔中的正确折叠，提高活性蛋白表达水平；
2.采用该载体进行周质腔分泌型表达时，不需要破碎细菌细胞壁，直接提取周质腔组分即可以收获目的蛋白。
3.以这种方式表达的蛋白都是有功能的活性蛋白，不需要步骤繁琐而效率极低的变性和复性过程，只需要较为简单的纯化步骤就能得到大量的外源蛋白；
4.这种表达载体以大肠杆菌为表达宿主，可大量发酵生产，生产工艺简单，容易操作，成本低廉。
具体实施方式
在本发明的一个实例中，为了获得构建分泌型表达载体的几个构件，首先根据已知的λP_L启动子的序列，合成用PCR引物，用PCR的方法从大肠杆菌载体pBLV载体扩增得到λP_L启动子。根据DsbA的序列设计延伸引物，以已有的GCSF为模板，用PCR扩增到GCSF的N端，两端设计酶切位点然后将适当酶切后的pBR322片段、启动子序列和适当酶切后的DsbA-GCSF片段连接在一起，就形成了一种新的GCSF分泌表达载体pDsbA-GCSF。同时也将DsbA-GCSF构建到pBv220载体形成pBV-DsbA。将两种质粒分别转化DH5α。
对于筛选出的转化的宿主细胞，可在本领域惯常使用的培养条件下培养以表达GCSF，其中对诱导前的OD值控制极为重要，合适的诱导浓度可使GCSF表达率较高。当30℃培养到OD值为0.8-1.0时，迅速升高温度到42℃，诱导6小时收集菌体，GCSF有较好的表达。
实施例1
λPL启动子的序列，合成用PCR引物，用PCR的方法从大肠杆菌载体pBLV克隆得到，以其为模板进行PCR扩增。所用的上游引物为：5′GTGAATTCAGATCTCTCACCTACCAAAC3′(含EcoRI)，下游引物为：5′GTCATATGACTAGTCCTCCTTAATTTTTAACCAATG 3′(含Spel位点)。PCR产物经EcoRI/Spel双酶切后，低融点胶回收备用。
实施例2
人GCSF基因是我公司已有，设计引物从原保存质粒中PCR得到，上游设计两条延伸引物，引物1：5’-GGT TTA GTT TTA GCG TTT AGC GCA TCG GCGACACCATTAGGCCCTGCCAGC-3′，引物2：5’-GAGGAATTCATG AAA AAG ATT TGG CTGGCG CTG GCT GGT TTA GTT TTA GCG TTT AGC-3′下游引物5’-GCGGGATCCTCACGGCTGGGCAAG-3′，扩增出的片段长约600bp。5’端的第二个GCA与DsbA信号肽的最后一个氨基酸的编码DNA相连，从而编码人GCSF成熟蛋白的第一个氨基酸是(Thr)，因此信号肽切除后分泌的GCSF氨基末端不含Met，而与天然GCSF相一致。信号肽的氨基酸序列为：Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser Ala SerAla
实施例3
pBV-DsbA-GCSF质粒的构建
在该实施例中，构建含有DsbA-GCSF序列和rmB终止序列的质粒.提供rmB序列的是质粒pBv220，这是一种已知的表达质粒。在该质粒中要表达的异源蛋白序列被置于PRPL启动子的下游，当热诱导时该启动子可使位于其下游蛋白序列表达。用BamHI/SaLI双切质粒pBV220中，形成质粒pBV-DsbA-GCSF。PBV-DsbA-GCSF质粒的结构如图2所示，紧挨着DsbA-GCSF序列下游的就是rrnB终止序列。
实施例4
表达载体pDsbA的构建如图4所示，用EcoRI/SpeI双酶切质粒pBR322，然后分离出大片段。用EcoRI/SpeI双酶切实施例3中获得的质粒pBV-DsbA-GCSF，然后分离小片段。将上述2种分离的片段按一定比例混合在一起，用连接酶连接过夜，从而构建成质粒pDsbA-GCSF。然后将该重组表达载体转人大肠杆菌W3110，建立人GCSF分泌型表达的工程菌PDsbA-hGCSF/W3110。
对于筛选出的转化的宿主细胞，可在本领域惯常使用的培养条件下培养以表达GCSF，其中对诱导前的OD值控制极为重要，合适的诱导浓度可使GCSF表达率较高。当30℃培养到OD值为0.8-1.0时，迅速升高温度到42℃，诱导6小时收集菌体，GCSF有较好的表达(占周间腔蛋白的40％以上)如图3。
GCSF的提取和纯化
GCSF的粗提：粗提缓冲液为10mMTris-HCL(pH7.4)(20％的蔗糖)，每mL加入33ul0.5mMEDTA。粗提方法：从-70℃取出菌体，按每克湿菌加人10ml上述缓冲液，悬浮细菌，放在4℃振荡1h，悬液经4℃，12000g，20min离心后收集上清，上清经5um滤膜正压过滤后，即为GCSF提取液.过阳离子交换层析柱，柱子经缓冲液A(20mMNaAC-HAC pH5.0)充分平衡后，将GCSF粗提液以10ml/min流速上样，改用20ml/min流速，以20％缓冲液B(IMNaCI，20mMNaAC-HACpH5.0)洗柱至280nm紫外吸收到基线，再以30％缓冲液B洗柱，收集洗脱蛋白峰。
疏水层析：填料为Pharmacia公司的Phemyl-sepharose HP。柱经平衡缓冲液A(1.5M(NH4)2S04，20mM NaAC-HACpH5.0)充分平衡.离子交换层析得到的组分中加人固体(NH4)2S04，使其终浓度为1.5M，离心去沉淀后以5ml/min流速上样，改用10ml/min流速，以40％缓冲液B(20mM NaAC-HAC pH5.0)洗柱至280nm紫外吸收到基线，再作40-60％B线性梯度洗脱，收集GCSF活性蛋白峰。
超滤浓缩：把疏水层析得到的GCSF活性组份，在Minitan超滤器上用PTGC滤膜(MW10000)超滤浓缩至90-100ml。凝胶过滤：填料为Pharmacia公司的Sephacryl S-100，柱体积为5cm×115cm。柱子先充分平衡后，将超滤浓缩样品上样层析，流速为60ml/h，收集GCSF活性蛋白峰。纯化后GCSF的鉴定：对用上述方法纯化后的GCSF，用常规方法进行HPLC纯度测定，结果测得其纯度大于98％。
在该实施例中，在优选条件下发酵结束时GCSF 95％以上均分泌到大肠杆菌细胞周质，表达量占胞周质蛋白总量的40％，1L发酵液中GCSF的产量为350-500mg，这比迄今为至以包含体形式表达的GCSF产率高出近5倍。此外不必复性，所以工艺简便，而且获得的GCSF的活性很高。