一种在杆状病毒昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白PERA9的方法.pdf

本发明涉及一种生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，尤其是一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Pera 9的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过杆状病毒-昆虫表达系统生产美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白，从而避免在不同的表达系统中(例如细菌和酵母菌)对Per a 9过敏原结构造成影响的问题，并提供一种亲和层析的方法，解决天然Per a 9过敏原纯化工艺复杂的问题。使用杆状病毒-昆虫表达系统得到的Per a 9蛋白的活性是使用大肠杆菌得到的Per a 9蛋白活性的2.1倍。

1.  一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其步骤包括：
(1)从美洲大蠊组织中提取总RNA；
(2)将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA和TTAGAGCGAGCTCTCCAGCT进行PCR反应，获得美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白的编码基因；
(3)将Per a 9蛋白的编码基因克隆到杆状病毒载体中，转染昆虫细胞诱导表达Per a 9蛋白；
(4)采用亲和层析方法对Per a 9蛋白进行纯化，从而得到美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白。

2.  根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR反应条件为94℃预变性10分钟后，94℃30秒变性、50℃45秒退火、72℃1分钟延伸，进行35个循环。

3.  根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于：所述Per a 9蛋白的编码基因如SEQ ID No：1所示。

4.  根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于：所述Per a 9蛋白的编码基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

5.  根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，杆状病毒载体为pFastBacHTA。

6.  根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，昆虫细胞为sf-9细胞。

7.  根据权利要求1所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，亲和层析的方法为Nickel亲和层析法，具体步骤是：将P0代病毒以感染复数为1感染sf9细胞，待细胞出现肿胀时收集细胞，经超声裂解细胞，离心得到上清液，上Nickel亲和柱，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，第一次洗脱去非特异性结合蛋白，第二次洗脱下的蛋白即为Per a 9蛋白。

8.  根据权利要求7所述在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其特征在于：第一次洗脱步骤中，Tris-HCl缓冲液含300mM NaCl和5％甘油(体积比)；第二次洗脱步骤中，Tris-HCl缓冲液含300mM NaCl、250mM咪唑和5％甘油(体积比)。

一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法
技术领域
本发明涉及一种生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，尤其是一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a9的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
过敏性疾病是人类重大疾病之一。其发病率目前估计约占世界人口的30～40％，而且正以每年大于1％的速度增加，以儿童患者的发病率上升最为明显。我国近年来对全国的大规模调查显示，儿童哮喘发病率比10年前明显增加，仅小儿哮喘患者达1000万之多，其中过敏为主要诱因(全国哮喘儿童防治协作组2003)。此外，与癌症和心脑血管疾病不同，哮喘对人类社会和经济的影响是不能简单地以其死亡率来衡量的，而要从这种疾病的发作频度来衡量其给人类造成的经济负担。由于哮喘多发生在年轻人群，其对人类社会和经济的影响就更严重。早在上世纪60年代，就有蟑螂引起哮喘的报道。但直到近年来，蟑螂在哮喘发病中的作用才逐渐受到人们的关注。资料显示，美国哮喘患者中蟑螂过敏的发生率达到27.5～42％，欧洲为3.9～24.5％，非洲为30～44.6％，在我国，北京、上海等大城市中儿童哮喘患者的蟑螂过敏率也高达27.8～43.8％。哮喘发病率的不断升高，在很大程度上与蟑螂污染加剧有关，蟑螂已经成为仅次于尘螨的第二大过敏源。目前常见的美洲大蠊和德国小蠊过敏原已经被鉴定出来，包括3种美洲大蠊过敏原和7种德国小蠊过敏原被鉴定出来。目前，治疗过敏性疾病的方法主要体现在减轻症状。有以下方法：1.利用抗组胺类以及类固醇药物以缓解症状，但是这些药物并不能抑制IgE抗体的产生并经常带来副作用。2.采用特异性免疫治疗(脱敏治疗)在过敏性疾病中的作用得到了肯定，其原理是：通过反复给药诱导患者对此过敏原产生耐受性，当患者再次接触此类过敏原时，过敏反应就会减轻或是不产生反应。然而，用于治疗的过敏反应提取物是从天然来源分离得到的蛋白质和非蛋白质成分的粗混合物，这些资源含有大量与过敏原无关的成分，或者几乎不含有造成患者高敏感性的过敏原，因此疗效不佳。3.利用基于单克隆抗体的免疫试验对主要过敏原含量进行鉴定，在过敏反应提取物的标准化方面取得了重要进展，其不利因素是：对一种特定的过敏反应提取物敏感的患者都必须接受含全部提取物成分的相同的复杂混合物的治疗，会导致副作用的产生，就过敏诊断而言，这种使用整个过敏反应提取物来进行皮肤测试的方法妨碍了导致患者敏感的特殊过敏原的检测。4.采用生物化学分离和纯化技术的方法得到单独的过敏原。尽管这个方法对于过敏原的鉴定可能有效，但却不足以制备工业规模上的过敏原。因为纯化工艺复杂，其过程极其耗费人力，并且在通常情况下，从昂贵的自然资源中纯化出过敏原产量都很低。基于上述原因，用于合成过敏原蛋白质的重组DNA技术引起了人们的注意。利用可生长在大发酵罐的微生物表达系统可以大规模获得重组过敏原，这些技术使得重组过敏原以一致纯度大量生产。除此以外，使用重组DNA技术可以表达抗原表位片断或修饰的过敏原以方便应用于过敏性疾病的诊断或处理。目前，利用重组DNA技术生产过敏原Per a 9蛋白只是在大肠杆菌中被表达，并没有在其他系统表达的报道，且在大肠杆菌中被表达的Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性不高。
发明内容
本发明的目的是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白的方法，解决天然过敏原Pe r a 9蛋白纯化工艺复杂、特异性I gE结合活性不高的问题。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Per a 9的方法，其步骤包括：
(1)从美洲大蠊组织中提取总RNA；
(2)将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA和TTAGAGCGAGCTCTCCA GCT进行PCR反应，获得美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白的编码基因；
(3)将Per a 9蛋白的编码基因克隆到杆状病毒载体中，转染昆虫细胞诱导表达Per a 9蛋白；
(4)采用亲和层析方法对Per a 9蛋白进行纯化，从而得到美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白。
在上述生产方法中，所述步骤(2)中PCR反应条件为94℃预变性10分钟后，94℃30秒变性、50℃45秒退火、72℃1分钟延伸，进行35个循环。
所述Per a 9蛋白的编码基因如SEQ ID No：1所示。
所述Per a 9蛋白的编码基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。与基因数据库(Genbank)中收录的美洲大蠊过敏原精氨酸酯酶序列有5个位点氨基酸差异，分别是：第76位为Gly(数据库为Ala)，第161为Gly(数据库的Ala)，第163为Leu(数据库为Phe)，第169为Phe(数据库为Leu)，第258为Ser(数据库为Phe)。
所述步骤(3)中，杆状病毒载体为pFastBacHTA。
所述步骤(3)中，昆虫细胞为sf-9细胞。
所述步骤(4)中，亲和层析的方法为Nickel亲和层析法，具体步骤是：将P0病毒以感染复数为1感染sf9细胞，待细胞出现肿胀时收集细胞，经超声裂解细胞，离心得到上清液，上Nickel亲和柱，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，第一次洗脱去非特异性结合蛋白，第二次洗脱下的蛋白即为Per a 9蛋白。其中，在第一次洗脱步骤中，Tris-HCl缓冲液含300mM NaCl和5％甘油；第二次洗脱步骤中，Tris-HCl缓冲液含300mM NaCl、250mM咪唑和5％甘油。
杆状病毒具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，相对于其他病毒载体，如腺病毒、痘病毒等载体而言，其安全性好。Per a 9是来源于昆虫(蟑螂)的蛋白，在昆虫细胞中表达能保证表达产物具有活性，蛋白质表达后修饰加工，信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似。杆状病毒-昆虫细胞表达系统，其表达产物的生物学特性与天然产物相似，具有可糖基化、磷酸化、酰胺化、信号肽和蛋白切割等后加工修饰功能，而且具有很高的克隆容量，表达产量高，细胞培养简单，适合大规模生产。其特异性IgE结合活性比其它系统要高。基于上述原理，本发明通过杆状病毒-昆虫表达系统生产美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白，从而避免在不同的表达系统中(例如细菌和酵母菌)对Per a 9过敏原结构造成影响的问题，并提供一种亲和层析的方法，解决天然Per a 9过敏原纯化工艺复杂的问题。使用杆状病毒-昆虫表达系统得到的Per a 9蛋白的活性是使用大肠杆菌得到的Per a 9蛋白活性的2.1倍。
附图说明
图1为重组Bacmid的PCR鉴定图。其中，1.鉴定阳性的重组Bacmid。
图2为重组Bacmid诱导表达及其纯化的SDS-PAGE图谱。其中1.重组质粒感染的sf-9全细胞裂解物；2.上清上Nickel柱后穿透峰；3.用20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl，5％甘油，pH8.0)洗下的蛋白；4-5.用20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl 5％甘油，20mM咪唑，pH8.0)洗脱后的蛋白；6.用20mM Tris-HCl(含有300mMNaCl 5％甘油，250mM咪唑，pH8.0)洗脱下的蛋白。
图3为纯化后的蛋白(Per a 9)免疫印迹(Western blot)鉴定图。
具体实施方式
实施例一
1.本实施例的步骤如下：
(1)从美洲大蠊组织中提取总RNA；取人工饲养的冻存美洲大蠊(来自江苏省疾病控制中心)，液氮研磨，按照100mg组织/mL Trizol试剂加入Trizol试剂。静置10min，而后按照300ul/mL加入氯仿，混匀，静置10min，12000g离心10min，弃上清，按500ul/mL加入异丙醇。混匀，静置10min，12000g离心10min，弃上清，管底沉淀即为美洲大蠊总RNA。加入75％乙醇悬浮沉淀，12000g离心10min，弃上清。室温干燥5min，加入无核糖核酸酶的双蒸水溶解。
(2)以提取的美洲大蠊总RNA为模板，采用TakaRa公司反转录试剂盒，以多聚脱氧胸腺嘧啶(10pmol/ul)为引物进行反转录试验产生cDNA。以基因数据库(genbank)美洲大蠊过敏原Per a 9基因序列设计引物5’-ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA-3’和5’-TTAGAGCGAGCTCTCCAGCT-3’，用PCR方法(94℃预变性10分钟后，94℃30秒变性、50℃45秒退火、72℃1分钟延伸，进行35个循环。)扩增出Per a 9基因，用TakaRa公司PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。与pMD18-T载体16℃连接过夜，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中。涂板过夜培养。筛选阳性菌，用TakaRa公司质粒抽提试剂盒抽提质粒并PCR鉴定正确。送到南京金思特公司测序，确定美洲大蠊过敏原Per a 9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
(3)将Per a 9蛋白的编码基因克隆到杆状病毒载体中，转染昆虫细胞诱导表达Per a 9蛋白；首先构建美洲大蠊过敏原Per a 9杆状病毒载体pFa s tBacHTA：将得到的Per a 9基因通过EcoR I andSal I酶切位点克隆到质粒pFastBacHTA中，转化感受态JM109。PCR鉴定筛选出阳性克隆。以含有Per a 9基因的pFastBacHTA质粒转化感受态DH10Bac，在DH10Bac菌内质粒助手的帮助下，Per a 9基因可转座到含杆状病毒基因组的Bacmid大质粒上。得到重组Bacmid。抽提重组Bacmid，PCR鉴定。结果见图1，能扩增出目的条带，说明Per a 9基因已经重组到Bacmid。将PCR鉴定阳性的重组Bacmid，用Cellfectin试剂盒转染昆虫细胞Sf9。在HyQ液体培养基中27℃培养7天后。收集上清得到P0病毒。
(4)采用亲和层析方法对Per a 9蛋白进行纯化，从而得到美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白。首先进行P1病毒扩增：P0代病毒以感染复数0.1感染100mL sf9细胞(2×10⁶/ml)，4天收集上清得到P1代病毒(4dpi)。再进行大规模感染和纯化：
P1代病毒以感染复数为1感染500mL sf9细胞(2×10⁶/ml)，到细胞出现肿胀的时候收集细胞。超声裂解细胞离心得到上清。上Nickel亲和柱，用20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl，5％甘油)洗去非特异性结合蛋白后，改用20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl，250mM咪唑，5％甘油)洗脱，洗脱下的蛋白即为Per a 5蛋白。采用SDS-PAGE进行表达鉴定(图2中lane 6中25-35kDa之间为Per a9蛋白)。用His单抗做western blot，发现在25-35kDa之间有反应条带(图3)，表明Per a 9蛋白被诱导表达并纯化。
2.对表达出的Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性进行测定：
采用间接ELISA方法分别测定杆状病毒-昆虫表达系统和大肠杆菌生产的Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性。
杆状病毒-昆虫表达系统生产的Per a 9蛋白，即由实施例一步骤(4)之后所纯化的Per a 9蛋白；大肠杆菌生产的Per a 9蛋白为本试验制备，是将实施例一步骤(2)之后所得的如SEQ ID No：1所示的美洲大蠊过敏原Per a 9基因，克隆到pET15b质粒中，转化的大肠杆菌ArcticExpressTM(DE3)RP，用0.5mMIPTG诱导表达过夜，收集菌体，超声破碎后离心收集上清，用Nickel亲和柱纯化得到。
将杆状病毒-昆虫表达系统和大肠杆菌生产的Per a 9蛋白(为本试验室制备)稀释成1ug/ml，高亲和板每孔加入Per a 9蛋白50ul，37度保温1小时，洗涤3遍。用1％小牛血清蛋白溶液封闭2h后，洗涤3遍。加入稀释10倍后的6个美洲大蠊过敏阳性混合血清和3个蟑螂过敏阴性混合血清50ul，保温1h，洗涤3遍。每孔加1∶150000的偶联辣根过氧化物酶的羊抗人IgE 50ul，37度保温40分钟，洗板5遍。加入50ul四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢。闭光反应5分钟，加入50ul 1M硫酸终止反应。在450nm处测定OD值。美洲大蠊过敏阳性混合血清和美洲大蠊过敏阴性混合血清450nm处测定OD值得差值可表示为Per a 9蛋白的特异性I gE结合活性。测定的OD值分别为1.5和0.7。结果表明杆状病毒-昆虫表达系统生产的Per a 9蛋白的特异性IgE结合活性是大肠杆菌生产的Per a 5蛋白的2.1倍。说明杆状病毒-昆虫表达系统生产的Per a 9蛋白优于大肠杆菌生产的Per a 9蛋白。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>江苏省人民医院
<120>一种在杆状病毒-昆虫表达系统生产美洲大蠊过敏原Per a 9蛋白的方法
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1068
<212>DNA
<213>美洲大蠊(American cockroach)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1068)
<400>1
ATGGTGGACG CCGCAGTTCT GGAGAAGCTG GAGGCCGGCT TCGCCAAATT GGCCGCCTCC 60
GACAGCAAGT CCCTGCTCAA GAAGTATCTG ACCAAGGAAG TGTTCGACAA TCTCAAGACC 120
AAGAAGACTC CTTCATTTGG CTCTACACTT CTTGATGTAA TCCAGTCTGG TCTCGAGAAC 180
CACGACTCCG GCGTGGGCAT CTACGCCCCA GACGCTGAAG CTTATGGCGT GTTCGCTGAC 240
CTGTTCGACC CCATCATTGA GGACTACCAT GGTGGCTTCA AGAAGACCGA CAAGCACCCT 300
CCCAAGGACT GGGGTGATGT GGACACCCTG GGCAACCTGG ACCCTGCTGG CGAGTACATC 360
ATCTCCACAC GAGTGAGGTG CGGTCGCTCC ATGCAGGGCT ACCCCTTCAA CCCCTGCTTG 420
ACTGAAGCCC AGTACAAGGA GATGGAGGAC AAGGTGTCCA GCACGCTGTC CGGCCTGGAG 480
GGCGAGCTGA AGGGCCAGTT CTACCCCCTC ACCGGCATGA CCAAGGAGGT CCAGCAGAAG 540
CTCATTGATG ACCACTTCCT CTTCAAGGAG GGCGATCGCT TCTTGCAGGC TGCCAACGCA 600
TGCCGCTTCT GGCCCACTGG ACGAGGCATC TACCACAACG ACGCCAAGAC GTTCCTGGTC 660
TGGTGCAATG AGGAGGATCA CTTGCGAATC ATCTCTATGC AGATGGGCGG CGACCTGGGA 720
CAGGTGTACC GCCGTCTGGT GACGGCTGTG AATGACATCG AGAAGCGCAT CTCCTTCTCG 780
CACGACGACC GTCTGGGCTT CCTCACCTTC TGCCCCACCA ACCTGGGCAC CACCGTGCGT 840
GCGTCTGTGC ACATCAAGGT GCCCAAGCTG GCTGCCGACA AGGCCAAGCT GGAGGAGGTT 900
GCTGGCAAGT ACAACCTGCA GGTCCGTGGC ACCCGTGGCG AGCACACAGA GGCCGAGGGC 960
GGTGTGTACG ACATCTCCAA CAAGCGGCGC ATGGGCCTGA CAGAGTACGA CGCCGTCAAG 1020
GAGATGAACG ACGGCATCGC CGAGCTGATC AAGCTGGAGA GCTCGCTC              1068
<210>2
<211>356
<212>PRT
<213>美洲大蠊(American cockroach)
<400>2
MVDAAVLEKLEAGFAKLAASDSKSLLKKYLTKEVFDNLKTKKTPSFGSTLLDVIQSGLEN
HDSGVGIYAPDAEAYGVFADLFDPIIEDYHGGFKKTDKHPPKDWGDVDTLGNLDPAGEYI
ISTRVRCGRSMQGYPFNPCLTEAQYKEMEDKVSSTLSGLEGELKGQFYPLTGMTKEVQQK
LIDDHFLFKEGDRFLQAANACRFWPTGRGIYHNDAKTFLVWCNEEDHLRIISMQMGGDLG
QVYRRLVTAVNDIEKRISFSHDDRLGFLTFCPTNLGTTVRASVHIKVPKLAADKAKLEEV
AGKYNLQVRGTRGEHTEAEGGVYDISNKRRMGLTEYDAVKEMNDGIAELIKLESSL
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>根据基因数据库美洲大蠊过敏原Pera 9基因序列设计引物
<400>3
ATGGTGGACG CCGCAGTTCT GGA          23
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>根据基因数据库美洲大蠊过敏原Per a 9基因序列设计引物
<400>4
TTAGAGCGAG CTCTCCAGCT              20