东亚钳蝎蝎毒素AGAP的生产方法.pdf

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种说重组蝎毒蛋白AGAP的生产方法。该方法是先利用重叠PCR技术获得带有His6标签的SUMO-AGAP融合基因；然后构建含SUMO-AGAP基因的重组表达载体；再将构建的表达载体转入宿主细胞进行表达；最后用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组融合蛋白质，His纯化融合蛋白，得到纯的SUMO-AGAP融合蛋白，进行酶切反应，释放出AGAP，经过一步纯化得到纯净的AGAP蛋白质。该方法大大提高了产率，节省成本，操作简便，且利用该方法生产的AGAP具有广泛的生物学活性，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，同时具有镇痛效应。

1、  一种东亚钳蝎蝎毒素AGAP的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用重叠PCR技术获得带有His6标签的SUMO-AGAP融合基因；
2)构建含SUMO-AGAP基因的重组表达载体；
3)将步骤2)中的表达载体转入宿主细胞进行表达；
4)用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组融合蛋白质，His纯化融合蛋白，得到纯的SUMO-AGAP融合蛋白，进行酶切反应，释放出AGAP，经过一步纯化得到纯净的AGAP蛋白质。

2、  根据权利要求1所述的东亚钳蝎蝎毒素AGAP的生产方法，其特征在于，步骤1)所说的SUMO-AGAP融合基因，其中SUMO的N端含有His6标签，AGAP基因位于SUMO C端，融合基因首、末两端有限制性内切酶识别位点。

3、  根据权利要求2所述的东亚钳蝎蝎毒素AGAP的生产方法，其特征在于，所述的融合基因首、末两端的限制性内切酶识别位点是任意的II类限制性内切酶识别位点。

4、  根据权利要求1所述的东亚钳蝎蝎毒素AGAP的生产方法，其特征在于，步骤2)所说的重组AGAP表达载体pET28a/SUMO-AGAP。

东亚钳蝎蝎毒素AGAP的生产方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体说，涉及在原核细胞，尤其是在大肠杆菌中大量制备，并得到有高度生物学活性的重组蝎毒蛋白AGAP的方法，利用该技术生产的AGAP具有广泛的生物学活性，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，同时具有镇痛效应。
背景技术
在传统中医药中，蝎是一种重要的药物来源。在我国的医疗历史中，很早就利用全蝎入药。随着科学技术的发展，研究发现蝎毒为传统药材全蝎的主要活性物质，存在于蝎尾部毒囊内，鳌刺时由鳌针排出。蝎毒是一种毒性仅次于蛇毒的生物毒素。为成分复杂的混合物。其主要活性成分是毒性蛋白(即蝎毒素Scor pionvenom)和酶。不同蝎种的蝎毒组成成分略有不同。但主要由非蛋白质和蛋白质两部分组成，前者主要包括赖氨酸、三甲胺、甜菜碱、牛黄酸、甘油酯、硬脂酸、胆锱醇、棕榈酸及胺盐等，后者大部分是具有药理活性的蛋白质，又分为蝎毒素和酶两部分。蝎毒中的酶类主要有磷脂酶、胆碱脂酶、透明脂酸酶、明胶酶等10种，可按不同种蝎所含酶之间的微小差别进行鉴别；蝎毒素包括抗癫痫肽、膜毒素、昆虫及哺乳类动物神经毒素、蝎毒肽、镇痛活性肽、蝎毒素-3、蝎毒素镇痛因子等约30种毒素，其分子量在5～10kd之间。蝎毒小剂量应用，具有显著的抗肿瘤、镇痛、抗癫痫及抗凝促凝双向效应，大剂量进入机体则产生明显的毒副作用。
东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic an-titumoral peptide，AGAP)是刘岩峰在2003年从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化得到的单组分活性肽。钳蝎蝎毒经过6次常规柱色谱分离纯化筛选得到电泳纯的活性肽，SDS-PAGE测定分子质量为7300u。糖蛋白、脂蛋白、核蛋白染色，紫外光谱、荧光光谱、电聚焦等方法验证活性肽为单一肽链的单纯碱性多肽，等电点大于10。氨基酸分析表明，活性肽含有较多的碱性氨基酸(这与其等电点大于10相对应)，还富含疏水性氨基酸。活性肽的N末端部分氨基酸序列为：VRDGY IADDKNCAYF CGRNA YCDDE。
AGAP是一种基因编码的小分子多肽，所以获得了编码蝎毒的基因就可以在其他宿主菌中获得高表达、高纯度的蝎毒蛋白。随着分子生物学的发展，重组蛋白技术已经非常成熟，它是将目的基因克隆到表达载体并在宿主细胞中产生目的蛋白质。根据测定的部分氨基酸序列，从东亚钳蝎克隆得到其cDNA(GenBank序列号AF464898)，这一序列编码了19个氨基酸的信号肽，66个氨基酸的成熟肽。用表达载体pET28a在大肠杆菌中表达钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘成熟肽，重组活性肽主要以包涵体的形式存在，表达量约占菌体总蛋白的40％。限制了AGAP的研究和生产。
基因工程表达AGAP最早见于2003年刘岩峰等人发表的文章(Protein Expr Purif.2003Feb；27(2)：253-8)，他们采用PET表达系统，获得了AGAP包涵体蛋白，再经过变复性技术制备了AGAP蛋白，通过该方法可以从1L培养菌中获得2.5毫克的AGAP纯蛋白。此外，他们也首次利用荷瘤小鼠发现了AGAP具有抑制鼠源骨肉瘤的生物学活性。
融合表达是指利用DNA体外重组技术，将两个或两个以上不同来源的基因或基因片段克隆在一起，构建成融合基因，然后在宿主细胞中进行表达。融合基因在宿主细胞中转录翻译后的产物应为单一的多肽序列，即融合蛋白。进行基因融合表达的目的通常有以下几点：(1)原核宿主的表达调控易于启动，融合蛋白大多可正确折叠，减少包涵体的形成，增加目的蛋白的表达量；(2)可以减少菌体内水解酶的作用，使目的蛋白特别是小分子目的蛋白得到保护；(3)简化表达产物的纯化及检测过程；(4)构建一些新型的活性蛋白，它通常是将两种或多种功能蛋白的基因融合表达，产生具有多功能或新功能的蛋白质。SUMO融合表达系统比较于传统的融合蛋白表达系统有两个明显的优势：(1)SUNO(small ubiquitin-related modifier，小泛素相关修饰因子)不仅能够提高蛋白质在大肠杆菌的表达量，尤其是一些毒性或者小肽，而且能够大大增加蛋白的可溶性。SUMO系统已经成功应用于SARS CoV 3Cl蛋白酶，GFP，金属蛋白酶(MMP13)的可溶性表达。(2)SUMO蛋白酶具有高比活性和高度特异性，1U的SUMO蛋白酶可以切割100μg SUMO融合蛋白。与其他酶切割原理不同的是SUMO蛋白酶识别SUMO的空间结构，而不是一级结构，这就避免了靶蛋白的非特异切割。由于SUMO蛋白酶的N-端添加了His标签，所以大大简化该酶的去除以及目标产物的进一步纯化。而且经过切割的目标产物N-端不会携带多余的氨基酸。但SUMO表达系统是否能用于AGAP的生产尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用大肠杆菌生产的有生物活性的重组蝎毒蛋白AGAP的方法。
本发明提供的方法包括以下步骤：
1)利用重叠PCR技术获得带有His6标签的SUMO-AGAP融合基因；
2)构建含SUMO-AGAP基因的重组表达载体；
3)将步骤2)中的表达载体转入宿主细胞进行表达；
4)用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组融合蛋白质，His纯化融合蛋白，得到纯的SUMO-AGAP融合蛋白，进行酶切反应，释放出AGAP，经过一步纯化得到纯净的AGAP蛋白质。
本发明中，在SUMO基因编码的第一个氨基酸前加上了起始密码子ATG，在AGAP基因编码的最后一个氨基酸后加上了终止密码子TGA。
本发明中，所说的SUMO-AGAP融合基因，其中SUMO的N端含有His6标签，AGAP基因位于SUMO C端，融合基因首、末两端有限制性内切酶识别位点。加在合成基因首、末两端的限制性内切酶识别位点可以是任意的II类限制性内切酶识别位点。
本发明中，所说的重组表达载体是pET28a/SUMO-AGAP。
本发明中，术语“宿主细胞”为原核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌等。本发明中，用化学试剂裂解细胞的裂解液是20mM Tris，500mM NaCl，5-10mM咪唑，pH 8.0-9.0。
本发明中，用物理方法或化学试剂裂解细胞，释放出可溶性重组融合蛋白SUMO-AGAP，使用镍离子亲和层析纯化出SUMO-AGAP融合蛋白，再使用SUMO特异蛋白酶进行酶切，释放出AGAP，最后采用镍离子亲和层析分离含有his6标签的SUMO蛋白和不含his6的重组蝎毒蛋白AGAP，得到重组蝎毒蛋白AGAP。
本发明中纯化SUMO-AGAP融合蛋白的试剂是Binding Buffer：20mM Tris，500mM NaCl，5-10mM咪唑，pH 8.0-9.0，Wash Buffer为20mM Tris，500mM NaCl，20-100mM咪唑，pH8.0-9.0，Elute Buffer为0.01M PBS加500mM咪唑，pH 8.0-9.0。
本发明中酶切融合蛋白所使用的蛋白酶是Ulp1。
本发明中所使用的透析缓冲液是0.01M PBS。
应用本发明的方法制备AGAP蛋白，大大提高了产率，节省成本，操作简便。
附图说明
图1为合成的SUMO基因和AGAP基因。M为分子量标准，1为SUMO基因，2为AGAP基因。
图2为含有合成的SUMO-AGAP基因的，IPTG诱导表达型载体(pET28a/SUMO-AGAP)
图3为pET28a/SUMO-AGAP菌落PCR鉴定，图中M为分子量标准，1-6为不同的样品；
图4为重组融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中M为分子量标准(从上到下依次为116，66，45，35，25，18，14)，箭头所指处为SUMO-AGAP融合蛋白。
图5为SUMO-AGAP融合蛋白纯化图。
图6为SUMO-AGAP融合蛋白酶切及纯化图。
图7为SUMO-AGAP和AGAP对JurkatE6-1细胞的抑制作用。
图8为SUMO-AGAP和AGAP对HuT78细胞的抑制作用。
图9为SUMO-AGAP和AGAP对A549细胞的抑制作用
图10重组AGAP蝎毒蛋白的镇痛作用
具体实施方式
以下具体实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明范围。
实施例1：制备重组蝎毒蛋白AGAP
1)通过重叠PCR技术构建SUMO-AGAP融合基因
根据在NCBI数据库查得的SUMO基因序列(Genebank no.U27233.1)以及AGAP基因序列(Gene bank no.AF464898.1)分别设计引物如下：
P1：5’CGATATA CCATGGGTCATCACCATTCATCACGGGTCGGACTCAG3’
P2：5’CAATATAACCATCGCGTACACCTCCAATCTGTTCGCGGTG 3’
P3：5’GGAGGT GTACGCGATGGTTATATTG 3’
P4：5’AGAACTCTCGAG CTAACCGCCATTGCATTTTCC3’
其中P1含有NcoI酶切位点，起始密码，His6标签以及SUMO上游互补序列，P2含有下游SUMO互补序列和AGAP上游互补序列，P3含有与AGAP上游互补序列，P2与P3含有互补区域，P4含有AGAP下游互补序列和BamHI酶切位点以及终止密码子。
第一轮PCR，分别以P1，P2扩增SUMO基因，反应体系以及程序如下：
10×PCR buffer    5μl
SUMO              2μl(10ng)
P1(10mM)          2μl
P2(10mM)          2μl
dNTP              4μl
Tag酶             0.5μl(2.5U)
Mg离子            3μl
补H₂O至50μl反应条件如下：
94℃ 3min

72℃ 7min
冷却至4℃，
反应结束后，进行1.0％Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带(图1)。产物序列如SEQID NO.1所示。
以P3，P4扩增AGAP基因。反应体系以及程序如下：
10×PCR buffer    5μl
AGAP              2μl(10ng)
P3(10mM)          2μl
P4(10mM)          2μl
dNTP              4μl
Tag酶             0.5μl(2.5U)
Mg离子            3μl
补H₂O至50μl反应条件如下：
94℃ 3min

72℃ 7min
冷却至4℃，
反应结束后，进行1.0％Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带(图1).产物序列如SEQID NO.2所示。
以第一轮扩增的两种产物作为模板，以P1，P4为上下游引物，反应体系以及程序如下：
10×PCR buffer    5μl
SUMO/AGAP         2μl(10ng)
P3(10mM)          2μl
P4(10mM)          2μl
dNTP              4μl
Tag酶             0.5μl(2.5U)
Mg离子            3μl
补H₂O至50μl反应条件如下：
94℃ 3min

72℃ 7min
冷却至4℃，
反应结束后，进行1.0％Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带(图2).得融合基因，序列如SEQ ID NO.3所示。
2)构建含SUMO-AGAP基因重组表达载体pET28a/SUMO-AGAP(图3)；
按步骤1)中的方法获得的SUMO-AGAP融合基因5’端含有NcoI酶切位点3’含有BamHI酶切位点。
建立如下酶切体系：
SUMO-AGAP片段   16μl(1μg)
10×Buffer K    2μl
Nco I           1μl(15U)
BamHI           1μl(15U)
补H₂O至20μl，37℃反应8h。载体pET28a采用同样的酶切体系酶切。反应结束后，进行1.0％Agarose电泳鉴定并割胶回收酶切产物。建立连接体系：
10×Ligation Buffer    2μl
SUMO-AGAP酶切片段      15μl(0.2pmol)
pET28a双酶切载体       2μl(0.03pmol)
T4 DNA Ligase          1μl(350U)
补H₂O至20μl，16℃反应12h。连接产物用于转化
将甘油冻存保存的DH5α接种划平板，37℃倒置培养过夜；
挑取单克隆至装有3ml LB的试管中，37℃ 220rpm振摇12h；
吸取1ml菌液至1.5ml离心管中，4℃ 12000g离心3min，弃上清；
用400μl 0.1mol/l预冷的CaCl2重悬菌体沉淀，12000g离心3min，
弃上清；用200μl 0.1mol/l预冷的CaCl2再次重悬菌体沉淀，置冰上过夜；
将连接液20μl全部加入200μl感受态细菌中，置冰上1h；
42℃热休克90sec，迅速置冰中5min；加入800μl 37℃预热的LB培养液；
37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Kan的LB平板，37℃倒置培养过夜。
随机挑取平板上4个单克隆至含30μg/ml Kan的3ml LB培养液的试管中，37℃ 220rpm振摇12h，按上述与体系进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的菌株抽提质粒后按上述酶切体系进行双酶切，1.0％ Agarose电泳鉴定。将鉴定为阳性的重组质粒送至Invitrogen公司测序。
3)SUMO-AGAP的诱导表达及纯化
将步骤2)中鉴定为阳性的重组质粒按2)中方法制备并转化入BL21(DE3)感受态细胞中。
从上面的平板中分别挑取克隆至3ml LB中(含50μg/ml Kan)37℃ 220RPM，2-3h后加入终浓度为1mM IPTG诱导4-6h.另取一管不加IPTG诱导作为对照。
分别取1ml未诱导，诱导的培养物12000rpm 1min弃上清加入100μl双蒸水，再加入100μl 2×还原loading buffer 95℃水浴5min，12000rpm 1min，取20μl上清跑SDS-PAGE鉴定(图4)。
确定蛋白诱导表达后，将表达量高的菌株加入甘油保存，具体操作为：取800μl过夜培养物加入甘油使其终浓度为20％，放-20℃保存。
取30μl甘油菌至3mlLB中(含50μg/ml Kan)37℃ 220RPM过夜培养。
取1ml过夜培养物加入至100ml LB培养基中(含50μg/ml Kan)，37℃ 220 RPM培养2-3h，至O9600至0.6，将培养物置冰上冷却30min后，加入终浓度为0.4mM IPTG，20℃ 150rpm，诱导培养48h。
4500rpm，10min，收集菌体沉淀。
菌体沉淀重悬于10ml 1×binding buffer中，冰浴超声破碎，超声功率450W，工作9s，间歇5s。总时间30min。
取出100μl超声后混合物做SDS-PAGE鉴定，余下的4℃，12000rpm，20min收集上清，冰上保存以备纯化。
SDS-PAGE和鉴定上清中蛋白表达量。将取出的100μl超声后溶液12000rpm，10min，分别收集上清与沉淀。
上清中加入100μl 2×还原loading buffer，沉淀中加入100μl ddH2O重悬，再加入100μl 2×还原loading buffer，两者一起95℃水浴5min，12000rpm离心1min，分别取20μl上清跑SDS-PAGE鉴定。
制备4％浓缩胶，13％分离胶。90V电泳30min，120V跑电泳至最后
考马斯亮蓝R250染色显带，脱色，观察结果。
准备好镍柱，样品及各种缓冲液。
用10倍体积ddH2O冲洗柱子，去除保存柱子用的20％乙醇。
用3倍体积1×binding buffer平衡柱子，控制流速为1ml/min。
上样，将超声后上清缓缓加入柱床，控制流速为0.5ml/min。
用10倍体积1×binding buffer冲洗柱子。
用6倍体积1×wash buffer冲洗柱子。
用约5倍体积1×Elute buffer洗脱样品，每管1ml收集样品。
收集的蛋白按顺序写好管号后分别取20μl样跑胶检测(图5)。
4)SUNO-AGAP的蛋白酶切及AGAP的纯化
将透析袋用1mmol/L的EDTA煮沸10min后用双蒸水冲洗干净
将经镍柱纯化后的SUMO-sdoBAFF并管后装入透析袋，按10mg/100U加入SUMO特异蛋白酶Ulp1，在1L透析液(150mM NaCl 20mM Tris PH 8.0 0.5mM EDTA 10％ V/V甘油)中透析24h。
将酶切产物按步骤3)上镍柱纯化，分离得到不含His6标签的AGAP蛋白(图6)。
5)AGAP蝎毒蛋白的抑制肿瘤细胞增殖活性
通过MTT实验证明按上述步骤制备的AGAP蛋白具有抑制多种肿瘤细胞增殖的活性(图7，8，9)。
6)AGAP蝎毒蛋白的镇痛作用
实验证明，按上述步骤制备的重组AGAP蝎毒蛋白能有效抑制小鼠因疼痛而导致的扭体反应(图10)。
SEQUENCE LISTING
<110>江苏省中医药研究院
<120>东亚钳蝎蝎毒素AGAP的生产方法
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>318
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgggtcatc accatcatca tcacgggtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca     60
gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct    120
tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc    180
gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt    240
caagctgatc aggcccctga agatttggac atggaggata acgatattat tgaggctcac    300
cgcgaacaga ttggaggt                                                  318
<210>2
<211>207
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggaggtgtac gcgatggtta tattgccgac gataaaaatt gcgcatattt ttgtggtaga     60
aatgcgtatt gcgatgacga atgtaagaag aatggtgctg agagtggcta ttgccaatgg    120
gcaggtgtat acggaaacgc ctgctggtgc tataaattgc ccgataaagt acctattaga    180
gtaccaggaa aatgcaatgg cggttag                                        207
<210>3
<211>519
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atgggtcatc accatcatca tcacgggtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca     60
gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct    120
tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc    180
gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt    240
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ttttgtggta gaaatgcgta ttgcgatgac gaatgtaaga agaatggtgc tgagagtggc    420
tattgccaat gggcaggtgt atacggaaac gcctgctggt gctataaatt gcccgataaa    480
gtacctatta gagtaccagg aaaatgcaat ggcggttag                           519