技术领域
本发明涉及包含使依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶(以下吡咯 并喹啉醌写作PQQ，葡萄糖脱氢酶写作GDH，依赖吡咯并喹啉醌的葡 萄糖脱氢酶写作PQQGDH)反应的步骤的葡萄糖测定中降低对麦芽糖 的活性的方法，降低对麦芽糖的活性的葡萄糖测定用的试剂组合物， 葡萄糖传感器及其制造方法。
背景技术
PQQGDH是以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶。由于它催化 葡萄糖氧化生成葡糖酸内酯的反应，因此可以用于测定血糖。血中葡 萄糖浓度是糖尿病的重要标志，因而在临床诊断上是极为重要的指标。 目前血中葡萄糖浓度的测定，主流方法是利用生物传感器，但PQQGDH 作为血中葡萄糖浓度测定用酶受到关注。作为这样的PQQGDH，例如， 已经公开了发现鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)NCIMB11517 菌株产生PQQGDH，并进行了基因克隆和构建了高表达系统的事例(例 如，参见特开平11-243949号公报)。
发明内容
PQQGDH由于具有催化D-葡萄糖氧化生成D-葡糖酸-1，5-内酯的 反应，反应系统不受溶解氧干扰，不必添加辅酶等酶特性，可望在血 糖的生物化学诊断或血糖传感器上有广泛用途，然而尚存在对二糖类， 特别是麦芽糖的活性等方面的问题。
为解决上述问题，本发明者对其原因进行了精心探讨。得知它对 一般作为电子介体用于血糖传感器的铁氰化物离子的反应性低。
我们就此进行了进一步探讨，得知对铁氰化物离子的反应性低的 原因是由于缓冲条件处于中性附近而受到底物特异性的影响。
关于增强PQQGDH的底物特异性的手段，有WO03/106668，其 中报道了采用基因水平的PQQGDH改变手段的研究，但从测定反应条 件的观点考虑，关于增强底物特异性的手段，其可能性则没有涉及。
本发明者从不同于以往手段的角度考虑，为探寻改良底物特异性 的更简便的手段，进行了深入研究，结果了解到，通过使葡萄糖测定 反应条件的pH为酸性，可以增强PQQGDH的底物特异性，最终完成 了本发明。本发明涉及以下第1～17项。
[第一项]在包含使依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶反应的步骤 的葡萄糖测定中降低对麦芽糖的活性的方法，该方法包含在使依赖吡咯 并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶反应的步骤的葡萄糖测定中，使测定反应时的 pH为酸性的步骤。
[第二项]第一项所述的方法，其中包含使依赖吡咯并喹啉醌的葡 萄糖脱氢酶反应的步骤包括使用含有依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢 酶的葡萄糖测定用组合物进行。
[第三项]第一项所述的方法，其中所述组合物还包含介体。
[第四项]第三项所述的方法，其中介体为铁氰化物盐类。
[第五项]第一项所述的方法，依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶 是对麦芽糖活性比对应的野生型依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶活 性更低的修饰型依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶。
[第六项]第一项所述的方法，其中测定反应时的pH为不超过6.5 的酸性。
[第七项]第二项所述的方法，其中葡萄糖测定用试剂组合物包括 包含铁氰化物离子作为介体的形式。
[第八项]第六项所述的在包含使依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢 酶反应的步骤的葡萄糖测定中降低对麦芽糖的活性的方法，其中葡萄糖 测定用组合物包括包含在葡萄糖检测试剂盒中的形式。
[第九项]第八项所述的方法，其中葡萄糖检测试剂盒含有依赖吡 咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶，并且包括测定反应时的pH为不超过6.5 的酸性的形式。
[第十项]第一项所述的方法，其中包含使依赖吡咯并喹啉醌的葡 萄糖脱氢酶反应的步骤，包括在含有依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢 酶、并且包含至少具有工作电极和反电极的电极的葡萄糖传感器中进 行。
[第十一项]第十项所述的方法，其中葡萄糖传感器中的反应是对 含依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶的反应溶液施加电压，并测定介体 的氧化电流。
[第十二项]第十项所述的方法，其中葡萄糖传感器含有依赖吡咯 并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶，并且为测定反应时的pH为不超过6.5的酸 性的形式。
[第十三项]第十项所述的方法，其中葡萄糖传感器含有作为介体 的铁氰化物离子。
[第十四项]在利用依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶的葡萄糖测 定用组合物中降低了对麦芽糖的活性的葡萄糖测定用组合物，包含改变 氨基酸序列而形成的修饰型依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶，以及能 维持测定反应时pH为酸性的缓冲剂。
[第十五项]在利用依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶的葡萄糖传 感器中降低了对麦芽糖的活性的葡萄糖传感器，包含改变氨基酸序列而 形成的修饰型依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶，以及能维持测定反应 时pH为酸性的缓冲剂。
[第十六项]在利用依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶的葡萄糖测 定用组合物中降低了对麦芽糖的活性的葡萄糖测定用组合物的制造方 法，包含使其含有能维持测定反应时pH为酸性的缓冲剂的步骤。
[第十七项]在利用依赖吡咯并喹啉醌的葡萄糖脱氢酶的葡萄糖传 感器中降低了对麦芽糖的活性的葡萄糖传感器的制造方法，包含使其含 有能维持测定反应时pH为酸性的缓冲剂的步骤。
附图说明
图1：野生型PQQGDH在PIPES(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图2：野生型PQQGDH在PIPES(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图3：野生型PQQGDH在MES(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH反 应速度的关系
图4：野生型PQQGDH在MES(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH反 应速度的关系
图5：野生型PQQGDH在苯二甲酸(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图6：野生型PQQGDH在苯二甲酸(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图7：野生型PQQGDH在柠康酸(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图8：野生型PQQGDH在柠康酸(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图9：野生型PQQGDH在戊二酸(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图10：野生型PQQGDH在戊二酸(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图11：修饰PQQGDH-A在PIPES(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图12：修饰PQQGDH-A在PIPES(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图13：修饰PQQGDH-A在MES(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图14：修饰PQQGDH-A在MES(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图15：修饰PQQGDH-A在苯二甲酸(pH5.5)中底物浓度与 PQQGDH反应速度的关系
图16：修饰PQQGDH-A在苯二甲酸(pH6.5)中底物浓度与 PQQGDH反应速度的关系
图17：修饰PQQGDH-A在柠康酸(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图18：修饰PQQGDH-A在柠康酸(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图19：修饰PQQGDH-A在戊二酸(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图20：修饰PQQGDH-A在戊二酸(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图21：修饰PQQGDH-B在PIPES(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图22：修饰PQQGDH-B在PIPES(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图23：修饰PQQGDH-B在MES(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图24：修饰PQQGDH-B在MES(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图25：修饰PQQGDH-B在苯二甲酸(pH5.5)中底物浓度与 PQQGDH反应速度的关系
图26：修饰PQQGDH-B在苯二甲酸(pH6.5)中底物浓度与 PQQGDH反应速度的关系
图27：修饰PQQGDH-B在柠康酸(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图28：修饰PQQGDH-B在柠康酸(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图29：修饰PQQGDH-B在戊二酸(pH5.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
图30：修饰PQQGDH-B在戊二酸(pH6.5)中底物浓度与PQQGDH 反应速度的关系
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明中，对麦芽糖的活性指PQQGDH对该底物的脱氢作用。
除麦芽糖外，对选择出的不是葡萄糖的至少一种麦芽糖以外的糖 类底物的活性也可以降低。
选择出的不是葡萄糖的至少一种麦芽糖以外的糖类底物，指半乳 糖、甘露糖、木糖等单糖类，蔗糖、乳糖、纤维二糖等二糖类，麦芽 三糖、麦芽四糖等寡糖类，艾考糊精(葡萄糖聚合物)等多糖类(寡糖是 2～10个单糖分子通过糖苷键结合而成，多糖则是至少11个单糖分子 通过糖苷键结合而成的糖类，不管结合方式)。二糖类或其以上的糖类 其结构既可以是同型也可以是异型。还包括这些糖类的衍生物，如糖 醇、2-脱氧-D-葡萄糖、3-o-甲基-D-葡萄糖等。
上述中，特别优选选择在将本发明的PQQGDH用于糖尿病患者的 临床诊断或为了控制血糖而进行的血中葡萄糖浓度测定时可能成为问 题的各种糖类。这些糖类可以列举甘露糖、阿洛糖、木糖、半乳糖或 麦芽糖等，进一步优选半乳糖、乳糖或麦芽糖，最优选麦芽糖。
判断对某种糖的活性是否降低，按以下进行。
在后述试验例1中所述活性测定方法中，采用PQQGDH，测定以 D-葡萄糖作底物时的PQQGDH活性值(a)，以及用该糖类代替葡萄糖作 底物时的PQQGDH活性值(b)，求出当设葡萄糖为底物时的测定值为 100的相对值((b)/(a)×100)。然后改变条件进行同样的操作，比较所得 数据加以判断。
活性测定按后述试验例1中所述的活性测定方法进行。
应用在本发明的方法中的PQQGDH，是以吡咯并喹啉醌为辅酶进 行配位，催化氧化D-葡萄糖生成D-葡糖酸-1，5-内酯的反应的酶 (EC1.1.5.2(旧编号EC1.1.99.17))，但其来源和结构并没有特别限定。
用于本发明的PQQGDH的来源，并无特别限制。例如来自微生物 的，可以列举诸如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii，例如可参考 特开平-243949号公报)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus， 例如可参考A.M.Cleton-Jansen等，J.Bacteriol.，170，2121(1988)和 Mol.Gen.Genet.，217，430(1989))、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞杆菌 (Pseudomonas fluorescens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)(例 如可参考Mol.Gen.Genet.，229，206(1991))等的氧化细菌，以及放射 形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、大肠杆菌(Eschrichia coli)(例 如可参考A.M.Cleton-Jansen等，J.Bacteriol.，172，6308(1990)))、产气 克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)等肠道细菌，和洋葱伯克霍尔德氏菌 (Burkhorderia cepacia)等。
上述微生物中，优选来源于属于不动杆菌属细菌的PQQGDH。这 些酶是可溶性酶，易溶于含水体系。更优选来自乙酸钙不动杆菌或鲍 氏不动杆菌等细菌的可溶性PQQGDH。进一步更优选来自鲍氏不动杆 菌NCIMB11517菌株(参考例如特开平11-243949号公报)、乙酸钙不动 杆菌LMD79.41菌株(参考例如A.M.Cleton-Jansen等，J.Bacteriol.，170， 2121(1988)和Mol.Gen.Genet.，217，430(1989))或乙酸钙不动杆菌 IFO12552菌株(参考例如特开平2004-173538)的PQQGDH。更优选来 自鲍氏不动杆菌NCIMB11517菌株的PQQGDH。鲍氏不动杆菌 NCIMB11517以前被定名为乙酸钙不动杆菌。
可用于本发明方法的PQQGDH，只要具有葡萄糖脱氢酶活性，也 可以在上述举例表示的酶分子中一部分氨基酸残基发生缺失或置换， 或添加了其它氨基酸。
这种改变，本领域技术人员可以使用本技术领域内的公知技术容 易地实施。例如为了在蛋白质的某部位引发特定的变异而使用的对编 码该蛋白质的基因的碱基序列进行置换或插入的各种方法，在 Sambrook等著Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版 (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中即有叙述。
这些PQQGDH，可以使用例如市售的东洋纺织公司制造的 GLD-321等产品。或者，本领域的技术人员使用本技术领域内的公知 技术也可以容易地制备。
例如将产生上述PQQGDH的天然微生物、或将编码天然PQQGDH 的基因或者使其变异后，插入表达用载体(在该技术领域内有多种，例 如质粒)中，培养通过转化为适当的宿主(在该技术领域内有多种，例如 大肠杆菌)而得到的转化子，用离心分离等方法从培养液中回收菌体后， 用溶菌酶等酶学方法或机械方法破碎菌体，必要时加入EDTA等螯合 剂或表面活性剂使其增溶化，即可得到含PQQGDH的水溶性级分。另 外，通过采用适当的宿主载体系统，也可以使所表达的PQQGDH直接 分泌到培养液中。
由上述途径得到的含有PQQGDH的溶液，采用诸如减压浓缩、膜 浓缩、进一步硫酸铵或硫酸钠等的盐析处理、或用例如甲醇、乙醇、 丙酮等亲水性溶剂的分别沉淀法等可以使之沉淀。另外，加热处理或 等电点处理则是有效的纯化手段。还可以采用吸附剂或凝胶过滤剂等 进行凝胶过滤、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱等手段，得到纯 化的PQQGDH。该纯化标准品优选达到在电泳(SDS-PAGE)时显示一条 带的纯化程度。
上述操作的前后，为了使全酶型PQQGDH在全GDH酶蛋白中所 占比率提高，优选进行25～50℃、更优选30～45℃的加热处理。
本发明中的PQQGDH浓度没有特别限制。
PQQGDH的酶活性按以下方法测定。
PQQGDH酶活性的测定方法
(1)测定原理
由N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)(红色)还原硝基四唑蓝(NTB)形成 的二甲 (diformazane)的存在，用分光光度计在570nm波长测定。
(2)单位定义
1单位酶是指在以下所述条件下，每分钟形成0.5毫摩尔二甲 的PQQGDH的酶量。
(3)方法
试剂
A.D-葡萄糖溶液：0.5M(0.9g D-葡萄糖(分子量180.16)/10ml H2O)
B.PIPES-NaOH缓冲液，pH6.5，50mM(将悬浊在60mL水中的 1.51g PIPES(分子量302.36)溶解在5N NaOH溶液中，加入2.2ml 10％Triton X-100。在25℃下用5N NaOH溶液调整到pH为6.5±0.05， 加水成100ml。)
C.PMS溶液：3.0mM(9.19mg N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(分子量 817.65)/10ml H2O)
D.NTB溶液：6.6mM(53.96mg硝基四唑蓝(分子量817.65)/10ml H2O)。
E.酶稀释液：含1mM CaCl2，0.1％Triton X-100，0.1％BSA的50 mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 6.5)
测定步骤
以下反应液在深色瓶中制备，在冰上储存(用时配制)。
1.8ml D-葡萄糖溶液 (A)
24.6ml PIPES-NaOH缓冲液(pH 6.5)(B)
2.0ml PMS溶液 (C)
1.0ml NTB溶液 (D)
上述检测混合物中的浓度如下：
PIPES缓冲液42mM
D-葡萄糖30mM
PMS 0.20mM
NTB 0.22mM
3.0ml的反应混合液装入试管(塑料制)中，在37℃预加热5分钟。 加入0.1ml酶液，轻慢地反转试管加以混合。
保持37℃，用分光光度计记录4～5分钟在570nm波长下对水的 吸光度的增加。由曲线的开始呈直线的部分计算每一分钟的ΔOD(Δ OD试验)。
同时，用酶稀释液(E)代替酶溶液，除此之外按同样方法重复操作， 测定空白值(ΔOD空白)。
临检测前用冰冷的酶稀释液(E)溶解酶粉末，用同一缓冲液稀释为 0.1-0.8U/ml(由于该酶的粘附性，优选使用塑料试管)
计算
按以下公式计算活性
U/ml＝{ΔOD/min(ΔOD试验-ΔOD空白)×Vt×df}/(20.1×1.0×Vs)
U/mg＝(U/ml)×1/C
Vt：总体积(3.1ml)
Vs：样品体积(1.0ml)
20.1：二甲 的1/2毫摩尔吸光系数
1.0：光径(cm)
df：稀释系数
C：溶液中的酶浓度(c mg/ml)
本发明的方法中，测定时的pH为酸性。所谓pH为酸性指pH不 到7.0，并无特别限定。在本发明中，优选上限为不超过pH6.5，更优 选pH3.5～5.5。
为了使本发明的方法中测定时的pH为酸性，可以采用各种缓冲 剂。这些缓冲剂只要具有维持pH为酸性的缓冲能力即可，并无特别限 定。一般可以使用的缓冲液有Tris盐酸、硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、 琥珀酸、苯二甲酸、马来酸、甘氨酸及其盐类等，或MES、Bis-Tris、 ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES等的Good 缓冲液等。
优选不会与钙形成不溶性盐的缓冲液。
这些缓冲剂可以仅使用一种，也可以使用两种或两种以上。还可 以和不包括在上述种类中的一种或多种缓冲剂组合使用。
它们的添加浓度，只要在维持其缓冲能力的范围内即可，没有特 别限制，优选上限为不超过100mM，更优选不超过50mM，优选下限 为不低于5mM。
冷冻干燥物中缓冲剂的含量，没有特别限定，优选不低于0.1％(重 量比)以上，特别优选在0.1％～30％(重量比)范围内使用。
它们可以使用各种市售的试剂。
这些缓冲剂可以在测定时加入，也可以在制备后述葡萄糖测定用 试剂、葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器时预先加入。而且此时，无 论液体状态或干燥状态等形态均可，只要在测定时发挥功能即可。
本发明中所谓底物特异性的提高，指PQQGDH对葡萄糖的活性比 对葡萄糖以外之糖类的活性要更高。所谓葡萄糖以外之糖类，可特别 例举麦芽糖、蔗糖、乳糖和纤维二糖等二糖类，尤其是麦芽糖。在本 发明中，对二糖类的活性下降也表现为底物特异性提高。
按下述方法判断对二糖类的活性是否下降。
在下述试验例1中所述的活性测定法中，使用PQQGDH酶，测定 以D-葡萄糖为底物溶液时的PQQGDH活性值(a)，以及用该二糖类代 替D-葡萄糖为底物溶液时的PQQGDH活性值(b)，求出设以D-葡萄糖 为底物时的测定值为100时的相对值((a)/(b)×100)。
本发明的效果在包含介体的系统中更为明显。适用本发明的介体 无特别限定，例如N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)和2，6-二氯苯酚-靛酚 (DCPIP)的组合，或PMS和氮蓝四唑(NBT)的组合，或单用DCPIP、单 用铁氰化物离子(例如铁氰化钾等化合物)、单用二茂铁等。其中优选铁 氰化物离子(例如铁氰化钾等化合物)。
由于这些介体的敏感性存在种种差异，因此不必统一规定加入的 浓度，但一般优选加入至少1mM。
这些介体可以在测定时加入，也可以在制备后述葡萄糖测定用试 剂、葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器时预先加入。而且此时，无论 液体状态或干燥状态等形态均可，只要在测定时能解离成离子即可。
在本发明中，如有必要，还可以和各种成分共同存在。例如可以 加入表面活性剂、稳定剂、赋形剂等。
例如，通过加入钙离子或它的盐，以及谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨 酸等氨基酸类，还有血清白蛋白等，可以使PQQGDH进一步稳定化。
例如，通过含有钙离子或钙盐，可以使PQQGDH稳定化。钙盐有 诸如氯化钙、乙酸钙，或者柠檬酸钙等无机酸或有机酸的钙盐。此外， 在水性组合物中，钙离子的含量优选为1×10-4～1×10-2M。
由于加入钙离子或钙盐而得到的稳定化效果，可以通过添加从谷 氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸组成的组中选择的氨基酸而进一步提高。从 谷氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸组成的组中选择的氨基酸可以是一种或者 两种或更多种。也可进一步含有牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白 (OVA)。
或者，通过使(1)从天冬氨酸、谷氨酸、α-酮戊二酸、苹果酸、α -酮葡糖酸、α-环糊精以及它们的盐类组成的组中选择的一种或两种或 更多种化合物和(2)白蛋白共存，也可以使PQQGDH稳定化。
在本发明中，可以用以下各种方法测定葡萄糖。
本发明的葡萄糖测定用试剂、葡萄糖检测试剂盒、葡萄糖传感器， 可以是液体状态(水溶液、悬浊液等)、真空干燥或喷雾干燥的粉末状态、 冷冻干燥等各种形态。冷冻干燥方法没有特别限制，按常规方法进行 即可。含有本发明的酶的组合物不限于冷冻干燥物，也可以将冷冻干 燥物再溶解成溶液状态。
葡萄糖测定用试剂
本发明的葡萄糖测定用试剂，典型地包括PQQGDH、缓冲液、介 体等测定必须的试剂、用于制作校准曲线的葡萄糖标准溶液以及使用 说明书。本发明的试剂盒，例如，可以以冷冻干燥的试剂形式、或适 当的保存溶液中的溶液形式提供。优选本发明的PQQGDH以全酶形式 提供，但也可以以脱辅基酶形式提供，使用时可以制成全酶。
葡萄糖检测试剂盒
本发明的葡萄糖检测试剂盒，典型地包括PQQGDH、缓冲液、介 体等测定必须的试剂、用于制备校准曲线的葡萄糖标准溶液以及使用 说明书。本发明的试剂盒可以以冷冻干燥的试剂、或适当的保存溶液 中的溶液状态提供。优选本发明的PQQGDH以全酶形式提供，但是也 可以以脱辅基酶形式提供，使用时可以制成全酶。
葡萄糖传感器
本发明的葡萄糖传感器，电极可以使用碳电极、金电极或铂电极 等，在该电极上固定PQQGDH。固定化方法有采用交联试剂的方法、 包埋在高分子基质中的方法、用透析膜覆盖的方法、使用光交联性聚 合物、导电性聚合物和氧化还原聚合物等的方法，或者也可以和以二 茂铁或它的衍生物为代表的电子介体一起固定在聚合物中，或吸附固 定在电极上。也可以将这些方法组合应用。优选将本发明的PQQGDH 以全酶的形式固定在电极上，但是也可以以脱辅基酶形式固定，以另 外的层或在溶液中提供PQQ。典型地，用戊二醛将本发明的PQQGDH 固定在碳电极上，然后用带有氨基的试剂处理以阻断戊二醛。
葡萄糖浓度的测定按以下所述进行。在恒温的小杯(cell)中加入 缓冲液，加入CaCl2以及介体，维持一定温度。介体可以用铁氰化钾、 N-甲基吩嗪甲基硫酸盐等。工作电极采用固定了本发明的PQQGDH的 电极、反电极(如铂电极)和参比电极(例如Ag/AgCl电极)。在碳电极上 施加一定电压，待电流稳定后，加入含葡萄糖的样品，测定电流的增 加。根据以标准浓度的葡萄糖溶液制作的校准曲线，可以计算出样品 中的葡萄糖浓度。
具体实施方式
下面，通过实施例对本发明进行详细的说明，但本发明并不限于
实施例。
实施例1
用葡萄糖测定系统确认底物特异性
(1)测定原理
PQQGDH
将D-葡萄糖的一部分改换为其它糖类，测定对各种底物的特异性。 铁氰化物离子还原产生的亚铁氰化物离子的存在，通过用分光光度法 测定420nm波长吸光度的减少来加以确认。
(2)方法
试剂
A.各种缓冲液，PIPES-NaOH缓冲液，pH6.5，50mM(将悬浊在 60mL水中的1.51g PIPES(分子量302.36))加入5N NaOH中溶解，加入 2.2ml 10％Triton X-100。并且，在25℃下用5N NaOH溶液调整到pH 为6.5±0.05，加水成100ml。MES-NaOH缓冲液pH6.5，苯二甲酸-NaOH 缓冲液pH6.5，柠康酸-NaOH缓冲液pH6.5，戊二酸-NaOH缓冲液pH6.5 等各种缓冲液也与配制PIPES-NaOH缓冲液方法相同)。
B.铁氰化钾溶液：50mM(0.165g铁氰化钾(分子量329.25)溶解在 10ml蒸馏水中)
C.PQQGDH溶液：8000U/ml(约100mg PQQGDH(东洋纺织公司制 造的GLD-321)溶解在10ml蒸馏水中)。
样品
D-葡萄糖溶液：配制分别为150、300、450、600、750、900、1050、 1200、1350和1500mM各种浓度的溶液(以270g D-葡萄糖(分子量 180.16)/1000ml水制备的1500mM葡萄糖溶液为基准，按1/10、2/10、 3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10用水稀释而成)
麦芽糖溶液：配制分别为150、300、450、600、750、900、1050、 1200、1350和1500mM各种浓度的溶液(以540.46g麦芽糖(含一分子 结晶水，分子量360.31)/1000ml水制备的1500mM葡萄糖溶液为基准， 按1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10用水稀释而 成)
测定步骤
1.以下反应混合物在深色瓶中制备，在冰上储存(用时配制)。
49.6ml各种缓冲液(pH 6.5)(A)
4.0ml铁氰化钾溶液 (B)
5.6ml糖溶液 (C)
2.3.0ml反应混合液装入试管(塑料制)中，在37℃预加热5分 钟。
3.加入0.1ml酶液，轻慢地加以混合。
4.保持37℃，用分光光度计记录1～3分钟在420nm波长下对 水的吸光度的减少值。由曲线的开始呈直线的部分计算每分钟的ΔOD (ΔOD试验)。同时用蒸馏水代替酶溶液，按同样方法重复操作，测定空 白值(ΔOD空白)。
用150～1500mM的各浓度的葡萄糖溶液或麦芽糖溶液进行上述 测定操作。
计算
计算出ΔOD/分钟((ΔOD试验-ΔOD空白)，求得单位时间内吸光度 的改变。
以横坐标为反应液中的葡萄糖浓度，纵坐标为与葡萄糖各浓度相 对应的ΔOD/分钟，作图。
为判断对葡萄糖之外的糖类的活性是否降低，测定以葡萄糖为底 物溶液时的ΔOD/分钟(a)和用其它糖类溶液代替葡萄糖作底物溶液时 的ΔOD/分钟(b)，求出以葡萄糖为底物时的测定值为100时的相对值 ((b)/(a)×100)。
实施例2
改变葡萄糖测定系统中的pH条件探讨底物特异性的改良
以实施例1的方法为基础，将缓冲剂的pH由6.5改变为5.5进行 测定。
对于各种缓冲液(A)，为了确定pH的影响比缓冲液的组成影响 更大，用Good缓冲液(PIPES、MES)、酸类缓冲液(苯二甲酸，柠康酸， 戊二酸)等多种缓冲液进行了探讨。其它条件均与实施例1相同。在图 1～30中，奇数号表示缓冲液pH5.5的结果，偶数号表示缓冲液pH6.5 的结果。图1～10是野生型PQQGDH的结果，图11～20是提高了底 物特异性的修饰PQQGDH-A的结果，图21～30是同样提高了底物特 异性的修饰PQQGDH-B的结果。图1、2、11、12、21、22是PIPES 缓冲液的结果，图3、4、13、14、23、24是MES缓冲液的结果，图5、 6、15、16、25、26是苯二甲酸缓冲液的结果，图7、8、17、18、27、 28是柠康酸缓冲液的结果，图9、10、19、20、29、30是戊二酸缓冲 液的结果。
比较图1～10野生型PQQGDH时，与缓冲液的组成无关，通过 降低缓冲液的pH，发现了对麦芽糖的活性增高，PQQGDH对葡萄糖的 特异性下降的趋势。另一方面，对于提高了对葡萄糖底物特异性的修 饰酶A和B则与野生型PQQGDH不同，与缓冲液的组成无关，随缓 冲液pH的降低，对葡萄糖的活性增强而可见PQQGDH对葡萄糖的特 异性提高的趋势。各基质浓度下对麦芽糖底物的活性(％)见表1～3。
表1 mM Mal/Glu PIPES PH＝5.5 4.8 153.3％ 9.7 145.0％ 14.5 142.6％ PH＝6.5 4.8 99.1％ 9.7 98.8％ 14.5 102.0％ MES PH＝5.5 4.8 128.8％ 9.7 124.5％ 14.5 124.0％ PH＝6.5 4.8 93.7％ 9.7 97.0％ 14.5 103.4％ 苯二甲酸 PH＝5.5 4.8 97.5％ 9.7 96.8％ 14.5 100.0％ PH＝6.5 4.8 98.5％ 9.7 84.0％ 14.5 84.4％ 柠康酸 PH＝5.5 4.8 104.7％ 9.7 102.2％ 14.5 102.8％ PH＝6.5 4.8 94.3％ 9.7 92.5％ 14.5 87.2％ 戊二酸 PH＝5.5 4.8 110.7％ 9.7 111.0％ 14.5 108.9％ PH＝6.5 4.8 88.4％ 9.7 95.1％ 14.5 94.0％
表2 mM Mal/Glu PIPES PH＝5.5 4.8 17.3％ 9.7 20.5％ 14.5 24.3％ PH＝6.5 4.8 45.5％ 9.7 60.7％ 14.5 70.7％ MES PH＝5.5 4.8 16.6％ 9.7 18.7％ 14.5 24.1％ PH＝6.5 4.8 37.2％ 9.7 51.9％ 14.5 62.1％ 苯二甲酸 PH＝5.5 4.8 27.3％ 9.7 20.3％ 14.5 18.2％ PH＝6.5 4.8 29.8％ 9.7 26.4％ 14.5 27.2％ 柠康酸 PH＝5.5 4.8 23.6％ 9.7 19.1％ 14.5 18.0％ PH＝6.5 4.8 26.3％ 9.7 32.9％ 14.5 39.6％ 戊二酸 PH＝5.5 4.8 15.6％ 9.7 17.0％ 14.5 19.1％ PH＝6.5 4.8 39.5％ 9.7 52.0％ 14.5 61.4％
表3 mM Mal/Glu PIPES PH＝5.5 4.8 12.1％ 9.7 16.3％ 14.5 20.7％ PH＝6.5 4.8 49.1％ 9.7 61.3％ 14.5 70.0％ MES PH＝5.5 4.8 9.8％ 9.7 12.7％ 14.5 16.1％ PH＝6.5 4.8 41.4％ 9.7 53.7％ 14.5 62.1％ 苯二甲酸 PH＝5.5 4.8 10.2％ 9.7 7.6％ 14.5 8.7％ PH＝6.5 4.8 15.2％ 9.7 16.7％ 14.5 19.4％ 柠康酸 PH＝5.5 4.8 10.7％ 9.7 9.4％ 14.5 9.8％ PH＝6.5 4.8 24.4％ 9.7 31.1％ 14.5 37.9％ 戊二酸 PH＝5.5 4.8 11.4％ 9.7 14.6％ 14.5 18.3％ PH＝6.5 4.8 74.2％ 9.7 81.4％ 14.5 90.6％
由此可见，提高了对葡萄糖的底物特异性的修饰酶，通过将缓冲 液的pH由中性附近改变为酸性侧，底物特异性提高了1.5～6.5倍。
工业实用性
本发明对底物特异性的改善，可以提高葡萄糖检测试剂、葡萄糖 检测试剂盒和葡萄糖传感器的测定精确度。