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骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710630737.5 (22)申请日 2017.07.28 (71)申请人北京济全生物科技有限公司地址 100070 北京市丰台区科学城海鹰路8 号院3号路南楼309室 (72)发明人王玮尚腾飞 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅任凤华 (51)Int.Cl. C07K 14/705(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A6。

2、1K 38/17(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (54)发明名称骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用 (57)摘要本发明公开了骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用。该骨保护素的突变体蛋白与野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性但是所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性低于所述野生型骨保护素。实验证明，本发明的骨保护素的突变体蛋白与相应的野生相比，抑制RANKL诱导破骨细胞分化能力无显著差别，并可以克服野生型抑制 TRAIL抗肿瘤作用的缺陷，更高效。

3、、安全地发挥防治骨吸收相关疾病的作用。权利要求书3页说明书14页序列表9页附图1页 CN 109306003 A 2019.02.05 CN 109306003 A 1.野生型骨保护素的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白是由野生型骨保护素进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性但是所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性低于所述野生型骨保护素对所述TRAIL的亲和活性。 2.根据权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于：所。

4、述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性为所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性是所述野生型骨保护素对RANKL的亲和活性的70以上。 3.根据权利要求1或2所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的亲和活性低于所述野生型骨保护素为所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性是所述野生型骨保护素对TRAIL的亲和活性的25以下。 4.根据权利要求3所述的突变体蛋白，其特征在于：所述70以上为a1)-a10)中的任一种： a1)大于等于76至等于100； a2)大于等于80至等于100； a3)大于等于81至等于100； a4)大于等于82至等于100；。

5、 a5)大于等于83至等于100； a6)大于等于84至等于100； a7)大于等于85至等于100； a8)大于等于90至等于100； a9)大于等于95至等于100； a10)76、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 90、 95或100；和/或，所述25以下为b1)-b9)中的任一种： b1)、小于等于20至等于0或小于等于20至小于等于16； b2)、小于等于16至等于0或小于等于16至小于等于13； b3)、小于等于13至等于0或小于等于13至小于等于11； b4)、小于等于11至等于0或小于等于11至小于等于10； b5)、小于等于10至等于0或小于等于。

6、20至小于等于5； b6)、小于等于5至等于0或小于等于5至小于等于3； b7)、小于等于3至等于0或小于等于3至小于等于1； b8)、小于等于1至等于0； b9)、 20、 16、 13、 11、 10、 5、 3或1。 5.根据权利要求1至3中任一所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白是将所述野生型骨保护素的第73位的丝氨酸氨基酸残基替代为其它氨基酸残基得到的蛋白质。 6.根据权利要求5所述的突变体蛋白，其特征在于：所述其它氨基酸为C1或C2： C1、非极性氨基酸或极性氨基酸； C2、所述其它氨基酸为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸或亮氨酸。 7.根据权利要求6所述的突。

7、变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白为D1至D4中的任一权利要求书 1/3 页 2 CN 109306003 A 2 种： D1、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质，或氨基酸序列是SEQ ID No.4的第5-184位氨基酸残基的蛋白质； D2、氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质，或氨基酸序列是SEQ ID No.5的第5-184位氨基酸残基的蛋白质； D3、氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质，或氨基酸序列是SEQ ID No.6的第5-184位氨基酸残基的蛋白质； D4、氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质，或氨基酸序列是SEQ ID。

8、 No.3的第5-184位氨基酸残基的蛋白质。 8.权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白的相关产品，为E1至E3中的任一种： E1、权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料可为下述B1)至B16)中的任一种： B1)编码所述突变体蛋白的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物； B9)含有B1)所。

9、述核酸分子的转基因动物细胞系； B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系； B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系； B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系； B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系； B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系； B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系； E2、权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白的衍生物，为下述a11或a12： a11、在所述突变体蛋白的氨基端或/和羧基端融合标签蛋白得到的融合蛋白或将具有靶向性功能的蛋白与所述突变体蛋白连接得到的融合。

10、蛋白； a12、对所述突变体蛋白进行下述a21至a28中至少一种修饰得到的修饰物： a21、添加亮氨酸拉链； a22、添加异亮氨酸拉链； a23、加入锌原子和双硫基； a24、被装载到人血清白蛋白纳米颗粒中； a25、与HSA配体结合； a26、与PEG结合； a27、用聚乳酸-乙醇酸共聚物微球缓释系统装载；权利要求书 2/3 页 3 CN 109306003 A 3 a28、与抗体的Fc段结合； E3、权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白的单聚体或多聚体。 9.抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物，其特征在于：所述药物含有权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白或/。

11、和权利要求8所述的相关产品。 10.权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白或/和权利要求8所述的相关产品在制备抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物中的应用。权利要求书 3/3 页 4 CN 109306003 A 4 骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域中骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用。背景技术 0002 以骨质疏松症、关节炎为代表的骨吸收相关疾病是世界常见的多发病，已严重影响了人类健康。骨吸收相关疾病的病理特征为骨吸收形成失平衡，而调节骨吸收和形成平衡的最重要的信号传导通路被证明是OPG/RANKL/RANK系统。在该。

12、系统中，骨保护素 (Osteoprotegerin， OPG)作为中心环节，发挥着至关重要的作用。 0003 1997年，美国和日本两个研究组同期发现了OPG蛋白。它属于TNF受体超家族成员，为可溶性、分泌性糖蛋白，由401个氨基酸组成，表达于成骨细胞/骨间质细胞中，是目前发现的唯一的破骨细胞负向调节因子。因考虑到OPG对破骨细胞的重要调节作用，上述两个研究组立即开始查找与OPG密切相关的蛋白，发现了其配体核因子- B受体活化因子配体 (receptor activator of NF-B ligand， RANKL)和破骨细胞表面膜受体RANK(the recep。

13、tor activator of NF- B)。短短2年， OPG/RANKL/RANK系统为人们所认识，回答了成骨细胞调控破骨细胞的准确机制： OPG相当于整个OPG/RANKL/RANK系统的制动器。它作为 RANKL的假受体，竞争性抑制RANKL与RANK结合，从而抑制破骨细胞活性和分化,对抗骨质疏松，因此RANKL/OPG比例成为骨质疏松致病机制中的关键因素。许多激素和细胞因子(例如 TGF- 、 PTH、 1， 25-VD3、糖皮质激素和雌激素)都通过OPG通路起作用。骨质疏松小鼠注射OPG 后，骨密度明显上升，而OPG基因敲除小鼠表现为严重骨质疏松。 00。

14、04 OPG防治骨质疏松的重要作用被揭示后，成为竞相追捧的 “明星蛋白” 。世界最大的生物公司-Amgen尝试开发的OPG-Fc曾进入到临床期研究，初步实验表明OPG能够抑制人体骨吸收，对抗骨质疏松。 Amgen公司甚至和美国航空航天局(NASA)合作开展了OPG预防废用性骨质疏松症的太空实验。正当OPG作为抗骨质疏松药物的研发蓬勃开展的时候， Amgen 公司却在2005年停止了对该蛋白的研发投入，放弃了关于OPG的进一步研究。其它实验室对 OPG的研究也近于停滞。其原因之一是发现OPG存在着缺陷，影响了其临床应用： RANKL的结构与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体。

15、(tumor necrosis factor related apoptosis- inducing ligand， TRAIL)相似， OPG与RANKL结合的同时也能与TRAIL结合，抑制了TRAIL的抗癌作用，加大肿瘤发生的风险。 TRAIL是一种人体自分泌的蛋白，其能特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显细胞毒作用。 0005 2006年澳大利亚EvoGenix公司申请了一种OPG突变体衍生物的专利(US 2006/ 0189528 A1)，其所涉及的基因突变位点主要为I115， R122和F128。通过这些位点氨基酸的替换，降低OPG突变体与TRAIL的结合能力，从。

16、而减少其促进肿瘤发生的危险。发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是如何在保留野生型骨保护素的抑制RANKL介导的破骨细胞活化的能力的情况下，降低野生型骨保护素对TRAIL的抗癌作用的抑制。说明书 1/14 页 5 CN 109306003 A 5 0007 为了解决以上技术问题，本发明提供了野生型骨保护素的突变体蛋白，所述突变体蛋白是由野生型骨保护素进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对核因子- B受体活化因子配体(RANKL)的亲和活性但。

17、是所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的亲和活性低于所述野生型骨保护素对所述TRAIL的亲和活性。 0008 上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素包括野生型骨保护素的全长片段，也包括野生型骨保护素的活性片段。 0009 上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素可来源于任何物种，如来源于哺乳动物的骨保护素，如人。 0010 上述突变体蛋白中，人野生型骨保护素的全长氨基酸序列是SEQ ID No.9，如 GenBank Accession Number NP_002537.3(26-JUN-2017)所示。 0011 上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素。

18、可为人野生型骨保护素的活性片段。所述人野生型骨保护素的活性片段的氨基酸序列可为全长序列的第22-201位氨基酸残基。 0012 上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白包括任何在所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代的变异蛋白，无论是截短的还是全长的，无论是单体形式还是二聚体形式。 0013 上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白和所述野生型骨保护素对RANKL的亲和活性和对TRAIL的亲和活性之间的比较是基于大小相似的蛋白质进行的。 0014 上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性可为所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性是所述野生型骨保护素对RA。

19、NKL的亲和活性的70以上。 0015 上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的亲和活性低于所述野生型骨保护素为所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性是所述野生型骨保护素对TRAIL的亲和活性的25以下。 0016 上述突变体蛋白中，所述70以上可为a1)-a10)中的任一种： 0017 a1)大于等于76至等于100； 0018 a2)大于等于80至等于100； 0019 a3)大于等于81至等于100； 0020 a4)大于等于82至等于100； 0021 a5)大于等于83至等于100； 0022 a6)大于等于84至等于100； 0023 a7)大于等于。

20、85至等于100； 0024 a8)大于等于90至等于100； 0025 a9)大于等于95至等于100； 0026 a10)76、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 90、 95或100。 0027 上述突变体蛋白中，所述25以下可为b1)-b9)中的任一种： 0028 b1)、小于等于20至等于0或小于等于20至小于等于16； 0029 b2)、小于等于16至等于0或小于等于16至小于等于13； 0030 b3)、小于等于13至等于0或小于等于13至小于等于11；说明书 2/14 页 6 CN 109306003 A 6 0031 b4)、小于等于11至等于0或小。

21、于等于11至小于等于10； 0032 b5)、小于等于10至等于0或小于等于20至小于等于5； 0033 b6)、小于等于5至等于0或小于等于5至小于等于3； 0034 b7)、小于等于3至等于0或小于等于3至小于等于1； 0035 b8)、小于等于1至等于0； 0036 b9)、 20、 16、 13、 11、 10、 5、 3或1。 0037 上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白可为将所述野生型骨保护素的第73位的丝氨酸氨基酸残基替代为其它氨基酸残基得到的蛋白质。 0038 所述其它氨基酸残基本领域技术人员可根据所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性和对TRAIL的亲和活性确定，。

22、只要能使所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性满足上述a1)- a10)中任一种，对TRAIL的亲和活性满足上述b1)-b9)中的任一种要求的其它氨基酸残基均可选用。 0039 所述其它氨基酸可从r1)至r4)中选择： 0040 r1)下述19种氨基酸中的任一种：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)。

23、、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；所述氨基酸的构象为L型； 0041 r2)下述19种氨基酸中的任一种：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；所述氨基酸的构象为D型； D型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相。

24、对应的氨基酸； 0042 r3)对所述r1)或r2)进行化学修饰得到的人工修饰的氨基酸； 0043 r4)自然界存在的稀有氨基酸。 0044 所述r3)中的化学修饰可为甲基化或磷酸化等修饰。 0045 所述自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、氨基丁酸或高丝氨酸等。 0046 上述突变体蛋白中，所述其它氨基酸可为C1或C2： 0047 C1、非极性氨基酸或极性氨基酸； 0048 C2、所述其它氨基酸为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸或亮氨酸。 0049 上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在序。

25、列上只是所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代，其它氨基酸残基没有发生替代。具体地，上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在序列上只有所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基不同，其它氨基酸残基均相同。 0050 上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白具体可为D1至D4中的任一种： 0051 D1、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质(名称为OPGS73V)，或氨基酸序列是SEQ ID No.4的第5-184位氨基酸残基的蛋白质； 0052 D2、氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质(名称为OPGS73G)，或氨基。

26、酸序列是SEQ ID No.5的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；说明书 3/14 页 7 CN 109306003 A 7 0053 D3、氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质(名称为OPGS73L)，或氨基酸序列是SEQ ID No.6的第5-184位氨基酸残基的蛋白质； 0054 D4、氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质(名称为OPGS73A)，或氨基酸序列是SEQ ID No.3的第5-184位氨基酸残基的蛋白质。 0055 下述E1至E3的所述突变体蛋白的相关产品，也属于本发明的保护范围： 0056 E1、所述突变体蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料可。

27、为下述B1)至B16)中的任一种： 0057 B1)编码所述突变体蛋白的核酸分子； 0058 B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； 0059 B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； 0060 B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； 0061 B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物； 0062 B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； 0063 B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； 0064 B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物； 0065 B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系； 0066 B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系； 0067 B11)含有B3)。

28、所述重组载体的转基因动物细胞系； 0068 B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系； 0069 B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； 0070 B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系； 0071 B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系； 0072 B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系； 0073 E2、所述突变体蛋白的衍生物，为下述a11或a12： 0074 a11、在所述突变体蛋白的氨基端或/和羧基端融合标签蛋白得到的融合蛋白或将具有靶向性功能的蛋白与所述突变体蛋白连接得到的融合蛋白； 0075 a12、对所述突变体蛋白进行下述。

29、a21至a28中至少一种修饰得到的修饰物： 0076 a21、添加亮氨酸拉链； 0077 a22、添加异亮氨酸拉链； 0078 a23、加入锌原子和双硫基； 0079 a24、被装载到人血清白蛋白纳米颗粒中； 0080 a25、与HSA配体结合； 0081 a26、与PEG结合； 0082 a27、用聚乳酸-乙醇酸共聚物微球缓释系统装载； 0083 a28、与抗体的Fc段(可结晶片段)结合； 0084 E3、所述突变体蛋白的单聚体或多聚体。 0085 上述相关产品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mR。

30、NA或hnRNA等。 0086 上述相关产品中，所述重组微生物可为将所述突变体蛋白的编码基因导入受体微说明书 4/14 页 8 CN 109306003 A 8 生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物可为F11至F14中的任一种: 0087 F11、原核微生物； 0088 F12、革兰氏阴性细菌； 0089 F13、埃希氏菌属细菌； 0090 F14、大肠杆菌BL21(DE3)。 0091 上述生物材料中， B9)至B16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。 0092 上述相关产品中，所述具有靶向性功能的蛋白可为抗体或转铁蛋白。所述抗体可为单链抗体或完整抗体。

31、。所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、 His6标签蛋白、 MBP标签蛋白、 HA标签蛋白、 myc标签蛋白、 GST标签蛋白或SUMO标签蛋白等。 0093 本发明还提供了抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物。 0094 本发明所提供的抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物，含有所述突变体蛋白或/ 和所述相关产品。 0095 所述抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物具体可为预防和/或治疗骨吸收相关疾病的药物，如预防和/。

32、或治疗骨质疏松症的药物、预防和/或治疗关节炎的药物等。上述物中，所述药物的活性成分可为所述突变体蛋白或/和所述相关产品，所述药物的活性成分还可含有其它成分，所述药物的其它活性成分本领域技术人员可根据其抑制RANKL介导的破骨细胞活化效果确定。 0096 上述药物中，所述药物还可含有载体或赋形剂。所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲基纤维素等)。 0097 实验证明，将人野生型骨保护素全长序列的第73位的丝氨基酸残基(S73)分。

33、别替代为丙氨酸残基、缬氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基得到的突变体蛋白OPGS73A、 OPGS73V、 OPGS73G、 OPGS73L与相应的野生OPG(OPGwt)相比，与RANKL的亲和力分别是野生型的0.84倍、 0.85倍、 0.81倍、 0.76倍，与TRAIL亲和力分别是野生型的0.16倍、 0.03倍、 0.13倍和0.11倍。突变体蛋白OPGS73A、 OPGS73V、 OPGS73G、 OPGS73L与相应的野生OPG(OPGwt)相比，抑制RANKL诱导破骨细胞分化能力无显著差别。说明S73位点的突变没有降低OPG对RANKL的抑制作用。突变体。

34、蛋白OPGS73A、 OPGS73V、 OPGS73G、 OPGS73L对TRAIL的抑制作用远低于野生 OPG(OPGwt)，这些OPG突变体蛋白可以克服野生型抑制TRAIL抗肿瘤作用的缺陷，更高效、安全地发挥防治骨吸收相关疾病的作用。附图说明 0098 图1为经分子筛纯化后获得的OPGwt、 OPGS73G和OPGK94A的鉴定结果。 0099 A为SDS-PAGE电泳鉴定。 1-3道分别为OPGwt、 OPGS73G和OPGK94A，箭头所示为各道的纯化蛋白。 0100 B为OPGS73G复性后分子筛纯化图像。箭头所示为OPGS73G的洗脱峰。 0101 图2为OPG抑制。

35、RANKL刺激RAW264.7细胞分化成熟为破骨细胞的实验。图中， wOPG为野生型人骨保护素OPGwt， D1为OPGS73G， D101为OPGS73A， D102为OPGS73V， D103为OPGS73L，说明书 5/14 页 9 CN 109306003 A 9 D2为OPGK94A， D3为阳性对照OPGR122G。 Negative孔中RANKL的浓度是0ng/ml， OPG的浓度是 0ng/ml； RANKL的孔中RANKL的浓度为50ng/ml， OPG的浓度是0ng/ml； RANKL： OPG1:1的孔中 RANKL的浓度为50ng/ml， OPG的浓度是50ng/。

36、ml， RANKL： OPG1:2的孔中RANKL的浓度为50ng/ ml， OPG的浓度是100ng/ml， RANKL： OPG1:4的孔中RANKL的浓度为50ng/ml， OPG的浓度是 200ng/ml， RANKL： OPG1:8的孔中RANKL的浓度为50ng/ml， OPG的浓度是400ng/ml。 0102 图3为OPG抑制TRAIL导致的colo205细胞凋亡实验。图中， wOPG为野生型人骨保护素OPGwt， D1为OPGS73G， D101为OPGS73A， D102为OPGS73V， D103为OPGS73L， D2为OPGK94A， D3 为阳性对照OPGR12。

37、2G。 Negative孔中TRAIL的浓度是0ng/ml， OPG的浓度是0ng/ml； TRAIL的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml； TRAIL： OPG1:1的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml， OPG的浓度是 100ng/ml， TRAIL： OPG1:5的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml， OPG的浓度是500ng/ml， TRAIL： OPG1:25的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml， OPG的浓度是2500ng/ml， TRAIL： OPG1:125的孔中 TRAIL的浓度是100ng/ml， OPG的浓度是12500ng/ml。具体实施方式 010。

38、3 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0104 下述实施例中的TRAIL来源于人，其氨基酸序列如NCBI Reference Sequence:NP_ 003801.1(Update Date： 06-MAY-2017)，由281个氨基酸残基组成，为Peprotech公司产品。 0105 下述实施例中的RANKL来源于人，其氨基酸序列如NCBI Reference Sequ。

39、ence:NP_ 003692.1(Update Date： 02-JUL-2017)由317个氨基酸残基组成，为Abcam公司产品。 0106 本申请研究了野生型人骨保护素上两个可能满足具有对核因子- B受体活化因子受体的亲和活性但是对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的亲和活性低于野生型人骨保护素这两个条件的关键位点,分别为S73和K94,设计了野生型人骨保护素的突变体蛋白 OPGS73G、 OPGS73A、 OPGS73V、 OPGS73L和OPGK94A。具体见如下实施例。 0107 实施例1、制备野生型人骨保护素OPGwt及野生型人骨保护素的突变体蛋白 OPGS73A、 OPG。

40、S73V、 OPGS73G、 OPGS73L、 OPGK94A和OPGR122G 0108 1、制备野生型人骨保护素OPGwt 0109 野生型人骨保护素OPGwt的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第154至345位氨基酸残基。野生型人骨保护素OPGwt含有人全长骨保护素(氨基酸序列是GenBank Accession Number NP_002537.3(26-JUN-2017)或SEQ ID No.9)的第22-201位氨基酸残基。 0110 参照如下文献的方法制备野生型人骨保护素OPGwt： Mengmeng Jin ,et al.Sortase A-aided Escheri。

41、chia coli expression system for functional osteoprotegerin cysteine-rich domain.Appl Microbiol Biotechnol(2017)101:4923 4933.DOI10.1007/s00253-017-8188-6。具体方法如下： 0111 1.1制备DNA分子 0112 制备SEQ ID No.1所示的DNA。 SEQ ID No.1所示的DNA为融合有分选酶A(Sortase A,SrtA)和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGwt基因。 SrtA-LPETG-OPGwt基因表达S。

42、EQ ID No.2所示的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGwt。 SEQ ID No.2的N末端为分选酶sortaseA，分选说明书 6/14 页 10 CN 109306003 A 10 酶sortaseA会在LPXTG的Thr和Gly之间进行切割，释放出目的蛋白OPGwt。 OPGwt的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第154至345位氨基酸残基。 SEQ ID No.2的第158至337位氨基酸残基对应于人全长骨保护素的第22-201位氨基酸残基。将氨基酸序列是SEQ ID No.9的第22-201 位氨基酸残基的片段作为野生型。 SEQ ID No.2的第150-至。

43、154位氨基酸残基为LPXTG基序，第3至149位氨基酸残基为分选酶A的氨基酸序列。 0113 1.2制备表达载体 0114 用核苷酸序列是SEQ ID No .1的第1-1019位核苷酸的DNA替换pET28a(+) (Novagen)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGwt基因重组表达载体，命名为 pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt。 pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt含有SrtA-LPETG-OPGwt基因， pET28a-Srt。

44、A-LPETG-OPGwt导入E.coli BL21(DE3)可获得氨基酸序列是SEQ ID No.2的第 154至345位氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质含有人全长骨保护素的第22-201位氨基酸残基，将该蛋白质命名为OPGwt。 SEQ ID No.2的第158至337位氨基酸残基与人全长骨保护素的第22-201位氨基酸残基相同。 0115 1.3获得野生型人骨保护素OPGwt 0116 将pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上， 37培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将。

45、测序结果表明含有pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a- SrtA-LPETG-OPGwt。 0117 将BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt接种入含100ug/ml卡那霉素的LB培养基中扩增(37， 200rpm)， OD600达到0.6时加入IPTG诱导表达(IPTG终浓度1mM)， 37诱导5h 后超速离心收菌。菌体重悬于100ml清洗缓冲液(50mM Tris， 150mM NaCl， 5mM EDTA， 1v/v Triton X-100， pH 8.0)，超声破碎后再次以清洗缓冲液清洗并。

46、离心保留沉淀，此过程多次重复进行，获得包涵体，分装冻存。包涵体室温下溶于溶解缓冲液中(6M盐酸胍,50mM Tris pH 8.5,1mM EDTA,150mM NaCl， 10mM DTT)蛋白浓度为30mg/ml,再以复性缓冲液(20mM Na2HPO4， 1M L-精氨酸， 20甘油， 10mM还原型谷胱甘肽和1mM氧化型谷胱甘肽， pH 7.3)稀释至蛋白浓度10mg/ml，溶液装入透析袋中置于透析液(20mM Na2HPO4pH 7.3,0.5M L-精氨酸和10甘油)中4条件下透析12h，更换透析液(20mM Na2HPO4pH7.3,0.2M L-精氨酸,5甘。

47、油)，再次置于4条件下12h，再次更换透析液(20mM Na2HPO4pH7.3)置于4条件下12h。所获蛋白超速离心(20,000g 10min)后行分子筛层析纯化(Superdex200,GE Healthcare)得到野生型人骨保护素OPGwt，分装后-80冻存。分子筛层析纯化所用缓冲液为Tris缓冲液 (0.1M Tris,50mMNaCl pH 7.0)。 0118 2、制备人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A 0119 人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A的氨基酸序列为SEQ ID No.3，是将人全长骨保。

48、护素的第73位丝氨酸残基(对应于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基)突变为丙氨酸残基 (SEQ ID No.3的第56位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素OPGwt的区别仅在于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基(对应于SEQ ID No.3的第56位氨基酸残基)。说明书 7/14 页 11 CN 109306003 A 11 0120 2.1制备DNA分子 0121 将SEQ ID No.1的第627-629位的agc(丝氨酸的密码子)替换为gca(丙氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶A。

49、和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73A基因。 SrtA-LPETG-OPGS73A基因表达融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73A。 SrtA-LPETG-OPGS73A的氨基酸序列是将SEQ ID No.2的第209位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。 0122 2.2制备表达载体 0123 用融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73A基因替换pET28a(+)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGS73A基因重组表达载体，命名为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A。 pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A含有SrtA-LPETG-OPGS73A基因， pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A 导入E.coli BL21(DE3)可获。

摘要
申请专利号：	CN201710630737.5	申请日：	20170728
公开号：	CN109306003A	公开日：	20190205
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C07K14/705,C07K19/00,C12N15/12,C12N5/10,A61K38/17,A61P19/08	主分类号：	C07K14/705,C07K19/00,C12N15/12,C12N5/10,A61K38/17,A61P19/08
申请人：	北京济全生物科技有限公司
发明人：	王玮,尚腾飞
地址：	100070 北京市丰台区科学城海鹰路8号院3号路南楼309室
优先权：	CN201710630737A
专利代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司	代理人：	关畅;任凤华
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内容摘要

本发明公开了骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用。该骨保护素的突变体蛋白与野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性但是所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性低于所述野生型骨保护素。实验证明，本发明的骨保护素的突变体蛋白与相应的野生相比，抑制RANKL诱导破骨细胞分化能力无显著差别，并可以克服野生型抑制TRAIL抗肿瘤作用的缺陷，更高效、安全地发挥防治骨吸收相关疾病的作用。

权利要求书

1.野生型骨保护素的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白是由野生型骨保护素进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性但是所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性低于所述野生型骨保护素对所述TRAIL的亲和活性。 2.根据权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性为所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性是所述野生型骨保护素对RANKL的亲和活性的70％以上。 3.根据权利要求1或2所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的亲和活性低于所述野生型骨保护素为所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性是所述野生型骨保护素对TRAIL的亲和活性的25％以下。 4.根据权利要求3所述的突变体蛋白，其特征在于：所述70％以上为a1)-a10)中的任一种：a1)大于等于76％至等于100％；a2)大于等于80％至等于100％；a3)大于等于81％至等于100％；a4)大于等于82％至等于100％；a5)大于等于83％至等于100％；a6)大于等于84％至等于100％；a7)大于等于85％至等于100％；a8)大于等于90％至等于100％；a9)大于等于95％至等于100％；a10)76％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％或100％；和/或，所述25％以下为b1)-b9)中的任一种：b1)、小于等于20％至等于0或小于等于20％至小于等于16％；b2)、小于等于16％至等于0或小于等于16％至小于等于13％；b3)、小于等于13％至等于0或小于等于13％至小于等于11％；b4)、小于等于11％至等于0或小于等于11％至小于等于10％；b5)、小于等于10％至等于0或小于等于20％至小于等于5％；b6)、小于等于5％至等于0或小于等于5％至小于等于3％；b7)、小于等于3％至等于0或小于等于3％至小于等于1％；b8)、小于等于1％至等于0；b9)、20％、16％、13％、11％、10％、5％、3％或1％。 5.根据权利要求1至3中任一所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白是将所述野生型骨保护素的第73位的丝氨酸氨基酸残基替代为其它氨基酸残基得到的蛋白质。 6.根据权利要求5所述的突变体蛋白，其特征在于：所述其它氨基酸为C1或C2：C1、非极性氨基酸或极性氨基酸；C2、所述其它氨基酸为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸或亮氨酸。 7.根据权利要求6所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白为D1至D4中的任一种：D1、氨基酸序列是SEQIDNo.4的蛋白质，或氨基酸序列是SEQIDNo.4的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；D2、氨基酸序列是SEQIDNo.5的蛋白质，或氨基酸序列是SEQIDNo.5的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；D3、氨基酸序列是SEQIDNo.6的蛋白质，或氨基酸序列是SEQIDNo.6的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；D4、氨基酸序列是SEQIDNo.3的蛋白质，或氨基酸序列是SEQIDNo.3的第5-184位氨基酸残基的蛋白质。 8.权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白的相关产品，为E1至E3中的任一种：E1、权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料可为下述B1)至B16)中的任一种：B1)编码所述突变体蛋白的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；E2、权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白的衍生物，为下述a11或a12：a11、在所述突变体蛋白的氨基端或/和羧基端融合标签蛋白得到的融合蛋白或将具有靶向性功能的蛋白与所述突变体蛋白连接得到的融合蛋白；a12、对所述突变体蛋白进行下述a21至a28中至少一种修饰得到的修饰物：a21、添加亮氨酸拉链；a22、添加异亮氨酸拉链；a23、加入锌原子和双硫基；a24、被装载到人血清白蛋白纳米颗粒中；a25、与HSA配体结合；a26、与PEG结合；a27、用聚乳酸-乙醇酸共聚物微球缓释系统装载；a28、与抗体的Fc段结合；E3、权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白的单聚体或多聚体。 9.抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物，其特征在于：所述药物含有权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白或/和权利要求8所述的相关产品。 10.权利要求1-7中任一所述的突变体蛋白或/和权利要求8所述的相关产品在制备抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用。

背景技术

以骨质疏松症、关节炎为代表的骨吸收相关疾病是世界常见的多发病，已严重影响了人类健康。骨吸收相关疾病的病理特征为骨吸收―形成失平衡，而调节骨吸收和形成平衡的最重要的信号传导通路被证明是OPG/RANKL/RANK系统。在该系统中，骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)作为中心环节，发挥着至关重要的作用。

1997年，美国和日本两个研究组同期发现了OPG蛋白。它属于TNF受体超家族成员，为可溶性、分泌性糖蛋白，由401个氨基酸组成，表达于成骨细胞/骨间质细胞中，是目前发现的唯一的破骨细胞负向调节因子。因考虑到OPG对破骨细胞的重要调节作用，上述两个研究组立即开始查找与OPG密切相关的蛋白，发现了其配体—核因子-кB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)和破骨细胞表面膜受体RANK(the receptor activator of NF-κB)。短短2年，OPG/RANKL/RANK系统为人们所认识，回答了成骨细胞调控破骨细胞的准确机制：OPG相当于整个OPG/RANKL/RANK系统的制动器。它作为RANKL的假受体，竞争性抑制RANKL与RANK结合，从而抑制破骨细胞活性和分化,对抗骨质疏松，因此RANKL/OPG比例成为骨质疏松致病机制中的关键因素。许多激素和细胞因子(例如TGF-β、PTH、1，25-VD3、糖皮质激素和雌激素)都通过OPG通路起作用。骨质疏松小鼠注射OPG后，骨密度明显上升，而OPG基因敲除小鼠表现为严重骨质疏松。

OPG防治骨质疏松的重要作用被揭示后，成为竞相追捧的“明星蛋白”。世界最大的生物公司-Amgen尝试开发的OPG-Fc曾进入到临床Ⅱ期研究，初步实验表明OPG能够抑制人体骨吸收，对抗骨质疏松。Amgen公司甚至和美国航空航天局(NASA)合作开展了OPG预防废用性骨质疏松症的太空实验。正当OPG作为抗骨质疏松药物的研发蓬勃开展的时候，Amgen公司却在2005年停止了对该蛋白的研发投入，放弃了关于OPG的进一步研究。其它实验室对OPG的研究也近于停滞。其原因之一是发现OPG存在着缺陷，影响了其临床应用：RANKL的结构与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)相似，OPG与RANKL结合的同时也能与TRAIL结合，抑制了TRAIL的抗癌作用，加大肿瘤发生的风险。TRAIL是一种人体自分泌的蛋白，其能特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显细胞毒作用。

2006年澳大利亚EvoGenix公司申请了一种OPG突变体衍生物的专利(US 2006/0189528 A1)，其所涉及的基因突变位点主要为I115，R122和F128。通过这些位点氨基酸的替换，降低OPG突变体与TRAIL的结合能力，从而减少其促进肿瘤发生的危险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何在保留野生型骨保护素的抑制RANKL介导的破骨细胞活化的能力的情况下，降低野生型骨保护素对TRAIL的抗癌作用的抑制。

为了解决以上技术问题，本发明提供了野生型骨保护素的突变体蛋白，所述突变体蛋白是由野生型骨保护素进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对核因子-кB受体活化因子配体(RANKL)的亲和活性但是所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的亲和活性低于所述野生型骨保护素对所述TRAIL的亲和活性。

上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素包括野生型骨保护素的全长片段，也包括野生型骨保护素的活性片段。

上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素可来源于任何物种，如来源于哺乳动物的骨保护素，如人。

上述突变体蛋白中，人野生型骨保护素的全长氨基酸序列是SEQ ID No.9，如GenBank Accession Number NP_002537.3(26-JUN-2017)所示。

上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素可为人野生型骨保护素的活性片段。所述人野生型骨保护素的活性片段的氨基酸序列可为全长序列的第22-201位氨基酸残基。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白包括任何在所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代的变异蛋白，无论是截短的还是全长的，无论是单体形式还是二聚体形式。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白和所述野生型骨保护素对RANKL的亲和活性和对TRAIL的亲和活性之间的比较是基于大小相似的蛋白质进行的。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性可为所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性是所述野生型骨保护素对RANKL的亲和活性的70％以上。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的亲和活性低于所述野生型骨保护素为所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性是所述野生型骨保护素对TRAIL的亲和活性的25％以下。

上述突变体蛋白中，所述70％以上可为a1)-a10)中的任一种：

a1)大于等于76％至等于100％；

a2)大于等于80％至等于100％；

a3)大于等于81％至等于100％；

a4)大于等于82％至等于100％；

a5)大于等于83％至等于100％；

a6)大于等于84％至等于100％；

a7)大于等于85％至等于100％；

a8)大于等于90％至等于100％；

a9)大于等于95％至等于100％；

a10)76％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％或100％。

上述突变体蛋白中，所述25％以下可为b1)-b9)中的任一种：

b1)、小于等于20％至等于0或小于等于20％至小于等于16％；

b2)、小于等于16％至等于0或小于等于16％至小于等于13％；

b3)、小于等于13％至等于0或小于等于13％至小于等于11％；

b4)、小于等于11％至等于0或小于等于11％至小于等于10％；

b5)、小于等于10％至等于0或小于等于20％至小于等于5％；

b6)、小于等于5％至等于0或小于等于5％至小于等于3％；

b7)、小于等于3％至等于0或小于等于3％至小于等于1％；

b8)、小于等于1％至等于0；

b9)、20％、16％、13％、11％、10％、5％、3％或1％。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白可为将所述野生型骨保护素的第73位的丝氨酸氨基酸残基替代为其它氨基酸残基得到的蛋白质。

所述其它氨基酸残基本领域技术人员可根据所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性和对TRAIL的亲和活性确定，只要能使所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性满足上述a1)-a10)中任一种，对TRAIL的亲和活性满足上述b1)-b9)中的任一种要求的其它氨基酸残基均可选用。

所述其它氨基酸可从r1)至r4)中选择：

r1)下述19种氨基酸中的任一种：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；所述氨基酸的构象为L型；

r2)下述19种氨基酸中的任一种：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；所述氨基酸的构象为D型；D型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相对应的氨基酸；

r3)对所述r1)或r2)进行化学修饰得到的人工修饰的氨基酸；

r4)自然界存在的稀有氨基酸。

所述r3)中的化学修饰可为甲基化或磷酸化等修饰。

所述自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸或高丝氨酸等。

上述突变体蛋白中，所述其它氨基酸可为C1或C2：

C1、非极性氨基酸或极性氨基酸；

C2、所述其它氨基酸为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸或亮氨酸。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在序列上只是所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基发生替代，其它氨基酸残基没有发生替代。具体地，上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在序列上只有所述野生型骨保护素的全长序列的第73位氨基酸残基不同，其它氨基酸残基均相同。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白具体可为D1至D4中的任一种：

D1、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质(名称为OPGS73V)，或氨基酸序列是SEQ ID No.4的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；

D2、氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质(名称为OPGS73G)，或氨基酸序列是SEQ ID No.5的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；

D3、氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质(名称为OPGS73L)，或氨基酸序列是SEQ ID No.6的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；

D4、氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质(名称为OPGS73A)，或氨基酸序列是SEQ ID No.3的第5-184位氨基酸残基的蛋白质。

下述E1至E3的所述突变体蛋白的相关产品，也属于本发明的保护范围：

E1、所述突变体蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料可为下述B1)至B16)中的任一种：

B1)编码所述突变体蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

E2、所述突变体蛋白的衍生物，为下述a11或a12：

a11、在所述突变体蛋白的氨基端或/和羧基端融合标签蛋白得到的融合蛋白或将具有靶向性功能的蛋白与所述突变体蛋白连接得到的融合蛋白；

a12、对所述突变体蛋白进行下述a21至a28中至少一种修饰得到的修饰物：

a21、添加亮氨酸拉链；

a22、添加异亮氨酸拉链；

a23、加入锌原子和双硫基；

a24、被装载到人血清白蛋白纳米颗粒中；

a25、与HSA配体结合；

a26、与PEG结合；

a27、用聚乳酸-乙醇酸共聚物微球缓释系统装载；

a28、与抗体的Fc段(可结晶片段)结合；

E3、所述突变体蛋白的单聚体或多聚体。

上述相关产品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述相关产品中，所述重组微生物可为将所述突变体蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物可为F11至F14中的任一种:

F11、原核微生物；

F12、革兰氏阴性细菌；

F13、埃希氏菌属细菌；

F14、大肠杆菌BL21(DE3)。

上述生物材料中，B9)至B16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。

上述相关产品中，所述具有靶向性功能的蛋白可为抗体或转铁蛋白。所述抗体可为单链抗体或完整抗体。所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His6标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白或SUMO标签蛋白等。

本发明还提供了抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物。

本发明所提供的抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物，含有所述突变体蛋白或/和所述相关产品。

所述抑制RANKL介导的破骨细胞活化的药物具体可为预防和/或治疗骨吸收相关疾病的药物，如预防和/或治疗骨质疏松症的药物、预防和/或治疗关节炎的药物等。上述物中，所述药物的活性成分可为所述突变体蛋白或/和所述相关产品，所述药物的活性成分还可含有其它成分，所述药物的其它活性成分本领域技术人员可根据其抑制RANKL介导的破骨细胞活化效果确定。

上述药物中，所述药物还可含有载体或赋形剂。所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲基纤维素等)。

实验证明，将人野生型骨保护素全长序列的第73位的丝氨基酸残基(S73)分别替代为丙氨酸残基、缬氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基得到的突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L与相应的野生OPG(OPGwt)相比，与RANKL的亲和力分别是野生型的0.84倍、0.85倍、0.81倍、0.76倍，与TRAIL亲和力分别是野生型的0.16倍、0.03倍、0.13倍和0.11倍。突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L与相应的野生OPG(OPGwt)相比，抑制RANKL诱导破骨细胞分化能力无显著差别。说明S73位点的突变没有降低OPG对RANKL的抑制作用。突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L对TRAIL的抑制作用远低于野生OPG(OPGwt)，这些OPG突变体蛋白可以克服野生型抑制TRAIL抗肿瘤作用的缺陷，更高效、安全地发挥防治骨吸收相关疾病的作用。

附图说明

图1为经分子筛纯化后获得的OPGwt、OPGS73G和OPGK94A的鉴定结果。

A为SDS-PAGE电泳鉴定。1-3道分别为OPGwt、OPGS73G和OPGK94A，箭头所示为各道的纯化蛋白。

B为OPGS73G复性后分子筛纯化图像。箭头所示为OPGS73G的洗脱峰。

图2为OPG抑制RANKL刺激RAW264.7细胞分化成熟为破骨细胞的实验。图中，wOPG为野生型人骨保护素OPGwt，D1为OPGS73G，D101为OPGS73A，D102为OPGS73V，D103为OPGS73L，D2为OPGK94A，D3为阳性对照OPGR122G。Negative孔中RANKL的浓度是0ng/ml，OPG的浓度是0ng/ml；RANKL的孔中RANKL的浓度为50ng/ml，OPG的浓度是0ng/ml；RANKL：OPG1:1的孔中RANKL的浓度为50ng/ml，OPG的浓度是50ng/ml，RANKL：OPG1:2的孔中RANKL的浓度为50ng/ml，OPG的浓度是100ng/ml，RANKL：OPG1:4的孔中RANKL的浓度为50ng/ml，OPG的浓度是200ng/ml，RANKL：OPG1:8的孔中RANKL的浓度为50ng/ml，OPG的浓度是400ng/ml。

图3为OPG抑制TRAIL导致的colo205细胞凋亡实验。图中，wOPG为野生型人骨保护素OPGwt，D1为OPGS73G，D101为OPGS73A，D102为OPGS73V，D103为OPGS73L，D2为OPGK94A，D3为阳性对照OPGR122G。Negative孔中TRAIL的浓度是0ng/ml，OPG的浓度是0ng/ml；TRAIL的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml；TRAIL：OPG1:1的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml，OPG的浓度是100ng/ml，TRAIL：OPG1:5的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml，OPG的浓度是500ng/ml，TRAIL：OPG1:25的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml，OPG的浓度是2500ng/ml，TRAIL：OPG1:125的孔中TRAIL的浓度是100ng/ml，OPG的浓度是12500ng/ml。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的TRAIL来源于人，其氨基酸序列如NCBI Reference Sequence:NP_003801.1(Update Date：06-MAY-2017)，由281个氨基酸残基组成，为Peprotech公司产品。

下述实施例中的RANKL来源于人，其氨基酸序列如NCBI Reference Sequence:NP_003692.1(Update Date：02-JUL-2017)由317个氨基酸残基组成，为Abcam公司产品。

本申请研究了野生型人骨保护素上两个可能满足具有对核因子-кB受体活化因子受体的亲和活性但是对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的亲和活性低于野生型人骨保护素这两个条件的关键位点,分别为S73和K94,设计了野生型人骨保护素的突变体蛋白OPGS73G、OPGS73A、OPGS73V、OPGS73L和OPGK94A。具体见如下实施例。

实施例1、制备野生型人骨保护素OPGwt及野生型人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G

1、制备野生型人骨保护素OPGwt

野生型人骨保护素OPGwt的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第154至345位氨基酸残基。野生型人骨保护素OPGwt含有人全长骨保护素(氨基酸序列是GenBank Accession Number NP_002537.3(26-JUN-2017)或SEQ ID No.9)的第22-201位氨基酸残基。

参照如下文献的方法制备野生型人骨保护素OPGwt：Mengmeng Jin,et al.Sortase A-aided Escherichia coli expression system for functional osteoprotegerin cysteine-rich domain.Appl Microbiol Biotechnol(2017)101:4923–4933.DOI10.1007/s00253-017-8188-6。具体方法如下：

1.1制备DNA分子

制备SEQ ID No.1所示的DNA。SEQ ID No.1所示的DNA为融合有分选酶A(Sortase A,SrtA)和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGwt基因。SrtA-LPETG-OPGwt基因表达SEQ ID No.2所示的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGwt。SEQ ID No.2的N末端为分选酶sortaseA，分选酶sortaseA会在LPXTG的Thr和Gly之间进行切割，释放出目的蛋白OPGwt。OPGwt的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第154至345位氨基酸残基。SEQ ID No.2的第158至337位氨基酸残基对应于人全长骨保护素的第22-201位氨基酸残基。将氨基酸序列是SEQ ID No.9的第22-201位氨基酸残基的片段作为野生型。SEQ ID No.2的第150-至154位氨基酸残基为LPXTG基序，第3至149位氨基酸残基为分选酶A的氨基酸序列。

1.2制备表达载体

用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第1-1019位核苷酸的DNA替换pET28a(+)(Novagen)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGwt基因重组表达载体，命名为pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt。pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt含有SrtA-LPETG-OPGwt基因，pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt导入E.coli BL21(DE3)可获得氨基酸序列是SEQ ID No.2的第154至345位氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质含有人全长骨保护素的第22-201位氨基酸残基，将该蛋白质命名为OPGwt。SEQ ID No.2的第158至337位氨基酸残基与人全长骨保护素的第22-201位氨基酸残基相同。

1.3获得野生型人骨保护素OPGwt

将pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt。

将BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt接种入含100ug/ml卡那霉素的LB培养基中扩增(37℃，200rpm)，OD600达到0.6时加入IPTG诱导表达(IPTG终浓度1mM)，37℃诱导5h后超速离心收菌。菌体重悬于100ml清洗缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，5mM EDTA，1％v/v Triton X-100，pH 8.0)，超声破碎后再次以清洗缓冲液清洗并离心保留沉淀，此过程多次重复进行，获得包涵体，分装冻存。包涵体室温下溶于溶解缓冲液中(6M盐酸胍,50mM Tris pH 8.5,1mM EDTA,150mM NaCl，10mM DTT)蛋白浓度为30mg/ml,再以复性缓冲液(20mM Na2HPO4，1M L-精氨酸，20％甘油，10mM还原型谷胱甘肽和1mM氧化型谷胱甘肽，pH 7.3)稀释至蛋白浓度10mg/ml，溶液装入透析袋中置于透析液(20mM Na2HPO4pH 7.3,0.5M L-精氨酸和10％甘油)中4℃条件下透析12h，更换透析液(20mM Na2HPO4pH7.3,0.2M L-精氨酸,5％甘油)，再次置于4℃条件下12h，再次更换透析液(20mM Na2HPO4pH7.3)置于4℃条件下12h。所获蛋白超速离心(20,000g 10min)后行分子筛层析纯化(Superdex200,GE Healthcare)得到野生型人骨保护素OPGwt，分装后-80℃冻存。分子筛层析纯化所用缓冲液为Tris缓冲液(0.1M Tris,50mMNaCl pH 7.0)。

2、制备人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A

人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A的氨基酸序列为SEQ ID No.3，是将人全长骨保护素的第73位丝氨酸残基(对应于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基)突变为丙氨酸残基(SEQ ID No.3的第56位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素OPGwt的区别仅在于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基(对应于SEQ ID No.3的第56位氨基酸残基)。

2.1制备DNA分子

将SEQ ID No.1的第627-629位的agc(丝氨酸的密码子)替换为gca(丙氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶A和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73A基因。SrtA-LPETG-OPGS73A基因表达融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73A。SrtA-LPETG-OPGS73A的氨基酸序列是将SEQ ID No.2的第209位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

2.2制备表达载体

用融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73A基因替换pET28a(+)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGS73A基因重组表达载体，命名为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A。pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A含有SrtA-LPETG-OPGS73A基因，pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A导入E.coli BL21(DE3)可获得氨基酸序列是SEQ ID No.3的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A。

2.3获得人全长骨保护素的第73位氨基酸残基Ser发生突变的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A得到含有pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A；将1.3的BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A，得到人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A。

3、制备人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基突变为缬氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73V

人骨保护素的突变体蛋白OPGS73V的氨基酸序列为SEQ ID No.4，是将人全长骨保护素(氨基酸序列是GenBank Accession Number NP_002537.3(26-JUN-2017))的第73位的丝氨酸残基(对应于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基)突变为缬氨酸残基(对应于SEQ ID No.4的第56位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白OPGS73V在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素OPGwt的区别仅在于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基(对应于SEQ ID No.4的第56位氨基酸残基)。

3.1制备DNA分子

将SEQ ID No.1的第627-629位的agc(丝氨酸的密码子)替换为gtc(缬氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶A和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73V基因。SrtA-LPETG-OPGS73V基因表达融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73V。SrtA-LPETG-OPGS73V的氨基酸序列是将SEQ ID No.2的第209位的丝氨酸残基突变为缬氨酸残基，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

3.2制备表达载体

用融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73V基因替换pET28a(+)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGS73V基因重组表达载体，命名为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73V。pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73V含有SrtA-LPETG-OPGS73V基因，pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73V导入E.coli BL21(DE3)可获得氨基酸序列是SEQ ID No.4的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73V。

3.3获得人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基突变为缬氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73V

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73V得到含有pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73V的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73V；将1.3的BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73V，得到人骨保护素的突变体蛋白OPGS73V。

4、制备人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基突变为甘氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73G

人骨保护素的突变体蛋白OPGS73G的氨基酸序列为SEQ ID No.5，是将人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基(对应于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基)突变为甘氨酸残基(对应于SEQ ID No.5的第56位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白OPGS73G在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素OPGwt的区别仅在于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基(对应于SEQ ID No.5的第56位氨基酸残基)。

4.1制备DNA分子

将SEQ ID No.1的第627-629位的agc(丝氨酸的密码子)替换为ggt(甘氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶A和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73G基因。SrtA-LPETG-OPGS73G基因表达融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73G。SrtA-LPETG-OPGS73G的氨基酸序列是将SEQ ID No.2的第209位的丝氨酸残基突变为甘氨酸残基，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

4.2制备表达载体

用融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73G基因替换pET28a(+)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGS73G基因重组表达载体，命名为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73G。pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73G含有SrtA-LPETG-OPGS73G基因，pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73G导入E.coli BL21(DE3)可获得氨基酸序列是SEQ ID No.5的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73G。

4.3获得人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基突变为甘氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73G

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73G得到含有pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73G的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73G；将1.3的BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73G，得到人骨保护素的突变体蛋白OPGS73G。

5、制备人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基突变为亮氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73L

人骨保护素的突变体蛋白OPGS73L的氨基酸序列为SEQ ID No.6，是将人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基(对应于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基)突变为亮氨酸残基(对应于SEQ ID No.6的第56位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白OPGS73L在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素OPGwt的区别仅在于SEQ ID No.2的第209位氨基酸残基(对应于SEQ ID No.6的第56位氨基酸残基)。

5.1制备DNA分子

将SEQ ID No.1的第627-629位的agc(丝氨酸的密码子)替换为ctg(亮氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶A和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73L基因。SrtA-LPETG-OPGS73L基因表达融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73L。SrtA-LPETG-OPGS73L的氨基酸序列是将SEQ ID No.2的第209位的丝氨酸残基突变为亮氨酸残基，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

5.2制备表达载体

用融合蛋白SrtA-LPETG-OPGS73L基因替换pET28a(+)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGS73L基因重组表达载体，命名为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73L。pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73L含有SrtA-LPETG-OPGS73L基因，pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73L导入E.coli BL21(DE3)可获得氨基酸序列是SEQ ID No.6的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73L。

5.3获得人全长骨保护素的第73位的丝氨酸残基突变为亮氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73L

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73L得到含有pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73L的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73L；将1.3的BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73L，得到人骨保护素的突变体蛋白OPGS73L。

6、制备人全长骨保护素的第94位的赖氨基酸残基突变为丙氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGK94A

人骨保护素的突变体蛋白OPGK94A是将SEQ ID No.3的第56位的丙氨酸残基(对应于人全长骨保护素的第73位)突变为丝氨酸残基、并将第SEQ ID No.3的第77位的赖氨酸残基(对应于人全长骨保护素的第94位，SEQ ID No.2的第230位)突变为丙氨酸残基，保持SEQ ID No.3的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。在本申请中作为对照。

6.1制备DNA分子

将SEQ ID No.1的第690-692位的aag(赖氨酸的密码子)替换为gca(丙氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶A和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGK94A基因。SrtA-LPETG-OPGK94A基因表达融合蛋白SrtA-LPETG-OPGK94A。SrtA-LPETG-OPGK94A的氨基酸序列是将SEQ ID No.2的第230位的赖氨基酸残基突变为丙氨酸残基，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

6.2制备表达载体

用融合蛋白SrtA-LPETG-OPGK94A基因替换pET28a(+)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGK94A基因重组表达载体，命名为pET28a-SrtA-LPETG-OPGK94A。pET28a-SrtA-LPETG-OPGK94A含有SrtA-LPETG-OPGK94A基因，pET28a-SrtA-LPETG-OPGK94A导入E.coli BL21(DE3)可获得人骨保护素的突变体蛋白OPGK94A。

6.3获得人全长骨保护素的第94位的赖氨基酸残基突变为丙氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGK94A

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为pET28a-SrtA-LPETG-OPGK94A得到含有pET28a-SrtA-LPETG-OPGK94A的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGK94A；将1.3的BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGK94A，得到人骨保护素的突变体蛋白OPGK94A。

7、制备人全长骨保护素的第122位的精氨酸残基突变为甘氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGR122G

US 2006/0189528A1披露了人骨保护素的突变体蛋白R122G。本申请中制备R122G作为阳性对照。

人骨保护素的突变体蛋白R122G(在本申请中称为OPGR122G)的氨基酸序列为SEQ ID No.9，含有人全长骨保护素的第22-194位氨基酸残基但将人全长骨保护素的第122位的精氨酸残基突变为甘氨酸残基(对应于SEQ ID No.8的第258位氨基酸残基)的突变体。

7.1制备DNA分子

制备SEQ ID No.7的DNA分子。SEQ ID No.7所示的DNA为融合有分选酶A(Sortase A,SrtA)和LPXTG基序的融合蛋白SrtA-LPETG-OPGR122G基因。SrtA-LPETG-OPGR122G基因表达融合蛋白SrtA-LPETG-OPGR122G。

7.2制备表达载体

用融合蛋白SrtA-LPETG-OPGR122G基因替换pET28a(+)的NcoI和XhoI识别位点间的片段(包括NcoI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到SrtA-LPETG-OPGR122G基因重组表达载体，命名为pET28a-SrtA-LPETG-OPGR122G。pET28a-SrtA-LPETG-OPGR122G含有SrtA-LPETG-OPGR122G基因，pET28a-SrtA-LPETG-OPGR122G导入E.coli BL21(DE3)可获得氨基酸序列是SEQ ID No.8的人骨保护素的突变体蛋白OPGR122G。

7.3人全长骨保护素的第122位的精氨酸残基突变为甘氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白OPGR122G

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为pET28a-SrtA-LPETG-OPGR122G得到含有pET28a-SrtA-LPETG-OPGR122G的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGR122G；将1.3的BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt替换为BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGR122G，得到人骨保护素的突变体蛋白OPGR122G。

8、实验结果

结果表明BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGwt、BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73A、BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73V、BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73G、BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGS73L、BL21(DE3)/pET28a-SrtA-LPETG-OPGK94A和pET28a-SrtA-LPETG-OPGR122G经IPTG诱导后发现以表达蛋白以包涵体形式存在。本实施例通过制备包涵体、蛋白变性、复性，并经分子筛(AKTA Avant，GE Healthcare)纯化获得相应的可溶性的野生型人骨保护素OPGwt，人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G(图1)。

实施例2、野生型人骨保护素OPGwt及人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G的与RANKL和TRAIL的亲和力测定

采用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术进行，使用仪器设备为BIAcore 3000(GE Healthcare)，以RANKL或TRAIL为固定相固定于CM5芯片表面某一通道(稀释配给入10mM醋酸钠pH5.5)，响应值上升约2000RU为佳；以TNFRSF9固定于另一通道作为内参；实施例1制备的OPGwt及人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G为流动相，以BIacore缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.005％Tween 20,pH 7.4)分别将OPGwt及人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G配制为不同浓度(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100nM)，依次流过通道，结果以传感图的形式记录，并使用BIA evaluation software 4.1(Biacore,GE Healthcare)按照1:1的结合模型进行拟合，计算平衡-解离常数(KD)。

表1、野生型人骨保护素OPGwt及人骨保护素的突变体蛋白与RANKL及TRAIL的亲和力。

注：wild为野生型人骨保护素OPGwt，D1为OPGS73G，D101为OPGS73A，D102为OPGS73V，D103为OPGS73L，D2为OPGK94A，D3为阳性对照OPGR122G。

结果如表1所示，表明：

OPGS73G与RANKL的亲和力(KD＝6.49×10-9)同野生型OPGwt与RANKL亲和力(KD＝5.22×10-9)接近，是野生型的0.81倍；但其与TRAIL亲和力较野生型相比显著下降(5.09×10-7及6.55×10-8)，是野生型的0.13倍。

OPGS73A与RANKL的亲和力(KD＝6.25×10-9)同野生型OPGwt与RANKL亲和力(KD＝5.22×10-9)接近，是野生型的0.84倍；但其与TRAIL亲和力较野生型相比显著下降(4.12×10-7及6.55×10-8)，是野生型的0.16倍。

OPGS73V与RANKL的亲和力(KD＝6.14×10-9)同野生型OPGwt与RANKL亲和力(KD＝5.22×10-9)接近，是野生型的0.85倍，但其与TRAIL亲和力较野生型相比极显著下降(1.95×10-6及6.55×10-8)，是野生型的0.03倍。

OPGS73L与RANKL的亲和力(KD＝6.90×10-9)同野生型OPGwt与RANKL亲和力(KD＝5.22×10-9)接近，是野生型的0.76倍；但其与TRAIL亲和力较野生型相比显著下降(5.85×10-7及6.55×10-8)，是野生型的0.11倍。

OPGK94A与RANKL的亲和力(KD＝6.44×10-9)同野生型OPGwt与RANKL亲和力(KD＝5.22×10-9)接近，是野生型的0.81倍，但其与TRAIL亲和力较野生型相比也接近(7.01×10-8及6.55×10-8)，是野生型的0.93倍。

阳性对照OPGR122G与RANKL的亲和力(KD＝6.96×10-9)同野生型OPGwt与RANKL亲和力(KD＝5.22×10-9)接近，是野生型的0.75倍，但其与TRAIL亲和力较野生型相比显著下降(2.62×10-7及6.55×10-8)，是野生型的0.25倍。

以上结果说明，本申请的人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G和OPGS73L对RANKL的亲和力高于阳性对照OPGR122G，对TRAIL的亲和力均显著低于阳性对照OPGR122G。虽然OPGK94A对RANKL的亲和力高于阳性对照OPGR122G，但是对TRAIL的亲和力也显著高于阳性对照OPGR122G。

实施例3、野生型人骨保护素OPGwt及人骨保护素的突变体蛋白OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G的生物学活性

1、抑制RANKL介导的破骨细胞活化实验

RANKL诱导的破骨细胞的分化和成熟以多核细胞的形成和多核细胞表达抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)为标志。

利用RAW264.7细胞分化实验来检测野生型人骨保护素OPGwt及人骨保护素的突变体蛋白抑制RANKL介导的破骨细胞活化的能力。小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7在RANKL刺激下分化为破骨细胞。具体试验方法如下：小鼠巨噬细胞来源细胞系RAW264.7传代至24孔板(1×104细胞/孔)，使用含10％FBS的α-MEM培养基培养。各孔加入RANKL至其终浓度50ng/ml，诱导RAW264.7细胞分化成破骨细胞，并加入不同浓度的OPG(实施例1制备的OPGwt、OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G)抑制RANKL的促分化作用，细胞在恒温培养箱(37℃，含5％CO2)培养4天，使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒进行染色，按文献报道方式(Polek et al.2003)显微镜下对多核(细胞核数量>3个)TRAP染色阳性的细胞进行计数。同时设不加RANKL和OPG的阴性对照组。实验重复4次并进行统计分析。

RAW264.7细胞分化后TRAP染色定量分析结果如图2所示，相对于阴性对照组(Negative),RANKL组(RANKL)的TRAP阳性多核细胞有显著增加，说明RANKL成功地刺激了RAW264.7细胞的分化为成熟的破骨细胞。随着OPG浓度的增加，各组TRAP阳性多核细胞比例不断下降，说明OPG起到了抑制RANKL活性的作用。与野生OPG(OPGwt)相比，突变体OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G抑制RANKL诱导破骨细胞分化能力无显著差别。说明S73位点的突变没有降低OPG对RANKL的抑制作用。该结果与实施例2的亲和力测定结果相吻合。

2、抑制TRAIL导致的肿瘤细胞凋亡实验

TRAIL诱导的细胞凋亡实验采用sub-G1DNA含量分析的方法(Allen et al.2012)。即在人结肠癌细胞Colo205细胞培养基中加入TRAIL至其浓度100ng/ml及不同浓度的OPG(实施例1制备的OPGwt、OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L、OPGK94A和OPGR122G)，细胞在恒温培养箱(37℃，含5％CO2)培养3h。离心收集细胞，清洗后重悬于含80％乙醇的PBS(pH7.4)中，离心弃上清后再次以含0.2％Triton X-100和0.5mg/ml RNA酶的PBS重悬，后以25ug/ml碘化丙啶染色后FACSort流式细胞仪(BD Biosciences,Mountain View,CA)行流式细胞检测。同时设不加TRAIL和OPG的阴性对照组(Negative)。

实验结果如图3所示，TRAIL成功地促使了50.25％±5.74％的colo205细胞的凋亡。随着OPG浓度的增加，野生OPG组细胞凋亡比例不断下降，说明TRAIL诱导细胞凋亡作用受到抑制；与之相比，突变体OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L各组随着OPG浓度增加细胞凋亡比例下降较少，特别是OPGS73V最高浓度组(OPGS73V浓度为12.5μg/ml，TRAIL:OPG＝1:125)细胞凋亡比例为37.75％±3.22％，接近仅加入TRAIL诱导表达的对照组(50.25％±5.74％)，远高于野生OPG(OPGwt)最高浓度组(11.00％±3.26％)。另一突变体OPGK94A的细胞凋亡比例下降则很多(最高浓度时为16.55±3.54％)。此外，作为阳性对照的OPGR122G在其最高浓度时细胞凋亡比例为21.25±2.65％。该实验结果表明，突变体OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L对TRAIL的抑制作用远低于野生OPG(OPGwt)，甚至低于阳性对照的OPGR122G，其降低程度甚至优于阳性对照OPGR122G位点的突变。该结果与实施例2的亲和力测定结果相吻合。

综合以上结果说明，本申请成功找到了新的符合研究设想——RANKL亲和力不变但TRAIL亲和力显著下降的OPG上的S73突变位点，并且通过多种氨基酸替代，获得了较理想的OPGS73A、OPGS73V、OPGS73G、OPGS73L这些OPG突变体蛋白。这些OPG突变体蛋白可以克服野生型抑制TRAIL抗肿瘤作用的缺陷，更高效、安全地发挥防治骨吸收相关疾病的作用。

<110> 北京济全生物科技有限公司

<120> 骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1040

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (3)..(1040)

<230>

<400> 1

ccatgggcca agctaaacct caaattccga aagataaatc gaaagtggca ggctatattg 60

aaattccaga tgctgatatt aaagaaccag tatatccagg accagcaaca cctgaacaat 120

taaatagagg tgtaagcttt gcagaagaaa acgaatcact agatgatcaa aatatttcaa 180

ttgcaggaca cactttcatt gaccgtccga actatcaatt tacaaatctt aaagcagcca 240

aaaaaggtag tatggtgtac tttaaagttg gtaatgaaac acgtaagtat aaaatgacaa 300

gtataagaga tgttaagcct acagatgtag aagttctaga tgaacaaaaa ggtaaagata 360

aacaattaac attaattact tgtgatgatt acaatgaaaa gacaggcgtt tgggaaacac 420

gtaaaatctt tgtagctaca gaagtcaaac tgccggaaac cggcggtgga tccgaaacgt 480

ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg tgtgacaaat 540

gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc gtgtgcgccc 600

cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt ctatactgca 660

gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc cacaaccgcg 720

tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa cataggagct 780

gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca gtttgcaaaa 840

gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt agaaaacaca 900

caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca cacgacaaca 960

tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc ctgctcgagc 1020

accaccacca ccaccactga 1040

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<230>

<400> 2

Met Gly Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro

20 25 30

Gly Pro Ala Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu

35 40 45

Glu Asn Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr

50 55 60

Phe Ile Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys

65 70 75 80

Lys Gly Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr

85 90 95

Lys Met Thr Ser Ile Arg Asp Val Lys Pro Thr Asp Val Glu Val Leu

100 105 110

Asp Glu Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp

115 120 125

Asp Tyr Asn Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Thr Arg Lys Ile Phe Val

130 135 140

Ala Thr Glu Val Lys Leu Pro Glu Thr Gly Gly Gly Ser Glu Thr Phe

145 150 155 160

Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu

165 170 175

Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala

180 185 190

Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp

195 200 205

Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys

210 215 220

Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val

225 230 235 240

Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys

245 250 255

His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro

260 265 270

Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn

275 280 285

Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val

290 295 300

Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile

305 310 315 320

Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr

325 330 335

Leu Leu Glu His His His His His His

340 345

<210> 3

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<230>

<400> 3

Gly Gly Gly Ser Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu

1 5 10 15

Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr

20 25 30

Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys

35 40 45

Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ala Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu

50 55 60

Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys

65 70 75 80

Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu

85 90 95

Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly

100 105 110

Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys

115 120 125

Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg

130 135 140

Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly

145 150 155 160

Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln

165 170 175

Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Leu Glu His His His His His His

180 185 190

<210> 4

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<230>

<400> 4

Gly Gly Gly Ser Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu

1 5 10 15

Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr

20 25 30

Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys

35 40 45

Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Val Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu

50 55 60

Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys

65 70 75 80

Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu

85 90 95

Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly

100 105 110

Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys

115 120 125

Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg

130 135 140

Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly

145 150 155 160

Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln

165 170 175

Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Leu Glu His His His His His His

180 185 190

<210> 5

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<230>

<400> 5

Gly Gly Gly Ser Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu

1 5 10 15

Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr

20 25 30

Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys

35 40 45

Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Gly Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu

50 55 60

Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys

65 70 75 80

Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu

85 90 95

Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly

100 105 110

Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys

115 120 125

Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg

130 135 140

Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly

145 150 155 160

Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln

165 170 175

Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Leu Glu His His His His His His

180 185 190

<210> 6

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<230>

<400> 6

Gly Gly Gly Ser Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu

1 5 10 15

Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr

20 25 30

Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys

35 40 45

Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Leu Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu

50 55 60

Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys

65 70 75 80

Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu

85 90 95

Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly

100 105 110

Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys

115 120 125

Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg

130 135 140

Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly

145 150 155 160

Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln

165 170 175

Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Leu Glu His His His His His His

180 185 190

<210> 7

<211> 1019

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (3)..(1019)

<230>

<400> 7