技术领域
本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种与对虾对WSSV 抗性相关的分子标记及其应用。
背景技术
由对虾白斑综合症病毒(WSSV)引起的对虾白斑综合症是危害 我国对虾产业的最为严重的病害之一，该病毒致死率高、感染范围广、 传播速率快，每年因该病毒的暴发和流行给对虾产业造成的损失巨 大。为了解决该问题，科研人员从病毒本身的特征、病毒入侵机制、 机体的免疫防御体系、环境对病毒爆发的影响等多个方面进行了系统 研究，以解析病毒暴发的过程和机制，为病害防控提供有效的技术指 导。同时，遗传育种工作者也试图从遗传选育入手，培育抗WSSV 的新品种。
由于对虾WSSV致死率高，因而很难通过攻毒进行性状测试后 存活的虾进行留种繁殖下一代，只能通过全同胞或和半同胞的抗性能 力来进行选择，这样带来的问题是选择效率低，成本高，且对虾对 WSSV抗性的遗传力很低，难以通过传统的遗传选育来培育WSSV 抗性品种。通过筛选与抗WSSV性状相关的分子标记，利用该分子 标记指导选留抗性个体，能够辅助并加快抗性遗传选育的进程，为抗 性品种的培育提供有效的技术手段。
Toll通路是对虾体液免疫的重要信号通路，在对虾的抗菌或抗病 毒免疫中起着重要作用。TRAF6基因是Toll信号通路中一个重要因 子，在WSSV感染时其表达明显上调，提示其可能通过调节抗菌肽 (AMPs)基因的表达参与抗病毒免疫反应(WangP.H.,WanD.H.,Gu Z.H.,etal.Litopenaeusvannameitumornecrosisfactor receptor-associatedfactor6(TRAF6)respondstoVibrioalginolyticus andwhitespotsyndromevirus(WSSV)infectionandactivates antimicrobialpeptidegenes.DevCompImmunol,2011，35(1): 105-114)。
发明内容
本发明的目的是在对虾免疫相关基因TRAF6中与对虾对WSSV抗性 相关的分子标记及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记，与对虾的抗WSSV 性状显著相关的分子标记为位于TRAF6基因的DNA序列 SEQIDTRAF6g的139bp位置，为A>G型突变。
所述分子标记AA基因型在抗性组中的基因频率高于易感组 (P<0.05)，提示AA基因型为抗性优势基因型。
一种用于检测与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的引物对， 引物对为：
LvTF6F:TGTCTTCGAACAAATATCACATG和LvTF6R： GGGTTGAAGTATTTTTGCAAGGG。
一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的应用：所述对虾对 WSSV抗性相关的分子标记在遗传多样性分析筛选、分子标记辅助育 种中的应用。
一种辅助抗WSSV品种的选育方法：
1)提取待分析材料的基因组的DNA；
2)以待检测分析材料的基因组的DNA为模板，以及权利要求3 所述的引物对进行扩增，根据扩增产物获得SNP位点进行分型，获 得分型信息；
3)将上述获得的分型信息中选择A/A基因型个体进行留种和建 立家系育种。
本发明所具有的优点：本方法筛选获得的抗WSSV相关的分子 标记能够从分子水平上对抗性个体进行选择，可以解决传统选育对于 一些难以从表型进行度量的性状进行选择的困难。本发明建立的抗性 分子标记辅助抗性遗传选育的方法，操作简单，时间短，为筛选抗性 品种提供了一条有效的途径。
具体实施方式
实施例1：对虾TRAF6基因中与抗性相关SNP分子标记的获得 1.易感和抗性材料的筛选
选取500尾健康凡纳滨对虾置于12个50L的水族箱中，实验前 随机取10尾对虾检测无WSSV感染，实验水温为(23±1)℃。经饥饿 处理后，投喂WSSV感染致死的病虾(WSSV病毒含量为104-106copy/ngDNA)。攻毒后每天检查3次(每次间隔6h)并收集死虾，随机 取样提取基因组DNA，最早死亡的48尾对虾作为WSSV易感组。 至攻毒后第14天，凡纳滨对虾存活情况稳定，取存活的48尾对虾作 为WSSV抗性组。
2.基因组DNA提取
凡纳滨对虾DNA的提取按照TIANGEN植物基因组DNA提取 试剂盒说明进行。分别提取上述抗性组和易感组的个体DNA，将提 取获得的DNA使用NanoDrop1000检测DNA浓度和纯度，将经检 测DNA浓度>50ng/μl和纯度OD260/280为1.7-1.9的个体DNA再经1％ 的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测DNA片段完整性的个体，即为合 格的DNA样品，在-20℃保存待用。
3.TRAF6基因SNP发掘和基因组DNA序列的获得
TRAF6基因SNP的发掘参考Yuetal(YuY.,WeiJ.,ZhangX.,Liu J,,LiuC.,LiF.,XiangJ..SNPDiscoveryintheTranscriptomeofWhite PacificShrimpLitopenaeusvannameibyNextGenerationSequencing, PLOSONE,2014,9(1):e87218)文章中所述，通过转录组测序数据挖 掘出TRAF6基因中的SNP位点，SNP位点周边的DNA序列利用凡 纳滨对虾基因组组装数据获得。
4.TRAF6基因SNP分型
使用SNaPshot多重SNP分型技术平台对TRAF6基因的SNP在 抗性组和易感组材料中进行SNP分型，获得每个个体在每个SNP位 点的的基因型。
5.抗性相关SNP位点的获得
通过SPSS16.0中的非参数检验方法(卡方检验，χ2)对易感组 和抗性组中各个SNP位点的基因频率、基因型频率及单倍型分布进 行差异检验，设置限制性的阈值P＝0.05，结果显示TRAF6基因组序 列中SEQIDTRAF6-g的139bp处的SNP位点与抗WSSV性状呈显著 相关，该标记AA基因型在抗性组中的基因频率高于易感组(P<0.05)， 提示AA基因型为抗性优势基因型，有可能作为抗病对虾筛选的标 记。
其中，SEQIDTRAF6-g基因序列如下：
SEQIDTRAF6g：
TGTCTTCGAACAAATATCACATGGAAATCTGAACAGTATTTTTTG ACTCTATTTATTCATGGAATGCAAAGTGAGAATGATGACTTTCTT GACTGGCCCTTTAGTGGACGCATAACACTTTCTGTACTAGACTG TGAT[G/A]TATCATTACCTAAAAACCATATCACAGAGACCATGGT GACAAAACCAGGTCTGCAGGCATTCAAGCGTCCTGATGTTGCT CGTAATCCAAAAGGATTTGGATTCACAGAATTTGTACCCCTTGC AAAAATACTTCAACCC
(a)序列特征
*长度：279碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：凡纳滨对虾
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明精神的基础上 所做的一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。