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1、(10)授权公告号 CN 101671738 B (45)授权公告日 2012.02.15 CN 101671738 B *CN101671738B* (21)申请号 200910193090.X (22)申请日 2009.10.16 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) G01N 27/447(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 广东省农业科学院植物保护研究 所 地址 510640 广东省广州市天河区金颖路 7 号 专利权人 广东大丰植保科技有限公司 (72)发明人 何自福 佘小漫 虞皓 罗方芳 (74)专利代理机构。
2、 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 (54) 发明名称 一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种快速检测鉴定茄科青枯菌 侵染引起的青枯病的方法。该方法由植物病样制 备、 肉眼观察和 PCR 验证三个阶段组成， 可在 4 小 时内完成检测与鉴定， 而且检测鉴定成本低。 该方 法突破了传统的植物细菌病害鉴定周期长、 专业 性强和成本较高等局限性， 也克服了从国外进口 的微生物鉴定系统需要专用仪器设备和耗材、 成 本高和鉴定周期较长的不足， 将病样品的特殊表 症与分子生物技术有机地结合起来， 结果准确可 靠， 从而达到实际生产中对。
3、植物病害鉴定快速、 准 确的要求。 (51)Int.Cl. 审查员 温庭江 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页 CN 101671738 B1/1 页 2 1. 一种快速检测鉴定茄科青枯菌 (Ralstonia solanacearum) 侵染引起的青枯病的方 法， 包括以下操作步骤 ： (1) 检测病样品的准备 ： 用水冲洗干净待检病样品的茎基部和根部， 从茎基部取一小 块大小为 1.5 2mm2.5 3mm 的维管束组织 ； (2) 肉眼观察病样组织在载玻片水滴中表型 ： 吸取 80 100L 的灭菌水， 滴在干净的 载。
4、玻片上， 将步骤 (1) 中维管束组织放入载玻片的水滴中， 并压入水滴中， 静置， 观察有无 雾状菌浓从病样组织中喷出 ； 如有， 继续下一步试验， 如无， 说明该病样品不是由茄科青枯 菌侵染引起的 ； (3)PCR 进一步检测验证 ： 取步骤 (2) 的水滴里病样组织喷出的雾状菌浓作为模板， 进 行PCR反应 ； 所述上游引物为5-atgattctgcggcctacgcggcat-3， 所述下游引物为5- agtcgggtctggcgtcgaccatcaa-3 ； (4)结果鉴别 ： 将步骤(3)所得的反应产物在琼脂糖凝胶上电泳 ； 在凝胶成像系统中观 察， 如有 517bp 大小的特异性条。
5、带， 即确认病样品是由茄科青枯菌侵染引起的， 如无该特异 条带， 则该病样品不是茄科青枯菌侵染引起的。 2. 根据权利要求 1 所述的一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法， 其 特征在于， 步骤 (3) 中所述 PCR 反应是从步骤 (2) 的水滴里的病样组织喷出的雾状菌浓中 吸取 1L 作为模板， 加入到 PCR 管中， 再分别加入 1 单位 Taq 酶、 200mol/L 脱氧核糖核 苷酸、 上游引物及下游引物各 0.5mol/L、 1 倍 PCR 反应缓冲液， 用双蒸水补足至总体积为 25L， 于 PCR 仪中进行 PCR 反应。 3. 根据权利要求 1 所述的一种快速检测鉴。
6、定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法， 其 特征在于， 步骤 (3) 所述 PCR 反应条件为 94预变性 4min， 94变性 1min、 52退火 45s、 72延伸 50s， 30 个循环， 最终延伸 10min。 4. 根据权利要求 1 所述的一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法， 其 特征在于， 步骤 (4) 中反应产物是在质量体积百分比为 0.8 1.5的琼脂糖凝胶上电泳， 50 75V 恒压电泳 50 70min。 5. 根据权利要求 1 所述的一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法， 其 特征在于， 所述待检病样品为茄科青枯菌侵染引起的茄子、 番茄、 花生、。
7、 马铃薯、 辣椒、 烟草、 空心菜、 沙姜、 菊花或桑树的病样组织。 权 利 要 求 书 CN 101671738 B1/6 页 3 一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法 技术领域 0001 本 发 明 属 于 植 物 病 害 鉴 定 技 术 领 域，特 别 涉 及 茄 科 青 枯 菌 (Ralstoniasolanacearum) 侵染引起的青枯病的快速检测鉴定方法。 背景技术 0002 对于茄科青枯菌侵染引起的青枯病检测鉴定， 现有技术有三种 ： 传统的植物病原 细菌分离鉴定方法、 BIOLOG 微生物鉴定系统和梅里埃微生物鉴定方法。 0003 传统的植物细菌性青枯病鉴定方法，。
8、 主要包括从病样中分离病原菌、 获得分离菌 株的纯培养、 菌落与菌体形态特征观察、 生理生化特性测定和致病性测定等步骤， 该鉴定过 程至少需要 1 个月以上， 工作量大， 鉴定时间长， 而且专业性强。 0004 至于目前市面上销售的国外进口的微生物鉴定系统， 代表性的有美国 BIOLOG 公 司和法国梅里埃公司开发的微生物鉴定系统。 前者是以检测微生物细胞利用不同碳源进行 新陈代谢过程中产生的酶与四唑类物质发生颜色反应和浊度差异为基础， 建立起指纹图谱 与微生物种类相反应的数据库， 通过智能软件将待鉴定微生物的图谱与数据库参比， 得出 鉴定结果。后者是根据不同微生物的理化性质不同， 采用光电比。
9、色法， 测定微生物分解底 物导致 pH 改变而产生的不同颜色， 来判断反应的结果， 与种数据库标准菌的生物模型相比 较， 得到相似系统鉴定值。上述这二种鉴定系统的鉴定过程均需要 18 小时以上， 还需要购 买昂贵的进口专用鉴定材料和仪器设备， 而且该系统主要适用于人、 动物及环境微生物鉴 定， 少见用于植物病原微生物的鉴定， 目前文献也未见有用于茄科青枯病鉴定的报道。 发明内容 0005 为了解决上述现有技术的不足之处， 本发明的目的在于提供一种操作简便、 快速 准确、 成本低廉的茄科青枯病鉴定方法。本发明将病样特殊表症与聚合酶链式反应 (PCR) 技术有机地结合起来， 以茄科青枯菌特有的Fl。
10、iC基因(装配茄科青枯菌鞭毛的主要基因之 一， FliC基因在茄科青枯菌鞭毛装配中的位置及作用如图1所示)序列设计特异性引物， 建 立茄科青枯菌 PCR 反应体系， 结合受茄科青枯菌侵染的植物病组织在水介质中所表现的喷 雾特征进行鉴别， 结果可靠， 可应用到实际生产中， 对植物病害进行准确有效的快速检测。 0006 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的 青枯病的方法， 包括以下操作步骤 ： 0007 (1) 检测病样品的准备 ： 用水冲洗干净待检病样品的茎基部和根部， 从茎基部取 一小块大小为 1.5-2mm2.5-3mm 的维管束组织 ； 0008 (2。
11、) 肉眼观察病样组织在载玻片水滴中表型 ： 吸取 80 100L 的灭菌水， 滴在 干净的载玻片上， 将步骤 (1) 中维管束组织放入载玻片的水滴中， 并稍用力压入水滴中， 静 置， 观察有无雾状菌浓从病样组织中喷出 ； 如有， 继续下一步试验， 如无， 说明该病样品不是 由茄科青枯菌侵染引起的 ； 0009 (3)PCR 进一步检测验证 ： 从上述水滴里的病样组织喷出的雾状菌浓作为模板， 进 说 明 书 CN 101671738 B2/6 页 4 行PCR反应 ； 所述上游引物为5-atgattctgcggcctacgcggcat-3， 所述下游引物为5- agtcgggtctggcgtcg。
12、accatcaa-3 ； 0010 (4)结果鉴别 ： 将步骤(3)所得的反应产物在琼脂糖凝胶上电泳 ； 在凝胶成像系统 中观察， 如有 517bp 大小的特异性条带， 即确认病样品是由茄科青枯菌侵染引起的， 如无该 特异条带， 则该病样品不是茄科青枯菌侵染引起的。 0011 步骤 (2) 中所述茄科青枯菌侵染引起的病样品维管束组织在水中肉眼可见 “喷 雾” 现象。 0012 步骤(3)中所述PCR反应是从上述水滴里的病样组织喷出的雾状菌浓中吸取1L 作为模板， 加入到 PCR 管中， 再分别加入 1 单位 (U)Taq 酶、 200mol/L 脱氧核糖核苷酸 (dNTP)、 上游引物及下游引。
13、物各 0.5mol/L、 1 倍 PCR 反应缓冲液， 用双蒸水补足至总体积 为 25L， 于 PCR 仪中进行 PCR 反应。 0013 步骤 (3) 所述 PCR 反应条件为 94预变性 4min， 94变性 1min、 52退火 45s、 72延伸 50s， 30 个循环， 最终延伸 10min。 0014 步骤(4)中反应产物是在质量体积百分比为(w/v)0.81.5的琼脂糖凝胶上电 泳， 50 75V 恒压电泳 50 70min。 0015 所述待检病样品为茄科青枯菌侵染引起的茄子、 番茄、 花生、 马铃薯、 辣椒、 烟草、 空心菜、 沙姜、 菊花或桑树等病样组织。 0016 本发明。
14、相对于现有技术， 具有如下的优点及有益效果 ： 0017 (1) 快速简便 ： 本发明的方法鉴定周期为 4 小时内， 而且非专业人员均可操作， 鉴 定方法适应性强 ； 而无论是传统的植物病原细菌鉴定方法还是 BIOLOG 或梅里埃的微生物 鉴定系统， 鉴定周期均较长， 前者需要 1 个月以上， 而后者至少也需要 18 个小时以上。 0018 (2) 准确 ： 本发明根据被茄科青枯菌侵染的病组织特征性反应和茄科青枯菌特异 的 PCR 检测方法相结合， 获得的鉴定结果更准确可靠 ； 而微生物鉴定系统所依据的是生化 反应及颜色差异， 有时因操作差异和检测板不同等原因， 导致获得的数据中部分与标准库 。
15、不一致， 难以定论。 0019 (3) 低成本 ： 本发明创造所使用的材料均较低廉， 载玻片不仅价格低， 而且还可反 复使用 ； 所用的 PCR 仪目前在国内已很普及， PCR 所用的酶、 底物及琼脂糖等试剂和药品均 是开放式， 鉴定一个样品的成本在 9.5 元以内 ； BIOLOG 或梅里埃微生物鉴定系统， 不仅需要 专门仪器设备并由专门鉴定机构完成， 而且还需要购买该公司专用鉴定耗材， 目前专业鉴 定机构鉴定一个样品的收费标准是 800 元， 而传统的鉴定方法也因为要进行复杂的生理生 化特性测定以及致病性测定等操作， 其成本也要 154 元左右。 附图说明 0020 图 1 为茄科青枯菌鞭。
16、毛装配的各基因简图。 0021 其中 FliC 基因标识为红色。该简图来源于日本京都大学 KanehisaLaboratories KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(http:/www.genome.jp/kegg-bin/ showpathway+rso02040)。 0022 图 2 为检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的工艺流程图。 0023 图 3 为实施例 1 的病样组织在水滴中喷雾现象图。 说 明 书 CN 101671738 B3/6 页 5 0024 其中， 3A 为已知茄子青枯病样组织样品 ； 3B 为对照健康茄子组织。
17、样品。 0025 图 4 为实施例 1 的 PCR 产物电泳检测图。 0026 其中， 1. 标准分子量 (100bp 梯度 ) ； 2-9. 不同病样组织 ； 10. 阴性对照。 0027 图 5 为实施例 2 的病样组织在水滴中喷雾现象图。 0028 其中， 5A 为 2 号病样品 ； 5B 为 12 号病样品。 0029 图 6 为实施例 2 的 PCR 产物电泳检测图。 0030 其中， 1. 标准分子量 (100bp 梯度 ) ； 2-18. 不同的待检样品。 具体实施方式 0031 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0032 实施例 。
18、1 ： 对已知病样品的检测鉴定 0033 一、 实验材料 ： 应用已知茄科青枯菌侵染引起的茄子和番茄病样组织以及已知健 康的茄子组织为材料。 0034 二、 实验方法 ： 0035 (1) 用水冲洗干净待检病样品的茎基部和根部， 从待检病样品的茎基部取大小约 为 1.5 2mm2.5 3mm 的维管束组织， 8 份待检样品中包括 4 份茄子病样品和 4 份番茄 病样品， 另取一份健康茄子样品作对照 ； 0036 (2) 用无菌的移液器吸取 100L 的灭菌水， 滴在干净的载玻片上， 用灭菌的镊子 将病组织放入干净的载玻片上 100L 大小的灭菌水滴中， 注意稍用力将病组织压入水滴 中， 静置 。
19、5 分钟左右 ； 观察有无雾状菌浓从病样组织中喷出， 如有继续下一步试验 ； 如无， 说 明该病样品不是由茄科青枯菌侵染引起的 ； 0037 (3) 从病样组织喷出的雾状菌浓中取 1L 液体于 PCR 管中， 配制聚合酶链式反应 (PCR)混合物， 包括1单位Taq酶、 4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)200mol/L、 上游引物和下游 引物各 0.5mol/L、 2.5L 10 倍反应缓冲液及双蒸水至 25L ； 将 PCR 管放入 PCR 仪中， 于PCR仪中进行PCR反应。 设置反应参数 ： 94预变性4min， 94变性1min、 52退火45s、 72延伸 50s， 30 个循环， 最。
20、终延伸 10min ； 0038 (4) 取反应产物在质量体积百分比为 (w/v)1琼脂糖凝胶上电泳， 70V 恒压电泳 60min ； 在凝胶成像系统中观察， 并拍照 ； 根据电泳结果做出判定。 0039 检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的工艺流程图见图 2。 0040 三、 实验结果与分析 ： 0041 如图3及图4所示， 应用本发明的方法， 茄科青枯菌引起的茄子和番茄病样茎基部 维管束组织在载玻片水滴中均出现喷雾现象 ( 图 3 仅显示其中一个茄子病样品的喷雾， 其 它病样品与其相同 )， 而且以雾状液为模板可成功扩增到预期大小为 517bp 的特异目的片 段 ( 见图 4)， 而作为。
21、对照的健康茄子样品并未出现以上喷雾现象及特异扩增条带， 说明该 检测方法是准确可靠的。 0042 实施例 2 ： 对未知病样品的检测鉴定试验 0043 一、 实验材料 ： 对采自多个地区田间的 10 种不同植物青枯病样品或无症状健康样 品进行检测。 说 明 书 CN 101671738 B4/6 页 6 0044 二、 实验方法 ： 0045 对来自广东多个地区采集到的 10 种不同植物样品进行取样， 共取得 17 个样品并 进行编号， 各号样品所对应的植物种类、 采集地点以及症状表现等信息如表 1 所示。检测鉴 定所采用的方法同实施例 1 所用方法相同， 并用传统的植物病原细菌分离鉴定方法加。
22、以比 较验证。 0046 传统的植物病原细菌分离鉴定方法具体步骤包括 ： 用 75酒精对待检病样组 织表面消毒 ； 用灭菌的解剖刀切取病样维管束组织并进行稀释分离 ； 在含 TTC 琼脂平 板上划线及 28 30条件下培养 48 36 小时 ； 纯化单菌落获得菌株 ； 菌落与菌体形 态特征观察 ； 菌株生理生化特性测定， 即测定对乳糖、 麦芽糖、 D(+)- 纤维二糖、 葡萄糖和 蔗糖、 甘露醇、 山梨醇、 卫茅醇等碳水化合物的利用和分解 ； 菌株 16S rDNA 基因克隆与序 列分析 ； 在温室中 (25 35 ) 进行人工接种试验， 测定分离菌株对原寄主植物的致病 性 ； 接种植株症状观。
23、察 ； 从显症病株中再分离到与接种菌株相同的病原菌。 0047 三、 实验步骤 ： 0048 (1) 用水冲洗干净待检病样品的茎基部和根部， 从待检样品的茎基部取大小约为 1.52mm2.53mm的维管束组织， 从不同的待检样品(茄子、 番茄、 马铃薯、 花生、 辣椒、 烟草、 空心菜、 沙姜、 菊花、 桑树 ) 中共取 17 份样品组织 ； 0049 (2) 用无菌的移液器吸取约 100L 的灭菌水， 滴在干净的载玻片上， 用灭菌的镊 子将组织放入干净的载玻片约 100L 灭菌水滴中， 注意稍用力将病样组织压入水滴中， 静 置 5 分钟左右 ； 观察有无雾状菌浓从病组织中喷出， 如有继续下一。
24、步试验 ； 如无， 说明该病 样品不是由茄科青枯菌侵染引起 ； 0050 (3)从雾状菌浓中取1L液体于PCR管中， 配制聚合酶链式反应(PCR)混合物， 包 括1单位Taq酶、 4种脱氧核糖核苷酸dNTP 200mol/L、 上游引物和下游引物各0.5mol/ L、 2.5L 10倍反应缓冲液及双蒸水至25L ； 将PCR管放入PCR仪中， 于PCR仪中进行PCR 反应。设置反应参数 ： 94预变性 4min， 94变性 1min、 52退火 45s、 72延伸 50s， 30 个 循环， 最终延伸 10min ； 0051 (4) 取反应产物在 1琼脂糖凝胶上电泳， 70V 电泳 60 分。
25、钟 ； 在凝胶成像系统中观 察， 并拍照 ； 根据电泳结果做出判定。 0052 四、 实验结果与分析 ： 0053 如图 5、 图 6 及表 1 结果显示 ： 待检的 17 个样品中 2、 3、 4、 5、 7、 9、 10、 12、 13、 14、 16、 17 和 18 号样品均为阳性， 即病样中含有茄科青枯菌， 是由茄科青枯菌侵染引起的， 与其症 状表现相符合 ； 6、 8、 11 和 15 号样品为阴性， 即样品中不含茄科青枯菌， 不是由茄科青枯菌 侵染引起不正常或是健康植株， 与其表征也相一致， 而且本发明方法检测结果与传统植物 病原细菌分离鉴定的结果完全一致， 从而进一步验证了该检。
26、测鉴定方法的可靠性。 0054 表 1 应用本发明方法及传统方法检测鉴定不同来源待检样品的结果比较 0055 样品编号 寄主植物 症状表现 采集地 本发明方法 传统方法 2 茄子 萎蔫 东莞 + + 说 明 书 CN 101671738 B5/6 页 7 3 茄子 萎蔫枯死 连州 + + 4 番茄 萎蔫 佛山 + + 5 番茄 轻微萎蔫 广州 + + 6* 番茄 健康无病症 广州 - - 7 马铃薯 萎蔫 惠州 + + 8* 马铃薯 健康无病症 惠州 - - 9 花生 萎蔫 广州 + + 10 辣椒 萎蔫 高要 + + 11* 辣椒 健康无病症 广州 - - 12 烟草 黄化、 萎蔫 南雄 +。
27、 + 13 烟草 1-2 片叶黄化 南雄 + + 14 空心菜 萎蔫 广州 + + 15* 沙姜 健康无病症 阳春 - - 16 沙姜 萎蔫枯死 阳春 + + 17 菊花 萎蔫 广州 + + 18 桑树 萎蔫枯死 阳春 + + 0056 注 ： + 表示为阳性， - 表示为阴性 0057 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 0058 SEQUENCE LISTING 0059 广东省农业科学院植物保护研究所 。
28、0060 一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病方法 0061 66 0062 2 0063 PatentIn version 3.2 0064 1 0065 24 0066 DNA 说 明 书 CN 101671738 B6/6 页 8 0067 artificial sequence 0068 0069 上游引物 0070 1 0071 atgattctgc ggcctacgcg gcat 24 0072 2 0073 25 0074 DNA 0075 artificial sequence 0076 0077 下游引物 0078 2 0079 agtcgggtct ggcgtcgacc atcaa 25 说 明 书 CN 101671738 B1/4 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 101671738 B2/4 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 101671738 B3/4 页 11 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101671738 B4/4 页 12 图 6 说 明 书 附 图 。