技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种促进间充质干细胞分化为神经元的方法。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的中枢系统疾患，其最严重的后果，是导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，其造成的截瘫会使患者失去自理能力，这不仅给患者带来了严重的身体和心理伤害，也给家庭造成沉重的负担。
目前在脊髓损伤病人的治疗中，通常借助于一些药物的使用以及与物理治疗相结合来减缓瘫痪的程度。但是，经过这样的治疗，患者的生活质量还是无法得到很好的提升。
如何使得脊髓损伤后中枢神经的修复和功能重建，现在仍然是一个难题。虽然神经生长因子的发现给中枢神经损伤的临床药物治疗带来了希望，也达到了一定的效果，但是，神经营养物质分子量太大，无法穿透血脑屏障进入中枢神经组织以发挥其活性。
在脊髓损伤中，移植可能是进行中枢神经系统修复的一种可操作方法。但是，要实现细胞的移植治疗，首先需要对细胞分化成神经元的能力进行研究和评估，并开发促进细胞分化的方法。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种促进干细胞分化成神经元的方法。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种促进间充质干细胞分化成神经元的方法。
在本发明的一个较佳实施方式中，该方法，包括以下步骤：
1)制备人间充质干细胞并传代培养；
2)使传代培养后的所述人间充质干细胞在分化培养基中分化成人间充质干细胞-神经球；
3)使所述人间充质干细胞-神经球在诱导培养基中分化成神经元。
优选地，步骤3)具体为将步骤2)中的人间充质干细胞-神经球打碎，接种到多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白双包被的含有所述诱导培养基的培养容器中，于37℃，5％CO2培养分化7-10天。
进一步地，诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素以及10ng/mL重组人BDNF的NB培养基。
在另一个优选的实施方式中，步骤3)具体为将步骤2)中的人间充质干细胞-神经球打碎，接种到多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白双包被的培养容器中，先使用含有BDNF的第一诱导培养基进行诱导分化5-6天，然后使用含有TGF-β1的第二诱导培养基进行诱导分化4-5天，细胞于37℃，5％CO2培养。
进一步地，再添加含有TGF-β1的第二诱导培养基后，先将细胞在40℃，5％CO2中培养3-4小时，然后再转移到37℃，5％CO2继续培养分化4-5天。
进一步地，第一诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素以及10ng/mL重组人BDNF的NB培养基；第二诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素以及1-5ng/L TGF-β1的NB培养基。
进一步地，步骤1)具体为对脐带进行酒精消毒，于平衡盐溶液中清除血管，将华通氏胶中的间充质组织切割成0.4-0.6cm3大小，离心获取间充质组织部分，使用无血清DMEM/F12培养基洗涤；洗涤离心后获得的沉淀部分进行酶消化；对酶消化后的悬浮液进行细胞计数，然后进行接种培养，即获得人间充质干细胞；当细胞生长至70％-80％融合率时进行传代。
优选地，步骤2)采用步骤1)第四代至第六代的人间充质干细胞进行。
进一步地，步骤2)包括：酶法分离步骤1)中培养的人间充质干细胞，并接入含有分化培养基的组织培养低粘附性塑料烧瓶中进行培养；其中，分化培养基为含有20ng/ml表皮生长因子、20ng/mL碱性成细胞生长因子和1:50稀释的B27的NB培养基；细胞在37℃，5％CO2下培养，每3-4天添加新鲜的表皮生长因、碱性成细胞生长因子和B27，一周更换一次分化培养基。
本发明的另一个方面还提供了一种利用上述促进间充质干细胞分化成神经元的方法在研究脊髓损伤后的神经修复中的应用。
使用本发明中的方法，能有效提高间充质干细胞分化为神经元的比例。使用含有BDNF的诱导培养基进行诱导分化后的细胞中，表达成熟神经标记物(MAP2ab)和不成熟神经标记物(β-微管蛋白III)的细胞比例与空白对照组相比，有了显著的提高，能分别达到8±1.9％和38.6±2.9％。而使用含有BDNF的第一诱导培养基和含有TGF-β1的第二诱导培养基进行诱导分化后的细胞中，表达成熟神经标记物(MAP2ab)和不成熟神经标记物(β-微管蛋白III)的细胞比例与空白对照组相比，也显著提高，并且，相对于只使用含有BDNF的诱导培养基进行诱导分化后，两种阳性细胞比例也有进一步提高。本发明的方法为促进脊髓损伤修复的新治疗方法提供了一定的方向。
以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞的初代培养中，出现两种细胞形态，图1a是长条形的，图1b是圆形的。
图2是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞第三代传代细胞培养至80％融合率时的细胞形态；
图3是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞重新接种到神经球分化培养基1-2天后的细胞开始聚集的形态。
图4是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞在转化后的3-4天出现许多漂浮细胞的球体。
图5是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞的第3代的CD44染色结果。
图6是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞衍生而来的神经球的nesting阳性标记图。
图7是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成β-微管蛋白III(不成熟神经标记物)阳性细胞的免疫荧光组织化学法结果图。
图8是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成GFAP(星形胶质细胞标记物)阳性细胞的免疫荧光组织化学法结果图。
图9是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成CalC(少突胶质细胞标记物)阳性细胞的免疫荧光组织化学法结果图。
图10是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成MAP2ab(成熟神经标记物)阳性细胞的免疫荧光组织化学法结果图。
图11是本发明的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成不同神经标记物阳性细胞的相关蛋白水平的蛋白质印记法检测结果图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本发明具体实施方式中使用的实验方法，若无特殊说明，均为本领域常规的方法。本发明具体实施方式中使用的试剂，若无特殊说明，均可通过购买获得。
人间充质干细胞同时具有胚胎干细胞和成体干细胞的许多优势，并且相对于其他的干细胞，其优势在于：可塑性强；容易通过低侵袭性的方式获得，并且能够快速增殖；免疫兼容，患者自己的人间充质干细胞能用于自体移植。因此，本发明使用人间充质干细胞为起始物进行分化研究。
在神经发生中，微环境因子对增殖和分化有十分重要的影响。其中，BDNF广泛地分布在发育和成熟的神经系统中，并在神经细胞的发育、存活和修复中起到十分重要的作用。
本研究通过不同的营养因子与不同的条件的结合，观察人间充质干细胞分化成神经元的效果。
实施例1人间充质干细胞的制备
获取新生儿脐带，放置于汉克斯平衡盐溶液(HBSS，Gibco，USA)中，4℃保存。脐带用75％的酒精消毒30秒。在HBSS中，将脐带血管清除。存在于华通氏胶中的间充质组织被切割成大约0.5cm3，并在1,200rpm下离心5分钟。离心后去除上清液，间充质组织的沉淀部分用无血清DMEM/F12培养基(Gibco，USA)洗涤，之后在1,200rpm下离心5分钟。沉淀部分使用0.075％II型胶原酶(Sigma)在37℃下酶法分离18小时，然后进一步使用0.125％胰蛋白酶/EDTA(Gibco)在37℃下消化30分钟。悬浮液使用含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12进行中和，在显微镜下对悬浮液中的细胞进行计数。调整至5-7×103个/cm2接种至组织培养瓶中，在37℃、5％CO2下进行培养，并保持在亚汇合状态。当细胞生长至70％融合率时，以1：3的比例进行传代培养。使用第四代至第六代的细胞进行后续研究。
如图1a和1b所示，人间充质干细胞的初代培养中，出现两种细胞形态，一种是长条形的，一种是圆形的。经过三至五代的传代，人间充质干细胞呈现单层的扁平细胞形态，并且所有细胞的形态趋于相似。图2示出了第三代传代细胞培养至80％融合率时的细胞形态。
实施例2人间充质干细胞形成人间充质干细胞-神经球
用0.125％胰蛋白酶/0.02％EDTA分离第四代的人间充质干细胞，分离后的人间充质干细胞以2×105个/cm2的密度接入组织培养低粘附性塑料烧瓶中，烧瓶中含有分化培养基。分化培养基为含有20ng/ml表皮生长因子(EGF)、20ng/mL碱性成细胞生长因子(bFGF)和1:50稀释的B27(Gibco)的NB培养基(Invitrogen)。
细胞在37℃，5％CO2下培养。每3-4天添加新鲜的生长因子，一周更换一次培养基。起始分化后的4-5天可以观察到球形形成。在传代前，细胞一直在分化培养基中培养。
图3示出了人间充质干细胞重新接种到神经球分化培养基1-2天后的细胞形态，细胞开始聚集，形成人间充质干细胞-神经球。许多漂浮细胞的球体在转化后的3-4天(即重新接种后的7天左右)出现，如图4所示。
每10-12天用酶法进行传代，即使用0.025％胰蛋白酶加0.6％葡萄糖进行酶法传代。在神经元终末分化前，这些神经球样结构继续扩大4-6个星期(大约3-4代)。
几乎所有第3代的人间充质干细胞都显示出很强的CD44染色(图5)。从人间充质干细胞衍生而来的神经球通过nestin抗体进行确认(图6)。
实施例3人间充质干细胞-神经球的进一步分化(BDNF诱导)
收集实施例2中培养的将人间充质干细胞-神经球，并将其打碎，重新接种到多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白双包被的含有诱导培养基的六孔腔室载玻片(chamber slides，NUNC)中。细胞于37℃，5％CO2培养分化7-10天。
其中，诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸(Sigma)、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素(都购自Gibco)以及10ng/mL重组人BDNF(rhBDNF，R&D Systems)的NB培养基。
对照组中，实验条件与前述相同，只是诱导培养基替换为不含BDNF的对照诱导培养基，即添加有0.5umol/L全反式维甲酸(Sigma)、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物和1％青霉素/链霉素(都购自Gibco)的NB培养基。
收集分化后的细胞进行分析：
人间充质干细胞会分化成β-微管蛋白III(不成熟神经标记物)、GFAP(星形胶质细胞标记物)、CalC(少突胶质细胞标记物)和MAP2ab(成熟神经标记物)阳性的细胞，采用免疫荧光组织化学法对不同的标记物的阳性细胞进行观察，结果如图7-10所示。通过Hoechst 33342+染色，对分化后的各种阳性的细胞进行定量，定量结果计算方法为：相应阳性细胞数量/Hoechst 33342+染色细胞的数量×100％，结果如表1所示。
表1：阳性的细胞的定量百分比
诱导培养基 β-微管蛋白III GFAP CalC MAP2ab 对照 19.2±3.0％ 42.8±3.8％ 27±2％ 4.4±1.8％ BDNF诱导 38.6±2.9％ 15.8±4.5％ 20.6±4.6％ 8±1.9％
结果表明，使用神经特异性诱导方法产生的β-微管蛋白III阳性细胞和MAP2ab阳性细胞明显高于使用常规诱导方法。
蛋白质印记法进一步验证：
蛋白质印记法为本领域常规方法，本研究中用针对β-微管蛋白III(1:500)、MAP2ab(1:500)的一抗处理，然后与过氧化物酶连接的二抗处理。通过增强的化学发光方法进行显影。使用了β-激动蛋白(β-Actin)作为内参。抗体均来自Chemicon。
蛋白质印记法验证的结果如图11所示，其结果与免疫组化结果相符。
结果表明，在添加BDNF后，表达成熟神经标记物(MAP2ab)和不成熟神经标记物(β-微管蛋白III)的细胞比例与空白对照组相比，有了显著的提高，也就是说加入脑源性神经生长因子组显著提高了脐带源性神经干细胞转分化为神经元的比例。
实施例4人间充质干细胞-神经球的进一步分化(BDNF+TGF-β1联合诱导)
收集实施例2中培养的将人间充质干细胞-神经球，并将其磨碎，重新接种到多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白双包被的含有BDNF诱导培养基的六孔腔室载玻片(chamber slides，NUNC)中。细胞于37℃，5％CO2培养分化5-6天。之后，将BDNF诱导培养基替换为TGF-β1诱导培养基，先在40℃，5％CO2中培养3-4小时，然后再转移到37℃，5％CO2继续培养分化4-5天。
其中，BDNF诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸(Sigma)、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素(都购自Gibco)以及10ng/mL重组人BDNF(rhBDNF，R&D Systems)的NB培养基；
TGF-β1诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸(Sigma)、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素(都购自Gibco)以及1-5ng/L TGF-β1(Sigma)的NB培养基。
对照组中，实验条件与前述相同，只是BDNF诱导培养基和TGF-β1诱导培养基都替换为不含BDNF的对照诱导培养基，即添加有0.5umol/L全反式维甲酸(Sigma)、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物和1％青霉素/链霉素(都购自Gibco)的NB培养基。
收集分化后的细胞进行分析：
采用免疫荧光组织化学法对不同的标记物的阳性细胞进行观察，并通过Hoechst33342+染色，对分化后的各种阳性的细胞进行定量，定量结果计算方法为：相应阳性细胞数量/Hoechst 33342+染色细胞的数量×100％，结果如表2所示。
表2：阳性的细胞的定量百分比
结果表明，使用神经特异性诱导方法产生的β-微管蛋白III阳性细胞和MAP2ab阳性细胞明显高于使用常规诱导方法。并且，与实施例3中的单独BDNF诱导的方法，表达成熟神经标记物(MAP2ab)和不成熟神经标记物(β-微管蛋白III)的细胞比例也有了一定程度的提高。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。